הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות קשירה של חלבונים קושרי DNA כגון גורמי שעתוק או שינויים באבן. זה מושג על ידי הכנת הכרומטין תחילה כשלב שני. תגובת משקעים חיסוניים של כרומטין מוגדרת כדי למשוך למטה שברי DNA הקשורים לחלבון המבוקש.

לאחר מכן, מקטע ה-DNA הקשור לחלבון המעניין מוגבר על ידי PCR. מתקבלות תוצאות המראות העשרה מתקפלת של מקטע ה-DNA הקשור לחלבון מעניין בהשוואה לאזור לא קשור על סמך ניתוח QPCR. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי שעתוק, כרומטין ואפיגנטיקה, כגון מתי והיכן קיימים חלבונים שונים שעברו שינוי או לא שונה.

על ה- DNA למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות הגנים של תאי T. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון לימפוציטים מקבוצת B, דגימות לוקמיה וקווי תאים אימורטליים. הכרומטין לניסוי זה יוכן מתאי CD נאיביים של טחול עכבר.

כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 37% פורמלדהיד לריכוז סופי של 1% לתרחיף CD ארבעה תאי T ב-DMEM ונדנד בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. זה יצליב את קומפלקסי חלבון ה-DNA. עצור את הקישור על ידי הוספת גליצין מולרי אחד לריכוז סופי של 125 מילימולר.

המשיכו להתנדנד במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 200 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש תאים בחמישה מיליליטר PBS קר כקרח המכיל מעכבי פרוטאז צנטריפוגה שוב, שטוף תאים בדרך זו בסך הכל שלוש פעמים לאחר הכביסה הסופית, השליך את הסופרנטנט והשהה מחדש תאים במיליליטר אחד של מאגר ליזה של תאים קרים כקרח המכיל מעכבי פרוטאז.

העבירו את תרחיף התא לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.7 מיליליטר ודגרו על קרח למשך 15 דקות. אוספים את הגרעינים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 200 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגרעינים ב-500 מיקרוליטר של ליזה גרעינית.

בופר המכיל מעכבי פרוטאז דוגר על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, סוניקט את התאים באמצעות בדיקה של 1.6 מילימטר ורמת פלט של ארבע סוניקט למשך 15 שניות. מצננים את הדגימה על קרח למשך דקה עד שתיים כדי למנוע התחממות יתר וסוניקציה שוב למשך 15 שניות.

חזור על הסוניקציה והקירור בסך הכל ארבע פעמים צנטריפוגה, הכרומטין הקולי ב-16,000 גרם למשך חמש דקות. בארבע ארבע מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנטנט השקוף בצינור מיקרו צנטריפוגה חדש.

הסר 20 מיקרוליטר של סופרנטנט שקוף. הוסף צבע טעינת DNA ובדוק את ה-DNA הסוניקטיבי על ידי אלקטרופורזה באמצעות אגרו ג'ל 2%. הגודל האידיאלי של DNA סוניקטיבי עבור רוב היישומים הוא 200 עד 500 זוג בסיסים.

לבסוף, קבע את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. ניתן להשתמש בכרומטין גזוז באופן מיידי כדי להגדיר תגובת משקעים חיסונית של כרומטין או לאחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עבור משקעים חיסוניים של כרומטין או לדלל כרומטין סוניקטיבי לריכוז DNA של חמישה עד 10 מיקרוגרם למיליליטר בנפח כולל של שני מיליליטר במאגר דילול שבב עם מעכבי פרוטאז. כל השלבים בהליך זה חייבים להתבצע בטמפרטורה של אפס עד ארבע מעלות צלזיוס.

חסוך 10% שהם 200 מיקרוליטר בדוגמה זו של הכרומטין הסוניקטיבי המדולל כמאגר קלט על קרח של הדגימה הנותרת aliquot 450 מיקרוליטר לכל אחד מארבעה צינורות מיקרו-view של 1.7 מיליליטר המסומנים כבקרת איזוטיפ ונוגדנים מעניינים. אם נעשה שימוש במספר נוגדנים מאותו איזוטיפ, בקרת איזוטיפ אחת תספיק לביצוע ניתוח זה, הוסף שניים עד חמישה מיקרוגרם של נוגדן ספציפי בהתאם לספציפיות הנוגדן המשמש או בקרת איזוטיפ לצינורות המתאימים. נדנד את הצינורות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של נוגדנים כרומטין למחרת בבוקר.

מוסיפים 25 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של חלבון G לכל תערובת ומנענעים לפחות שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הנח את צינורות הפוגה על מעמד מגנטי למשך 15 עד 20 שניות כדי לאפשר לחרוזים להצטבר בצד הממוגנט. הסר בזהירות את התמיסה על ידי שאיפה מבלי להפריע לחרוזים.

הוסף מיליליטר אחד של תמיסת שטיפה דלת מלח ונדנד בעדינות במשך חמש דקות על המוטטור. אסוף את החרוזים באמצעות המעמד המגנטי והסר את תמיסת הכביסה. הוסף שוב מיליליטר אחד של תמיסת שטיפה דלת מלח ונדנד בעדינות במשך חמש דקות.

לאחר הסרת תמיסת הכביסה הנמוכה במלח, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת שטיפת מלח גבוהה וסנדנו למשך חמש דקות. אסוף את החרוזים באמצעות המעמד המגנטי והסר את תמיסת הכביסה. חזור על הכביסה עם תמיסת הכביסה הגבוהה במלח.

לאחר הסרת תמיסת הכביסה הגבוהה במלח, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת שטיפת ליתיום כלוריד, ונדנדו למשך חמש דקות. אסוף את החרוזים באמצעות המעמד המגנטי והסר את תמיסת הכביסה. חזור על שטיפת הליתיום כלוריד פעם אחת.

מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסת TE ומנענעים למשך חמש דקות. אסוף את החרוזים באמצעות המעמד המגנטי והסר את תמיסת הכביסה. יש לסלק את ה-DNA מהחרוזים על ידי הוספת 250 מיקרוליטר של סלע חיץ אלוציאני למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

הורידו את ה-EIT ושמרו את החומר הזה בצינור פוגה חדש של 1.7 מילימטר. חזור על הפעולה פעם נוספת ושלב את שני האלו, השליך את החרוזים כדי להפוך את הקישורים הצולבים. הוסף ל-DNA החמקמק חמישה נתרן כלורי מולארי לריכוז סופי של 0.3 מולארי ומיקרוליטר אחד של RNAs.

A הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר פליטה לכניסות שנשמרו קודם לכן. כדי להפוך את הנפח ל-500 מיקרוליטר לכל קלט, הוסף נתרן כלורי ל-0.3 מולארי מיקרוליטר אחד של RNAs, 10 מיקרוליטר של 0.5 מולארי EDTA 20 מיקרוליטר של טריס טוחנת אחת, HCL pH 6.5 ומיקרוליטר אחד של פרוטאינאז K.אטום את הצינורות ודגר אותם למשך הלילה ב-65 מעלות צלזיוס בבלוק חימום יבש למחרת בבוקר, תן לצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של 100% אתנול ודוגרים במשך שעתיים למשך הלילה במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי לזרז את צנטריפוגת ה-DNA, הצינורות ב-16,000 גרם למשך 15 דקות. כדי לשטוף את ה-DNA, גלולת ה-DNA פעם אחת עם 70% אתנול וייבוש באוויר, הגלולה מושעה מחדש, כדור ה-DNA ב-100 מיקרוליטר של מים מזוקקים חיטוי, מטהר DNA באמצעות קיאק, עמודות סיבוב מהירות ומסירה בנפח כולל של 50 מיקרוליטר מאגר פליטה. DNA זה מוכן כעת לשימוש להגברת PCR.

ניתוח עתודות ה-QPCR להשגת העשרה מלאה על פני אזור בקרה בלתי מוגבל הוא ההיבט החשוב ביותר של פרוטוקול זה. באמצעות תוכנת QPCR, עבור לעורך וסמן את הבארות המכילות דגימות קלט של דילולים שונים בערכי העקומה הסטנדרטיים שלהן. כמו כן, סמן את הבארות בדגימות שבב לא ידועות בדיוק כפי שמונחת לוחית ה-PCR.

השימוש בעקומה סטנדרטית לאינטרפולציה של כמויות DNA בדגימות ספציפיות ואיזוטיפיות לא ידועות מאפשר הערכה והתאמה של האיכות והיעילות של כל ערכות הפריימר על פני טווח הריכוזים שנמצאו בדגימות. עבור לעורך תת-הקבוצות וסמן את קבוצות המשנה, כולל הבארות עם דגימות קלט וכן דגימות השבבים הלא ידועות. הדגימות הלא ידועות יכומתו באמצעות העקומה הסטנדרטית שנוצרה מהריכוזים הידועים של דגימות קלט לניתוח.

לאחר השלמת הגברת ה-PCR, בצע את הניתוח עם כמויות ABS. נגזרת שנייה מקסימום. בחר את קבוצת המשנה לניתוח ולחץ עליה. בסדר.

לחץ על חישוב, אשר ייצור את העקומה הסטנדרטית באמצעות הריכוזים הידועים של דגימות קלט ויציג את הכמות המוחלטת של ה-DNA הקיימת בדגימות הלא ידועות אם איכות ה-DNA שלה טובה ואם הפריימרים נקשרים במיוחד לאזור היעד, יעילות ה-PCR צריכה להיות קרובה לשניים. בצע ניתוח עקומת התכה עם TM הקורא לאותה תת-קבוצה אם זמינה. שיא בודד מצביע על כך שרק מוצר ספציפי אחד הוגבר.

הגברה של DNA ספציפי יכולה להיבדק גם על ידי אלקטרו מוצר ה-PCR, יחד עם סולם ה-DNA באמצעות ג'ל AROS. הנתונים המתקבלים מיוצאים לאחר מכן כקובץ טקסט מופרד בכרטיסיות, אותו ניתן לפתוח ב-Microsoft Excel להמשך ניתוח. חלקו את כמות ה-DNA עבור הנוגדן הספציפי עם בקרת האיזוטיפ עבור פריימרים ממוקדים.

חזור על שלב זה עבור פריימרים של אזור הבקרה. אם משתמשים במספר נוגדנים מאותו איזוטיפ למשקעים חיסוניים שונים, מנרמל כל אחד מהם עם הערכים מאותה בקרת איזוטיפ. יתר על כן, אם משתמשים במספר זוגות פריימר ממוקדים, יש להשתמש בכמויות ה-DNA מערכת תיקון פריימר בקרה אחת לנורמליזציה של כל מטרה.

ערכי הפלט מייצגים את העשרת קיפול הנוגדנים הספציפיים בכל מיקום ביחס לנוגדנים לא ספציפיים אימונו-משקעים ברקע מחלקים את העשרת הקפל עבור פריימרים ממוקדים עם העשרת הקיפול עבור פריימרים באזור בקרה כדי להשיג העשרה ביחס לאזור בקרה. חשוב לציין, שבגלל יצירת עקומות סטנדרטיות עם DNA קלט כולל עבור כל דגימה, כל אחד מערכי המשקעים החיסוניים שעברו אינטרפולציה מהתקן כבר מנורמל ומבוטא כחלק מהקלט הכולל על ידי תוכנת המכונה. פרוטוקול הכרומטין המודגם כאן שולט בהבדלים, אם בכלל, בכמות ה-DNA המשמשת ב-PCR באמצעות שימוש בזוג פריימר המגביר אזור לא קשור של הגנום, ובכך משמש כבקרת טעינה.

בדוגמה זו, האזור המקודד של גן בטא אקטין של העכבר שימש כאזור שאינו קשור לחלבון המעניין ולגורם השעתוק ואתר קשירת השומן על העכבר, מקדם IL 2 שימש כאזור יעד. תמונה זו של גיליון אלקטרוני של Excel מתארת את השימוש בפרוטוקול החישוב המתואר בנתוני הניתוח משלוש חזרות ניסיוניות בתיבות בצבע צהוב, ירוק וסגול עם שלושה שכפולים טכניים. כל אחד מהם שימש לחישוב העשרה בקיפול.

ניתן להשוות העשרה יחסית של חלבון הקשור לאזורים שונים בגנום אם נבחרה אותה קבוצה של בקרת איזוטיפ ונוגדנים ספציפיים. אם הספציפיות של הנוגדן טובה, בדרך כלל נצפית העשרה של פי שניים עד עשרה על פני אזור הבקרה הלא קשור. איור זה מציג את התוצאות של ניסוי שבב עם תאי CD 4 T קונבנציונליים ותאי CD 4 T רגולטוריים שבודדו מעכברים.

חלק קטן מתאי T קונבנציונליים מגורה עם PMA ומיצין יונים במשך 30 דקות. העשרה יחסית של גורמי שעתוק NFA, N שומן C אחד ו-NFA C שניים במקדם IL 2 נצפתה ומתוארת כאן כהעשרה מתקפלת על פני אזור לא קשור בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון ChIP-seq על מנת לטפל בתפוסה העולמית של גורמי שעתוק או שינויים גלובליים בסימנים אפיגנטיים בתגובה לגירוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע משקעים חיסוניים של כרומטין באמצעות מספר מוגבל של תאים, ולנתח נתוני QPCI כדי לקבוע את רצועות גורם השעתוק בהשוואה לאזור לא מאוגד בקרה.