דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד לרכוש תמונות ברזולוציה סופר סערה באיכות גבוהה. זה מושג על ידי הכנת דגימת בדיקה עם תווית פלואורסצנטית. השלב השני הוא הכנת מאגר מיתוג ולאחר מכן מילוי תא ההדמיה במאגר.

לאחר מכן, הנתונים הגולמיים נרכשים במיקרוסקופ סערה. השלב האחרון הוא שחזור תמונות ברזולוציה גבוהה מנתונים גולמיים באמצעות תוכנת עיבוד סופות גשמים. בסופו של דבר, דגימות הבדיקה משמשות כדי להראות כיצד לרכוש נתונים גולמיים באיכות גבוהה, אותם ניתן לעבד כדי ליצור תמונות ברזולוציה סופר סערה בתאים ברזולוציות שבין 30 ל-50 ננומטר, המייצגות שיפור ברזולוציה של פי חמישה עד עשרה על פני טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מסורתיות כולל דשא וקונפוקל.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם לא מבינים את החשיבות של איסוף הרבה קישורים דלילים באיכות גבוהה. זה נעשה הרבה יותר קל על ידי שימוש בצבע Alexa 6 4 7 במאגר המיתוג הנכון. הדגמה חזותית של טכניקה זו חיונית מכיוון שרכישת נתונים גולמיים באיכות גבוהה היא קריטית בהפקת תמונות ברזולוציית SPR.

רצפי הווידאו הגולמיים של טכניקה זו נראים שונים לחלוטין מכל צורה אחרת של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. להתחיל בהליך ציפוי זכוכית בדקסטרין פלואורסצנטי ב -200 מיקרוליטר של תמיסת פוליליזין של 0.01% לכל באר של זכוכית כיסוי שמונה חדרים ולדגור למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הסר את תמיסת הפוליליזין בעזרת פיפטה כדי להבטיח שלא יישאר נוזל מדולל.

0.25 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של שני מיליגרם למיליליטר של דקסטרין. Alexa 6 47 לתוך 25 מיקרוליטר של מים נטולי יונים ליצירת תמיסה של 20 מיקרוגרם למיליליטר ליצירת ציפוי בצפיפות גבוהה של דקסטרין. פתרון Alexa 6 47.

מדללים 20 מיקרוליטר מתמיסה של 20 מיקרוגרם למיליליטר לסך של 200 מיקרוליטר מים דה-יונים. לקבלת תמיסה בצפיפות בינונית, יש לדלל שני מיקרוליטר ב -200 מיקרוליטר מים דה-יונים. לקבלת תמיסה בצפיפות נמוכה, יש לדלל 0.2 מיקרוליטר.

ב -200 מיקרוליטר של מים נטולי יונים, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסות דקסטרין מדוללות Alexis X 47 לכל באר ודגרו למשך 10 דקות. ניתן להשתמש בזמני דגירה ארוכים יותר, מה שעלול לגרום לציפוי דקסטרין צפוף יותר. לבסוף, הסר את תמיסות Dexter Xis X 47 ושטוף במים שלוש פעמים.

כדי להכין תחילה חוטי אקטין פלואורסצנטיים על זכוכית, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת פוליליזין של 0.01% לכל באר של שמונה תאים. מכסים את הכוס ודוגרים למשך 10 דקות. מוציאים בעזרת פיפטה כדי להבטיח שלא יישאר נוזל.

הוסף לכל תא 90 מיקרוליטר של מאגר אקטין כללי ששוחזר בעבר על פי הוראות היצרן. לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוליטר של תמיסת נימה אקטין מוכנה מראש של 10 מיקרו-מולרית ומיקרוליטר אחד של Foid ו-Alexa 6 47 ומעבירים בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב את הדגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין חרוזי פלואורסצנט מיקרוספרה כסמנים נאמנים לדילול מיקרוליטר אחד של חרוזי טפק ל-200 מיקרוליטר PBS ולערבב. הוסף את החרוזים המדוללים לתא ההדמיה והמתן 15 דקות.

לאחר 15 דקות, הסר את התמיסה ושטוף שלוש פעמים עם PBS לפני ההדמיה נעשה שימוש בתאים שגודלו לשטף של כ-80% בניסוי זה. הסר את מדיום התרבות ושטוף עם PBS. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת פורמלדהיד 4% למשך 10 דקות.

הסר את הפורמלדהיד ושטוף שלוש פעמים עם PBS. אל תאפשר לתאים להישאר יבשים והשתמש תמיד בתמיסות חוצץ PBS. כדי למנוע מתח היפוטוני, הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 50 מיקרוגרם למיליליטר של EGF Alexa, 6 47 עד 200 מיקרוליטר של תמיסת BSA של 0.1%, ולאחר מכן הוסף תמיסה זו לתאי הלה.

דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את התמיסה ושטוף שלוש פעמים עם PBS. הוסף תמיסת חסימה של 0.1% BSA והשאיר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את תמיסת החסימה ושטוף שלוש פעמים נוספות עם PBS לפני ההדמיה. רגע לפני ההדמיה, הכן את מאגר המיתוג על ידי ערבוב תמיסות מלאי האנזים גלוקוז וחומר הפחתה יחד ביחס של 50 מיקרוליטר, 400 מיקרוליטר ו-100 מיקרוליטר, הוסף PBS כדי להרכיב את הנפח הסופי למיליליטר אחד. הסר את ה-PBS מתא ההדמיה ולאחר מכן מלא את החלק העליון עם מאגר המיתוג.

הנח בזהירות החלקת כיסוי מעל החלק העליון של החדר, וודא שאין בועות כלל וכל החדר מכוסה. אם נראות בועות כלשהן, מלא במאגר נוסף או PBS. אחרת, ביצועי המאגר עלולים לרדת.

איסוף נתוני קישור דלילים באיכות גבוהה חיוני להצלחת הליך זה, לכן ודא שהמיקרוסקופים ממוקדים כראוי ונעשה שימוש בהגדרות הרכישה הנכונות. אתר מבנה פלואורסצנטי מעניין לצילום. בחר את זווית התאורה הרצויה.

במקרה זה, מומלץ להשתמש בדשא או בזווית נוטה מאוד מכיוון שהדבר משפר את יחס האות לרעש על ידי מזעור אור מחוץ למיקוד, מה שמועיל במיוחד עבור דגימות תאים. קח התייחסות לתמונה מוגבלת בשבר של המבנה לפני הדמיית הסערה. הגדל את לייזר העירור להספק גבוה המתאים לכשני קילוואט לסנטימטר בריבוע תוך כדי הדמיה עם הגדרות מצלמה של חשיפה של 10 אלפיות השנייה וזמן מחזור של כ-50 הרץ או פריימים לשנייה.

לאחר שרביעיות הצומח עברו לתבנית מהבהבת דלילה, אספו 10,000 פריימים. להתחיל בשחזור זה. פתח את קובץ RAINSTORM M מתוך MATLAB והפעל אותו בחלון סופת הגשם.

בחר את קובץ התמונה לניתוח באמצעות לחצן העיון. זה צריך להיות קובץ TIF. שנה את רוחב הפיקסלים כך שיתאים לנתונים הגולמיים של מערכת המיקרוסקופ המשמשת לרכישת הנתונים.

השאר את הערכים האחרים כברירת מחדל. לחץ על כפתור עיבוד התמונות והמתן עד להופעת תמונה ראשונית. משך העיבוד יהיה תלוי בגודל הקובץ, במפרט המחשב ובמספר הקישורים המועמדים בתוך הנתונים הגולמיים.

כדי ליצור תמונה מעודכנת ברזולוציה סופר, לחץ על כפתור הבודק הפתוח וחלון שני יופיע. לחץ על כפתור התאמת הניגודיות על מנת לשנות את תצוגת התמונה כרצונך. במקרים מסוימים בהם התמונה כהה מאוד, יש להקטין את הערך המקסימלי.

השתמש בחלון הבודק כדי ליצור מדדי איכות תמונה שימושיים ולחדד עוד יותר את התמונה ברזולוציה גבוהה. השאר את שלושת פרמטרי בקרת האיכות הראשונים לערכי ברירת מחדל של 5, 000, 0.1 ו- 0.8 עד 3.5 בהתאמה. עדכן את הספירות לכל ערך פוטון.

שנה את חיתוך דיוק הלוקליזציה כדי להחליף בין אופטימיזציה של לוקליזציה ממוצעת, דיוק מול מספר לוקליזציה. בתמונה הסופית מומלצים ערכים של 30 עד 50 ננומטר בהתאם לאיכות הנתונים והדגימה. ברירת המחדל של גורם קנה המידה של השחזור היא חמש, שתייצר פיקסלים ברזולוציה גבוהה של 32 ננומטר, בהנחה שהפיקסל בתוך התמונות המקוריות הוא 160 ננומטר.

אם לתמונות הגולמיות יש גודל פיקסל של 100 ננומטר, זה יפיק תמונות ברזולוציה סופר עם פיקסלים של 20 ננומטר. הגדל את גורם קנה המידה כדי להפיק פיקסלים קטנים יותר ברזולוציה גבוהה. בתמונה הסופית, לחץ על כפתור ההפעלה של הבודק כדי ליצור תמונה מעודכנת ברזולוציה סופר.

לחץ על כפתור הצג היסטוגרמות על מנת להציג מדדי איכות תמונה. לבסוף, לחץ על כפתור שמירת התמונה בבודק על מנת לשמור את כל הנתונים הללו. התחל הליך זה על-ידי יצירת תמונה באותו אופן כפי שהודגם קודם לכן.

לחץ על כפתור המעקב אחר התיבה בבודק ולחץ וגרור תיבה מעל הסמן הנאמן בתמונה שנסקרה. המתן עד להופעת תמונה חדשה, שתציג את המיקומים בתיבה. שמור תמונה זו אם תרצה, אם מושא העניין הוא סמן נאמן.

כמו במקרה הזה, בצע תיקון סחיפה על ידי לחיצה על כפתור העוגן המוגדר ואחריו כפתור החיסור. לבסוף, לחץ שוב על הפעל סוקר כדי ליצור תמונת סערה חדשה. ציפוי מוצלח של דקסטרין אמור לייצר חד-שכבת פלואורסצנטית ונתוני דקסטרין אופייניים מוצגים באיור זה.

התמונות המוגבלות של העקיפה מראות ריכוזים שונים של דקסטרין לפני הדמיית הסערה. שחזורים ברזולוציה גבוהה הם בגודל פיקסל של 25 ננומטר. 10,000 תמונות נאספו בגודל מסגרת של 1 28 על 1 28 פיקסלים ופריימים בודדים מוצגים מרצף זה.

בריכוז דקסטרין גבוה. השכבה החד-שכבתית הפלואורסצנטית אמורה להיראות אחידה יחסית כפי שמוצג בתמונות אלה ובקטע וידאו זה. בריכוזים נמוכים יותר, המצמוצים ייראו דלילים יותר וממוקדים.

ללא רקע ברור במהלך שלב רכישת תמונה זה בתאורת לייזר קבועה, מספר המצמוצים יקטן עם הזמן כפי שמומחש על ידי השוואה בין מסגרת 2000 למסגרת 8,000 בדגימת הצפיפות הגבוהה. ההבדל העיקרי בין תמונות ברזולוציה גבוהה של ריכוזי דקסטרין גבוהים, בינוניים ונמוכים הוא המספר ההולך ופוחת של לוקליזציות. גרף זה מציג ממוצע של שלושה רצפי פריימים של 10,000 של כל ריכוז דקסטרין כאשר פסי השגיאה מציינים את סטיית התקן.

עם זאת, יחס פרופורציונלי זה בין ריכוז המולקולות הפלואורסצנטיות, מספר המצמוצים בנתונים הגולמיים ומספר הלוקליזציות אינו יחס ליניארי פשוט כפי שמודגם בתרשים זה של מספר הלוקליזציות המקובלות למסגרת. באמצעות ממוצע מתגלגל של 100 פריימים בצפיפות מולקולות גבוהה מאוד, התוכנה אינה מסוגלת למקם בהצלחה מולקולות בעת הדמיה של דגימה כלשהי. בעיה נפוצה יכולה להיות נוכחות של אובך פלואורסצנטי בהיר אך לא ממוקד על פני התמונה הנגרם על ידי כוח פלואורו המתפזר דרך המדיום.

ניתן למנוע או להסיר מולקולות פלואורסצנטיות מנותקות אלה על ידי הגדלת מספר שלבי הכביסה עם PBS לפני הוספת מאגר המיתוג או על ידי הוספת מאגר מיתוג טרי לתא, עיבוד והשוואת הנתונים מכל רצף תמונות מביא לתמונות ברזולוציה סופר שונה מאוד. פאנל C ו-D הם מבני תמונות ברזולוציה גבוהה המתאימים לנתונים שנאספו בפאנלים A ו-B בהתאמה. גרף זה מתווה את מספר הלוקליזציות המקובלות לכל מסגרת באמצעות ממוצע מתגלגל של 100 פריימים.

הקו האדום מתאים לרצף הסערה A ו-C שבהם יש רקע גבוה, הקו הכחול מתאים ל-B ו-D שבהם הרקע נמוך. מספר הלוקליזציה המקובל עבור התמונות המתאים לנתוני רקע גבוהים ונמוכים מוצג בגרף השני. שלושת התמונות המוגבלות בעקיפה הללו מציגות נתונים אופייניים של חוטי אקטין מוכנים מראש שנדבקו לפני פני הזכוכית לפני הוספת מאגר מיתוג והדמיית סערה.

ניתן לראות אורכים משתנים של חוטים. חוטים בהירים מאוד הם לרוב כמה חוטים שמסתבכים זה בזה. בחירת חוטים בודדים בהירים יחסית במקום אזורים סבוכים מביאה לתמונות באיכות טובה יותר בשלב הרכישה.

יש לראות מצמוצים בהירים בפוקוס לאורך הנימה. יש לראות מצמוץ דליל בשלב הרכישה ולאחר מכן בנתוני התהליך. צריך להיות נימה רציפה דקה בלוקליזציות לכל מסגרת אמורה להראות ירידה הדרגתית.

בדרך כלל, המלא עם חצי מקסימום או FWHM של נימה ניתן כהערכה אמפירית של הרזולוציה על ידי ציור קו ישר דרך אזור מוגדל של חוט האקטין באמצעות תכונת פרופיל העלילה בתמונה J ולאחר מכן ביצוע התאמה גאוסית. ה-FWHM מחושב כ-43.2 ננומטר. בעיית לוקליזציה שגויה יכולה להתרחש כאשר מספר חוטי אקטין מסתעפים או חוצים זה את זה על ידי עיבוד תת-קבוצות של מסגרות והשוואה בין 5,000 הפריימים הראשונים והאחרונים.

תמונה שונה מופקת בתמונה ברזולוציה סופר באמצעות 5,000 הפריימים הראשונים. לוקליזציות רבות נראות באמצע התמונה. עם זאת, כאשר משתמשים ב-5,000 הפריימים האחרונים, מעט מאוד מהלוקליזציות הללו ניכרות ורק החוטים נותרים רציפים במידה מסוימת בשל המספר הנמוך של לוקליזציות בתמונה.

אם יש חשד לצפיפות מהבהבת גבוהה מדי, השוואה של התמונות עם נתוני הלוקליזציה למסגרת יכולה להצביע על כך שבעיה זו מתרחשת במהלך קבוצת הפריימים הראשונה. יש מספר ממוצע של לוקליזציות למסגרת של מעל 10 בהשוואה לקבוצת המסגרות האחרונה שבה הוא בערך ארבע. בעיה פוטנציאלית נוספת במיקרוסקופ סערה היא סחיפה, המתרחשת כאשר הדגימה נעה ביחס לעדשת המטרה דרך שלב רכישת הנתונים, למרות שקשה מאוד לזהות בשלב רכישת התמונה, ניתן לזהות סחיפה בתמונות ברזולוציה סופר של מבנים ידועים כגון חוטי אקטין.

הסימן הראשון לכך שייתכן שהתרחשה סחיפה רוחבית הוא שהמבנה גדול מהצפוי. לדוגמה, עם מלא גדול יחסית עם חצי מקסימום בהשוואה לנתוני גבול הדיוק מסופת גשמים, במקרה זה 90 ננומטר לעומת 67 ננומטר. דרך טובה יותר לזהות סחיפה היא על ידי השוואת הלוקליזציות כפונקציה של זמן IE, לראות אם הלוקליזציות במסגרות המאוחרות יותר נעקרות בהשוואה לאלו שבפריימים מוקדמים.

ניתן לראות זאת בבירור במקרה של חוטי אקטין כאשר הם מוצגים עם קוד צבע. באמצעות תכונת המעקב אחר התיבה בסופת גשם, כפי שמוצג בפאנלים B ו-c, לוקליזציות מוצגות בצבע המתאים למספר המסגרת של מועד רכישתן. לדוגמה, לוקליזציות מתחילת רצף הרכישה הן כחולות ואילו לוקליזציות מרצף רכישה מאוחר הן אדומות.

הצבעים שנעקרו מצביעים על כך שהתרחשה סחיפה על מנת למדוד ולתקן. עבור חרוזי פלואורסצנט נסחפים בקוטר 100 ננומטר יכולים לשמש כסמנים פידוציאליים מספרים אחד עד ארבע מציגים חרוזים חתוכים ומוגדלים בנפרד. בדוגמה שבה יש סחיפה חמורה יחסית של כ-100 ננומטר במהלך שלוש דקות, 10 שניות במהלך שלב הרכישה, ניתן להשתמש באותה תכונת מעקב קופסה כדי לצבוע ולאשר שהסחיפה התרחשה מכיוון שכל ארבעת החרוזים בדוגמה זו מוצגים כמעט זהה, ניתן לבחור אחד מהם במקרה זה חרוז שניים לשימוש כהתייחסות ולהחסיר את הסחיפה מהחרוזים האחרים.

השוואה לפאנל E מראה שהסחיפה הרוחבית תוקנה. לבסוף, ניתן להשתמש בתאי עקבה מוכתמים בגורם גדילה אפידרמלי כדי לתת דוגמה מציאותית לרזולוציית תמונה. בתאים פאנל A מציג תמונה מוגבלת עקיפה של חלק מתא hela ממוקד במשטח התא הבסיסי שבו התיבות הצהובות מציינות אזורי עניין מוגדלת המוצגים בפאנלים B ו-C בניגוד לאזורי העניין המוגדלים הלא ברורים בתמונה המוגבלת של העקיפה.

התמונות ברזולוציה גבוהה צריכות להראות תערובת של אשכולות מדי פעם פיקסלים בודדים מבודדים. הצבירים יהיו בקוטר של כ-100 ננומטר וסביר להניח שיתאימו להיווצרות בורות ושלפוחיות. המסלול שדרכו EGF מווסת בעיקר ולוקליזציות אנדוציטוזיות לנתוני מסגרת מפאנל D מוצגים בגרף G.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין כמה דגימות בדיקה פשוטות, לרכוש נתונים ולשחזר סערה באיכות גבוהה, ראה תמונות ברזולוציה.

שיטות אלו יעזרו להימנע מכמה מלכודות התאמה נפוצות כגון סחיפה, ויעזרו לייעל את הסערה שלך. ראה ניסויי רזולוציה.