Name: הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: חקור שיטת ChIP יעילה לתאי T ראשוניים בכמויות מוגבלות. למד לזהות אינטראקציות חלבון-DNA ושינויים אפיגנטיים בתאי חיסון עם ניתוח QPCR מפורט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי CA141009 וGM39067. אנו מודים א &#39;ור&#39; פארנל Yarrington להערות על החלק הכתוב.

<ol><li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li>
<li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li>
<li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct1+is+a+switchable%2C+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28microChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+localization+of+replication+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li>
<li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
</ol>

אין ניגוד האינטרסים הכריז.

<html> הפרוטוקול לעיל מספק שיטה חזקה של כימות מדויק העשרת DNA מלימפוציטים ראשוניים באמצעות שבב. אחת סיבות העיקריות לחוסנו בפרוטוקול זה היא ההכללה של משכפל ביולוגי. הפרוטוקול לעיל משתמש בשלוש חזרות, להעשרה אשר מחושבת באופן עצמאי. את היציאות לאחר מכן בממוצע כדי לספק מידה מסוימת של העשרה וסטיות תקן מחושבות כדי לספק מידה של ההשתנות. עבור כל דגימה, שלוש טכניים משכפל מבוצעים גם לחסל את שונות בטיפול מדגם, ההגברה PCR, וכו &#39;הסכום של וריאציה בחזרות הטכניות הוא בדרך כלל הרבה פחות מזה שנצפ...

<table><tbody><tr><td>חנות פורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>F-8775</td><td>בחנות RT</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered</td><td>Saline Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>טבליות מעכב פרוטאז</td> C <td>Roche</td><td>04693116001</td><td>לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>חלבון G חרוזים מגנטיים</td><td>מוטיב פעיל</td><td>101945</td><td>לאחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>RNase A (20 מ"ג/מ"ל)</td> <td>EMD Millipore</td><td>556746</td><td>לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל)</td><td>Roche</td><td>03115879001</td><td>מתמוסס ב-50 מ"מ Tris-HCl, 10 מ"מ CaCl2, pH 8.0</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10966-034</td><td>יש לאחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7567</td><td>חנות ב -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>1 M מאגר גליצין</td><td></td><td></td><td>במאגר</td></tr><tr><td>ליזה של תאי RT (צינורות 5 מ"מ, pH 8.0; 85 מ"מ KCl; 0.5% NP-40)</td><td></td><td></td> <td>אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>מאגר ליזה גרעיני (50 מ"מ Tris, pH 8.1; 10 מ"מ EDTA; 1% SDS)</td><td></td><td></td> <td>אחסן במאגר</td></tr><tr><td>דילול RT ChIP (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 מ"מ EDTA; 16.7 מ"מ Tris pH 8.1; 190 מ"מ NaCl)</td><td></td><td></td> <td>אחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>מאגר שטיפה דל מלח (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 מ"מ EDTA; 20 מ"מ Tris pH 8.1; 150 מ"מ NaCl)</td><td></td><td></td> <td>יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>מאגר שטיפת מלח גבוה (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 מ"מ EDTA; 20 מ"מ Tris pH 8.1; 600 מ"מ NaCl)</td><td></td><td></td> <td>יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>מאגר כביסה C LiCl (0.25 מ' LiCl; 1% NP-40; 1% נתרן דאוקסיכולאט, 1 מ"מ EDTA; 10 מ"מ טריס pH 8.0)</td><td></td><td></td> <td>יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; מאגר</td></tr><tr><td>C TE (10 מ"מ Tris, pH 7.4, 1 מ"מ EDTA)</td><td></td><td></td> <td>יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; מאגר C</td></tr><tr><td>Elution (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)</td><td></td><td></td><td>הכן</td></tr> חנות <tr><td>NaCl</td><td></td><td></td> טרייה של 5 M <td>בחנות</td></tr><tr><td>RT 0.5 M EDTA</td><td></td><td></td><td>ב-RT</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td><td></td><td></td><td>חנות ב-RT</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>טבלה של ריאגנטים ספציפיים</חזקים></td></tr><tr><td>Clay Adams Brand Nutator</td><td>Becton Dickinson</td><td>דגם: מעמד</td> מגנטי 421105 <td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR Qiagen</td><td></td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Masonix Sonicator 3000</td><td>QSonica</td><td>דגם: S3000</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חימום</td><td>VWR</td><td>13259-030</td><td></td></tr><tr><td>מסובב</td><td>VWR</td><td>80085-692</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה עליונה ספסל קירור</td><td>בקמן קולטר</td><td>דגם: Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>שולחן ציוד</חזק> </td></tr></tbody></table>

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא שיטה בשימוש נרחב לקביעת יחסי הגומלין של חלבונים שונים עם ה-DNA בכרומטין של תאי חיים. דוגמאות לכך כוללות רצף ספציפי DNA מחייבים שעתוק גורמים, ההיסטונים ומצבי השינוי השונים שלהם, אנזימים כגון polymerases RNA וגורמים נלווים, ורכיבי תיקון DNA. למרות שכיחותה, קיים מחסור של up-to-תאריך, מתודולוגיות מפורטות להכנה גם הספסל של חומר ולניתוח מדויק המאפשר למדדי כמותיים של אינטראקציה. בשל חוסר זה של מידע, וגם כי, כמו כל immunoprecipitation, תנאים חייבים להיות מחדש מותאם לקבוצות חדשות של תנאי ניסוי, assay השבב הוא רגיש לתוצאות לא מדויקות או גרוע כמותי. הפרוטוקול שלנו נגזר מסופו של דבר עבודת זרע בגורם שעתוק: אינטראקציות DNA 1,2, אך משלב מספר השיפורים לsensitivity ושחזור לסוגי תאים קשים להשגת. הפרוטוקול שימש בהצלחה 3,4, שניהם באמצעות qPCR לכמת העשרת דנ&quot;א, או באמצעות גרסה חצי כמותית של להלן הפרוטוקול. ניתוח כמו זה של חומר PCR-מוגבר מתבצע המחשוב, ומהווה גורם מגביל בassay. בקרות חשובות ושיקולים אחרים כוללים שימוש בנוגדן אלוטיפ בהתאמה, כמו גם הערכה של אזור שליטה של ​​הדנ&quot;א הגנומי, כגון אזור גניים חזה לא להיות מחויבים לחלבון הנחקר (או צפוי שלא להציג שינויים תחת תנאי הניסוי). בנוסף, עקומת תקן של חומר הזנה לכל שבב היא מדגם המשמשת לחישוב רמות מוחלטות של העשרה בחומר הניסיוני. שימוש בעקומות סטנדרטיות עוזרת לקחת בחשבון את ההבדלים בין ערכות פריימר, לא משנה כמה הם נועדו בזהירות, וגם יעילות שונהences ברחבי הטווח של ריכוזי תבנית עבור קבוצת פריימר יחידה. הפרוטוקול שלנו הוא שונה מאחר, כי הם זמינים 5-8 שבהרחבת כיסוי השלב מאוחר יותר, הניתוח.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) פרוטוקול המובא כאן פקדים להבדלים, אם בכלל, בסך של ה-DNA משמש בPCR באמצעות שימוש בזוג פריימר שמגביר אזור מאוגד של הגנום, ובכך משמש כ&quot; בקרת טעינה &quot;. בדוגמא שמוצגת באיור 3, השתמשנו אזור הקידוד של גן Actb העכבר כמאוגד אזור לחלבון של עניין ואתר NFAT מחייב גורם שעתוק על אמרגן עכבר IL2 כאיזור היעד שלנו. לחלופין, ניתן לבחור באזור כמה kilobases מעלה זרם או במורד הזרם של אזור המיקוד הידוע יש לא מחייב של החלבון ש...

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות קישור של חלבוני קישור ל-DNA, כגון פקטורי שעתוק, או מודיפיקציות של היסטונים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת הכרומטין כשלב שני. תגובת שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) מוקמת כדי להשקיע מקטעי DNA הקשורים לחלבון הנבדק.בשלב הבא, מקטע ה-DNA הקשור לחלבון הנחקר מוגבר באמצעות PCR. התוצאות המתקבלות מראות, על בסיס ניתוח QPCR, את פי ההעשרה של מקטע ה-DNA הקשור לחלבון הנחקר בהשוואה לאזור שאינו קשור. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי התעתוק, הכרומטין והאפיגנטיקה, כגון מתי ובאיזה מיקום נמצאים חלבונים שונים, במצבם המודף או שאינם מודפים.על ה-DNA למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ויסות גנים בתאי T, היא יכולה להיות מיושמת גם על מערכות אחרות כגון לימפוציטים B, דגימות לוקמיה וקווי תאים מונחליים. הכרומטין עבור ניסוי זה יוכן מתאי T נאיביים מסוג CD4 מהטחול של עכבר.כדי להתחיל בהליך זה, יש להוסיף formaldehyde בריכוז של 37% עד לריכוז סופי של 1% לתמיחת תאי ה-CD4 T ב-DMEM ולנער בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. פעולה זו תיצור קשרי גומש (crosslink) בין קומפלקסי ה-DNA והחלבון. יש לעצור את יצירת קשרי הגומש על ידי הוספת glycine בריכוז של one molar עד לריכוז סופי של 125 millimolar.המשיכו לנער בתנועה סיבובית (rocking) למשך חמש דקות בט

efficient-chromatin-immunoprecipitation-using-limiting-amounts

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

סרטון זה מתאר פרוטוקול לבדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP), שהיא טכניקה קלאסית להדגמת אינטראקציות חלבון-דנ"א. טכניקה זו משמשת לזיהוי גני מטרה בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית בבני אדם.

בדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין: טכניקה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בתאים

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

אינטראקציות DNA חלבון חיוניים עבור תהליכים ביולוגיים מרובים. במהלך הערכה של פונקציות הסלולר, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא הכרחי להבנת הרגולציה הגנטית. Chromatin immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות כאלה in vivo.

ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סינון לבודד גרעינים באיכות גבוהה מן הצלב המקושרים שריר השלד העכבר שבו הסרנו את הצורך ultracentrifugation, מה שהופך אותו ישים בקלות. אנו מראים כי הכרומטין מוכן מן הגרעינים מתאים immunoprecipitation הכרומטין וסביר הכרומטין immunoprecipitation רצף מחקרים.

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

זוהי שיטה לזיהוי חלבונים אינטראקציה-DNA הרומן ב לוקוסים יעד ספציפיות, בהסתמך על רצף ספציפי לכידתו של כרומטין תפור עבור ניתוחים פרוטיאומיה מבנית עוקבות. ידע מוקדם לגבי פוטנציאל מחייב חלבונים, ולא תא שינויים נדרשים. בתחילה פותח עבור שמרים, הטכנולוגיה כבר עכשיו מותאם בתרבית של תאים.

עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים

כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

חקור שיטת ChIP יעילה לתאי T ראשוניים בכמויות מוגבלות. למד לזהות אינטראקציות חלבון-DNA ושינויים אפיגנטיים בתאי חיסון עם ניתוח QPCR מפורט.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

גלה סרטונים נוספים