דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה (super resolution) בשיטת STORM. הדבר מבוצע תחילה על ידי הכנת דגימה לבדיקה המסומנת פלואורסצנטית. השלב השני הוא הכנת באפר החלפה (switching buffer) ולאחר מכן מילוי תא ההדמיה בבאפר.

בשלב הבא, נרכשים הנתונים הגולמיים באמצעות מיקרוסקופ STORM. השלב הסופי הוא שחזור תמונות ברזולוציה-על מהנתונים הגולמיים באמצעות תוכנת העיבוד RainStorm. בסופו של דבר, דגימות הבדיקה משמשות להדגמה כיצד לרכוש נתונים גולמיים באיכות גבוהה, אותם ניתן לעבד כדי להפיק תמונות STORM ברזולוציה-על בתאים, עם רזולוציה שבין 30 ל-50 nanometers, המהווה שיפור של פי חמישה עד עשרה ברזולוציה לעומת טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסורתיות, כולל TIRF ומיקרוסקופיה קונפוקלית.

באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בביצועה כיוון שאינם מודעים לחשיבות של איסוף כמות גדולה של קישורים דלילים (sparse links) באיכות גבוהה. הדבר מקל משמעותית על ידי שימוש בצבע Alexa 6 4 7 בבופר החלפה מתאים. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא חיונית, שכן השגת נתוני גלם באיכות גבוהה היא קריטית להפקת תמונות ברזולוציית SPR.

רצפי הווידאו הגולמיים של טכניקה זו נראים שונה לחלוטין מכל צורה אחרת של מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. כדי להתחיל את ההליך לציפוי זכוכית בדקסטרין פלואורסצנטי, העבר 200 µL של תמיסת polylysine בריכוז 0.01% לכל באער של זכוכית כיסוי בעלת שמונה תאים והדגר במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הסר את תמיסת ה-polylysine באמצעות פיפטה כדי להבטיח שלא נותר נוזל מדלל.

0.25 µL של תמיסת מלאי של dextrin Alexa 647 בריכוז של 2 mg/mL, לתוך 25 µL של מים דה-יוניים, כדי ליצור תמיסה בריכוז של 20 µg/mL ליצירת ציפוי בצפיפות גבוהה של תמיסת dextrin Alexa 647.

דללו 20 µL מהתמיסה בריכוז 20 µg/mL לסך של 200 µL של מים דה-יוניים. לקבלת תמיסה בצפיפות בינונית, דללו 2 µL ב-200 µL של מים דה-יוניים. לקבלת תמיסה בצפיפות נמוכה, דללו 0.2 µL.

הוסיפו 200 microliters של תמיסות dextrin Alexis X 47 מדוללות לכל באער המכיל 200 microliters של מים דיוניים, והדגירו למשך 10 דקות. ניתן להשתמש בזמני הדגרה ארוכים יותר, מה שעשוי להוביל לציפוי dextrin צפוף יותר. לבסוף, הסירו את תמיסות Dexter Xis X 47 ושטפו במים שלוש פעמים.

להכנת סיבי אקטין פלואורסצנטיים על זכוכית, ראשית, הוסף 200 µL של תמיסת polylysine בריכוז 0.01% לכל באר בתא בעל שמונה תאים. כסה בזכוכית והדגר למשך 10 דקות. הסר את הנוזל באמצעות פיפטה כדי להבטיח שלא נותר נוזל.

הוסיפו לכל תא 90 µL של באפר אקטין כללי ששוחזר מראש בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של תמיסת סיבי אקטין מוכנים בריכוז 10 µM ומיקרוליטר אחד של foid ו-Alexa 6 47, וערבבו בעדינות על ידי שאיבה והזרקה חוזרת עם פיפט. הדגרירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין חרוזי מיקרוספירה פלואורסצנטיים כסימנים ייחוס (fiducial markers). כדי לדלל, ערבבו מיקרוליטר אחד של חרוזי tepec ב-200 µL של PBS. הוסיפו את החרוזים המדוללים לתא הדימוי והמתינו 15 דקות.

לאחר 15 דקות, הסירו את התמיסה ושטפו שלוש פעמים עם PBS לפני הדימוג. בתורנית זו נעשה שימוש בתאים שגודלו עד לצפיפות של כ-80%. הסירו את מצע התרבית ושטפו עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו 500 microliters של תמיסת formaldehyde בריכוז 4% למשך 10 דקות.

הסר את הפורמאלדהיד ושטוף שלוש פעמים עם PBS. אין להניח לתאים להתייבש ויש להשתמש תמיד בתמיסות חוצצים של PBS. כדי למנוע עקה היפוטונית, הוסף 2 µL של תמיסת מלאי בריכוז 50 µg/mL של EGF Alexa, 6 47 ל-200 µL של תמיסת 0.1%BSA, ולאחר מכן הוסף תמיסה זו לתאי hela.

דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את התמיסה ושטפו שלוש פעמים עם PBS. הוסיפו תמיסת חסימה של 0.1%BSA והשאירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את תמיסת החסימה ושטוף שלוש פעמים נוספות עם PBS לפני הדימוי. ממש לפני הדימוי, הכן את באפר ההחלפה על ידי ערבוב תמיסות המלאי של אנזים הגלוקוז וחומר מחזר ביחס של 50 microliters, 400 microliters ו-100 microliters; הוסף PBS כדי להשלים את הנפח הסופי ל-one milliliter. הסר את ה-PBS מתא הדימוי ומלא אותו עד למעלה בבאפר ההחלפה.

הנח בזהירות זכוכית כיסוי מעל התא, וודא שאין בועות כלל ושהתא כולו מכוסה. אם נראות בועות כלשהן, הוסף עוד מהבופר או מה-PBS. אחרת, ביצועי הבופר עלולים להיפגע.

איסוף נתוני קישור דלילים באיכות גבוהה חיוני להצלחת הליך זה, לכן ודאו כי המיקרוסקופים ממוקדים כראוי וכי נעשה שימוש בהגדרות רכישה נכונות. אתרו מבנה פלואורסצנטי רלוונטי לצילום. בחרו את זווית התאורה הרצויה.

במקרה זה, מומלץ להשתמש ביעדד (turf) או בזווית נטייה גבוהה, שכן הדבר משפר את יחס האות לרעש על ידי מזעור של אור מחוץ למיקוד, דבר המועיל במיוחד עבור דגימות תאים. צלם תמונת ייחוס מוגבלת-שברים של המבנה לפני הדימוי בשיטת STORM. הגבר את לייזר העירור להספק גבוה התואם לכ-2 kW/cm², תוך דימוי בהגדרות מצלמה של חשיפה של 10 ms וזמן מחזור של כ-50 Hz או פריימים לשנייה.

ברגע שדגימות ה-flora fours יעברו לדפוס הבהוב דליל, אספו 10,000 פריימים. כדי להתחיל בשחזור זה, פתחו את קובץ ה-RAINSTORM M מתוך MATLAB והריצו אותו בחלון ה-rainstorm.

בחר את קובץ התמונה לניתוח באמצעות כפתור העיון (browse). זה צריך להיות קובץ TIF. שנה את רוחב הפיקסלים כך שיתאים לנתונים הגולמיים של מערכת המיקרוסקופ ששימשה לרכישת הנתונים.

השאר את שאר הערכים כברירת מחדל. לחץ על כפתור עיבוד התמונות (process images) והמתן עד להופעת תמונה ראשונית. משך העיבוד יהיה תלוי בגודל הקובץ, במפרט המחשב ובמספר הקישורים הפוטנציאליים בתוך נתוני הגלם.

כדי להפיק תמונת רזולוציה-על (super resolution) מעודכנת, לחצו על כפתור ה-open reviewer וחלון שני יופיע. לחצו על כפתור ה-adjust contrast כדי לשנות את תצוגת התמונה כרצונכם. במקרים מסוימים שבהם התמונה כהה מאוד, יש להפחית את הערך המקסימלי.

השתמשו בחלון הבקרה (reviewer window) כדי להפיק מדדי איכות תמונה שימושיים ולזקק את תמונת הרזולוציה העליונה (super resolution) באופן נוסף. השאירו את שלושת פרמטרי בקרת האיכות הראשונים בערכי ברירת המחדל שלהם: 5,000, 0.1 ו-0.8 עד 3.5 בהתאמה. עדכנו את ערך הספירות לכל פוטון (counts per photon).

שנו את סף דיוק הלוקליזציה (localization precision cutoff) כדי להגיע לפשרה בין אופטימיזציה של הלוקליזציה הממוצעת והדיוק לבין מספר הלוקליזציות. בתמונה הסופית, מומלצים ערכים של 30 עד 50 nanometers, תלוי באיכות הנתונים ובדגימה. מקדם קנה המידה ברירת המחדל לשחזור הוא חמישה, מה שיפיק פיקסלים ברזולוציה גבוהה (super resolution) של 32 nanometers, בהנחה שהפיקסל בתמונות המקוריות הוא 160 nanometers.

אם לתמונות הגולמיות יש גודל פיקסל של 100 nanometers, הדבר יניב תמונות ברזולוציה גבוהה (super resolution) עם פיקסלים של 20 nanometers. הגדילו את מקדם קנה המידה (scale factor) כדי להפיק פיקסלי super resolution קטנים יותר. בתמונה הסופית, לחצו על כפתור ה-run reviewer כדי להפיק תמונת super resolution מעודכנת.

לחצו על כפתור view histograms כדי להציג מדדי איכות תמונה. לבסוף, לחצו על כפתור save image בבודק (reviewer) כדי לשמור את כל הנתונים הללו. התחילו את הפרוצדורה על ידי הפקת תמונה באופן שבו הודגם קודם לכן.

לחצו על כפתור מעקב התיבה (box tracking) בבודק, וגררו תיבה מעל סימן הייחוס (fiducial marker) בתמונה הנבדקת. המתינו עד להופעת תמונה חדשה, שתציג את מיקומי התיבות. שמרו תמונה זו במידת הצורך, אם האובייקט הנבדק הוא סימן ייחוס.

כפי שנעשה כאן, בצעו תיקון סחיפה (drift correction) על ידי לחיצה על כפתור set anchor ולאחריו על כפתור subtract drift. לבסוף, לחצו שוב על run reviewer כדי להפיק תמונת storm חדשה. ציפוי מוצלח של dextrin אמור להניב שכבה פלואורסצנטית חד-שכבתית (monolayer), ונתוני dextrin טיפוסיים מוצגים בדמות זו.

התמונות המוגבלות על ידי עקיפה מציגות ריכוזים שונים של דקסטרין לפני הדמיית STORM. לשחזורי הרזולוציה העילאית יש גודל פיקסל של 25 nanometers. נאספו 10,000 תמונות עם גודל פריים של 128 על 128 פיקסלים, ופרימים בודדים מאותה רצף מוצגים כאן.

בריכוז גבוה של דקסטרין, השכבה המונומולקולרית הפלואורסצנטית צריכה להיראות אחידה יחסית, כפי שמוצג בתמונות אלו ובקטע וידאו זה. בריכוזים נמוכים יותר, ההבזקים ייראו דלילים יותר ובמיקוד.

בהיעדר רקע בולט במהלך שלב רכישת תמונה זה תחת הארה קבועה בלייזר, מספר ההבזקים יפחת עם הזמן, כפי שמוצג בהשוואה בין פריים 2000 לפריים 8,000 בדגימה בעלת הצפיפות הגבוהה. ההבדל העיקרי בין תמונות הרזולוציה-העל של ריכוזי הדקסטרין הגבוהים, הבינוניים והנמוכים הוא המספר הפוחת של הלוקליזציות. גרף זה מציג ממוצע של שלוש רצפים של 10,000 פריימים עבור כל ריכוז של דקסטרין, כאשר פסי השגיאה מציינים את סטיית התקן.

עם זאת, קשר פרופורציונלי זה בין ריכוז המולקולות הפלואורסצנטיות, מספר ההבהובים (blinks) בנתונים הגולמיים ומספר הלוקליזציות אינו ליניארי פשוט, כפי שמוצג בגרף זה של מספר הלוקליזציות המקובלות לכל פריים. בשימוש בממוצע נגל (rolling average) של 100 פריימים בצפיפויות גבוהות מאוד של מולקולות, התוכנה אינה מסוגלת לבצע לוקליזציה מוצלחת של מולקולות בעת דימיון של כל דגימה. בעיה נפוצה עשויה להיות נוכחות של ערפל פלואורסצנטי בהיר אך לא ממוקד על פני התמונה, הנגרם על ידי התפשטות של הפלואורפור דרך המדיום.

ניתן למנוע או להסיר מולקולות פלורסצנטיות ניתקות אלו על ידי הגדלת מספר שלבי השטיפה עם PBS לפני הוספת תמיסת המיתוג, או על ידי הוספת תמיסת מיתוג רעננה לתא; עיבוד והשוואה של הנתונים מכל רצף תמונות מניבים תמונות רזולוציה-על שונות מאוד. פאנלים C ו-D הם בנייה של דמויי רזולוציה-על התואמים לנתונים שנאספו בפאנלים A ו-B בהתאמה. גרף זה מציג את מספר הלוקליזציות המקובלות לכל פריים באמצעות ממוצע נע של 100 פריימים.

הקו האדום תואם לרצפי ה-storm A ו-C שבהם הרקע גבוה, והקו הכחול תואם ל-B ו-D שבהם הרקע נמוך. מספר הלוקליזציות המקובל עבור התמונות התואמות לנתוני רקע גבוה ונמוך מוצג בגרף השני. שלוש תמונות אלו, המוגבלות על ידי דיפרקציה, מראות נתונים טיפוסיים של פילמנטים של actin שנוצרו מראש והודבקו לפני השטח של הזכוכית לפני הוספת תמיסת המיתוג (switching buffer) והדמיית storm.

ניתן לראות סיבים באורכים משתנים. סיבים בהירים מאוד הם לעיתים קרובות מספר סיבים השזורים יחד. בחירה של סיבים בודדים ובהירים יחסית, במקום אזורים שזורים, תביא לתמונות באיכות גבוהה יותר במהלך שלב הרכישה.

יש לראות הבזקים בהירים וממוקדים לאורך סיב השערה. הבזקים דלילים צריכים להופיע במהלך שלב הרכישה ולאחר מכן בנתוני העיבוד. יש להופיע סיב רציף ודק, כאשר מספר המיקומים (localizations) לפריים אמור להראות ירידה הדרגתית.

בדרך כלל, הרוחב במחצית הגובה המקסימלי (FWHM) של סיב ניתן כהערכה אמפירית של הרזולוציה, על ידי שרטוט קו ישר דרך אזור מוגדל של סיב האקטין באמצעות תכונת ה-plot profile ב-ImageJ וביצוע התאמה גאוסיאנית לאחר מכן. ה-FWHM מחושב כ-43.2 nanometers. בעיית מיקום שגוי (mis localization) עלולה להתרחש כאשר מספר סיבי אקטין מתבסעים ו/או חוצים זה את זה, וניתן לזהות זאת על ידי עיבוד תתי-קבוצות של פריימים והשוואה בין 5,000 הפריימים הראשונים לאחרונים.

בתמונת רזולוציה-על המופקת באמצעות 5,000 הפריימים הראשונים מתקבלת תמונה שונה. ניתן לראות מיקומים (localizations) רבים במרכז התמונה. עם זאת, כאשר משתמשים ב-5,000 הפריימים האחרונים, מעט מאוד מהמיקומים הללו נראים, ורק הסיבים נותרים, אם כי באופן פחות רציף בשל המספר הנמוך של המיקומים בתמונה.

אם קיים חשד לצפיפות הבהובים גבוהה מדי, השוואה של התמונות עם נתוני הלוקליזציה לכל פריים עשויה להצביע בבירור על כך שהבעיה מתרחשת במהלך סט הפרימים הראשון. מספר הלוקליזציות הממוצע לפריים עולה על 10, בהשוואה לסט הפרימים האחרון שבו הוא עומד על כארבעה. בעיה פוטנציאלית נוספת במיקרוסקופיית STORM היא סחיפה (drift), המתרחשת כאשר הדגימה נעה ביחס לעדשת העדשה. במהלך שלב רכישת הנתונים, למרות שקשה מאוד לזהות זאת בזמן רכישת התמונה, ניתן לזהות סחיפה בתמונות ברזולוציה גבוהה (super resolution) של מבנים מוכרים, כגון סיבי actin.

הסימן הראשון לכך שייתכן והתרחשה סחיפה צדית (lateral drift) הוא שהמבנה גדול מהמצופה. לדוגמה, כאשר רוחב חצי המקסימום (full width at half maximum) גדול יחסית לנתוני גבול הדיוק של rainstorm, ובמקרה זה 90 nanometers לעומת 67 nanometers. דרך טובה יותר לזיהוי סחיפה היא השוואת הלוקליזציות כפונקציה של הזמן, כלומר, בדיקה האם הלוקליזציות בפריימים המאוחרים יותר מוזזות בהשוואה לאלו בפריימים המוקדמים.

ניתן לראות זאת בבירור במקרה של סיבי אקטין כאשר הם מוצגים עם קוד צבעים. באמצעות תכונת מעקב התיבות (box tracking) ב-rainstorm, כפי שמוצג בפאנלים B ו-C, לוקליזציות מוצגות בצבע התואם למספר הפריים שבו הן נרכשו. לדוגמה, לוקליזציות מתחילת רצף הרכישה הן בצבע כחול, בעוד שלוקליזציות מסוף רצף הרכישה הן בצבע אדום.

הצבעים המוסטים מעידים על התרחשות סחיפה (drift) לצורך מדידה ותיקון. עבור סחיפה, ניתן להשתמש בחרוזי פלואורסצנציה בעלי קוטר של 100 nanometer כסמני ייחוס (fiducial markers); מספרים 1 עד 4 מציגים חרוזים בודדים שנחתכו והוגדלו. בדוגמה שבה קיימת סחיפה חמורה יחסית של כ-100 nanometers במהלך שלוש דקות ו-10 שניות בשלב הרכישה, ניתן להשתמש בתכונת מעקב התיבה (box tracking) כדי לקודד בצבע ולאשר שהסחיפה אכן התרחשה. מכיוון שכל ארבעת החרוזים בדוגמה זו הראו סחיפה כמעט זהה, ניתן לבחור באחד מהם, ובמקרה זה בחרוז 2, כדי לשמש כייחוס ולהחסיר את הסחיפה מהחרוזים האחרים.

השוואה עם פאנל E מראה כי הסחף הצדי תוקן. לבסוף, ניתן להשתמש בתאי HeLa שצבעו לגורם גדילה אפידרמלי (epidermal growth factor) כדי לספק דוגמה ריאליסטית לרזולוציית התמונה. בפאנל A של התאים מוצגת תמונה מוגבלת ע"י דיפרקציה של חלק מתא HeLa הממוקד במשטח התא הבזאלי, כאשר המלבנים הצהובים מצביעים על אזורי עניין מוגדלים המוצגים בפאנלים B ו-C, בניגוד לאזורי העניין המוגדלים הבלתי ברורים בתמונה המוגבלת ע"י דיפרקציה.

תמונות הסופר-רזולוציה צריכות להראות תערובת של צבירים ופיקסלים בודדים מבודדים מדי פעם. הצבירים יהיו בקוטר של כ-100 nanometers וככל הנראה יתאימו לגומיות (pits) ושלפוחיות (vesicles) בהתהוות. המסלול שדרכו EGF מורד בעיקר בביטוי שלו ועובר אנדוציטוזה, נתוני מיקומים לכל פריים מפאנל D, מוצגים בגרף G. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מכינים דגימות בדיקה פשוטות, רוכשים נתונים ומשחזרים תמונות storm בעלות רזולוציה גבוהה.

שיטות אלו יעזרו למנוע כשלים נפוצים בהתאמה (fit), כגון סחיפה (drift), ויסייעו באופטימיזציה של ה-storm שלכם. ראו ניסויי רזולוציה.