ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע Galvan Axxis, בדיקה להערכת הנדידה הכיוונית של תאים בשדה חשמלי מופעל. זה מושג על ידי הרכבה תחילה ולאחר מכן זריעה של תא גלבאן אקססיס עם התאים המעניינים. בשלב השני, החדר אטום ומופעל שדה חשמלי להדמיית זמן-lapse.

בשלב האחרון, עוקבים אחר מהירות הנדידה של תאים בודדים והזווית ביחס לשדה החשמלי. בסופו של דבר חותם. ניתן להשתמש בהם כדי להראות כיצד התאים מגיבים לשדה החשמלי והאם הם נודדים בכיוון לקתודה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אחזור התאים הקל לאחר מתן טקסס לניתוח משני והקלות שבה ניתן לצלם את הנדידה בהגדלה גבוהה ועם תאים מסומנים פלואורסצנטיים. הדמיה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבי הרכבת תא ללא הדגמה להרכיב את התאים התחתונים. התחל בניגוב תא ציר גלוון מפלסטיק עם שני פרופנולים.

לאחר מכן השתמש במזרק כדי למרוח סילר סיליקון בדרגה ימית סביב הפתחים העגולים בצד התחתון של החדר. מסדרים כיסוי גדולה מעל חומר האיטום ולוחצים אותה למקומה עם קצה מוליך כותנה, מנגבים את עודפי הדבק בעזרת צמר גפן. לאחר מכן השתמש בטוש נקודת יהלום כדי לחתוך זכוכית כיסוי קטנה כדי ליצור רווחים של שישה על 25 מילימטר ולהפוך את החדר.

לאחר מכן, השתמש במזרק כדי למרוח שני פסים של סיליקון, וליצור משטח תעלה בגודל 10 על 25 מילימטר לחיבור תאים בין שני הפתחים העגולים בזכוכית התחתונה. לאחר מכן הדביקו שני חללי זכוכית בין הפתחים העגולים, דחפו את החללים כלפי מטה בעזרת מוליך כותנה חדש ונגבו את עודפי הדבק כפי שהודגם זה עתה. נסה את החדר למשך 24 שעות עד לריפוי.

למחרת, יש להשרות את החדר במים מזוקקים למשך הלילה כדי להסיר את שאריות החומצה האצטית מהדבק לפני זריעת התאים על החדר. יבש ונגב את התאים עם שני פרופנול כפי שהודגם זה עתה. שטפו אותם עם PB S3 סטרילי פעמים ואז בדקו את זרימת הנוזל בין שני הפתחים העגולים בתאים.

לאחר אישור התאים במצב תקין, סגרו אותם בכלי תרבית סטריליים והניחו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. בזמן שהתאים מאזנים, נתק את תאי הערמונית מצלחת התרבית שלהם עם חמישה מיליליטר טריפסין EDTA ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, נטרל את התגובה עם חמישה מיליליטר של 10% FBS.

ב-PBS, העבירו את התאים המנותקים לצינורות של 15 מיליליטר ולאחר מכן צנטריפוגה למשך חמש דקות. בשעה 200 פעמים, G, שאפו את המדיום ואז השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום. לאחר מכן, לאחר ספירת התאים, התאם את ריכוז התאים לשמונה על 10 לארבעת התאים למיליליטר עם מדיום תרבית וזרע.

350 מיקרוליטר של תרחיף התאים על כל תא. דגרו את התאים בתא למשך הלילה בצלחת תרבית עם מגבון קים רטוב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, התחל להרכיב את התאים העליונים על ידי חימום תחילה של 10 מיליליטר תרבית, בינונית עד 37 מעלות צלזיוס לכל תא AXS גלוון.

בזמן שהמדיה מתחממת, העבירו תא Galvan axxis מהחממה לצלחת חימום של 37 מעלות צלזיוס ושטפו את החדר במדיום תרבית. כדי להסיר את התאים הלא מחוברים, השאירו 400 מיקרוליטר של מדיום בתא ולאחר מכן השתמשו במזרק כדי למרוח שומן ואקום גבוה על גבי שני חללי הזכוכית. אטמו את החדר בעזרת זכוכית כיסוי ומוליך כותנה, ואז יבשו את משטח הזכוכית.

לאחר מכן, מרחו את שומן הוואקום הגבוה בעזרת מזרק כדי לאטום את הפער בין זכוכית הכיסוי לתא. ואז להוסיף את מדיום התרבות למאגרים הפנימיים. הסר בועות ובדוק את זרימת הנוזל בין המאגרים.

כדי להפוך את גשרי האגר חותכים זוג צינורות PVC בגודל שני אינץ ', הופכים אותם ואז מניחים את החלקים בכוס של 100 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 מיליגרם של אגר בוהן בקט לבקבוק של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר מדיום תרבית להכנת ג'ל אגר 2%. לאחר מיקרוגל למשך 30 שניות, השתמש בפיפטה העברה כדי להעמיס את ג'ל האגר לתוך צינור הפלסטיק והשאיר את גשרי האגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי למצק את האגר.

לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של מדיום תרבית למאגרים החיצוניים של תא הגל, והכנס את גשרי האגר למאגרי המדיום הפנימיים והחיצוניים כדי להוליך את הזרם לביצוע הדמיית זמן-lapse של הנדידה. התחל בהעברת תא הגלוואן לתא סביבתי של 37 מעלות צלזיוס בשלב המיקרוסקופ, אבטחת החדר עם סרט והתמקדות בתאים תחת מטרה של פי 10. לאחר מכן, הכנס את האלקטרודות של Galvan Axxis למאגרים החיצוניים עם הקתודה בצד ימין, ואבטח את החוט והאלקטרודות בעזרת סרט.

לאחר מכן הפעל את תיבת החשמל כדי להפעיל שדה חשמלי על החדר, והשתמש במד מתח כדי למדוד את מתח המוצא על פני החדר כדי להגיע ל-2.5 וולט עבור התא באורך 25 מילימטר. כעת בחר 10 נקודות ברחבי החדר ליצירת 10 סרטוני דולג זמן, והגדר את תנאי הרכישה למרווחים של 10 דקות למשך שעתיים. לאחר מכן התחל לצלם והתאם את זרם הפלט לפי הצורך כדי לשמור על חוזק השדה במהלך הניסוי.

בסיום הניסוי יש להסיר את החדר מהבמה ולקבע את התאים ב-95% אלכוהול. ואז לשבור את החדר. ניתן לשמור את תלוש הכיסוי למועד מאוחר יותר.

צביעה והדמיה. נקה את החדר לשנים הבאות. כדי לכמת את Galvan Axxis, סובב את סרטי דולג הזמן כדי לכוון את הקתודה לראש התמונות.

ייצא את הסרטים לתוכנת מעקב התאים ועקוב ידנית אחר מיקום ה-XY של 10 עד 20 תאים בכל נקודת זמן מכל סרט, מרחקי הנדידה והזוויות ביחס לכיוון צפון דרום, אותו כיוון של השדה החשמלי יחושב בתוכנת מעקב התאים. לבסוף, שמור את המדידות וייבא את הנתונים ליישום מסד נתונים כדי לחשב את התוצאות המשולבות. בניסוי מייצג זה של Galvan Axxis לשורות של תאי ערמונית נקבע כי הם נודדים במהירויות דומות במהלך שעתיים.

עם זאת, הכיווניות לשדה החשמלי הייתה 0.7 פלוס מינוס 0.3 עבור ה-PRNS קו אחד, ו-0.2 פלוס מינוס 0.8 עבור קו ה-PNT השני, מה שמצביע על הבדל משמעותי בציר הגלוון של שני קווי התאים הללו, מה שמרמז על מנגנוני האיתות התאיים שלהם מכוונים תגובות הגירה דיפרנציאליות לשדה החשמלי לאחר פיתוח שיטת גובן טקסס. טכניקה זו מסייעת לחוקרים לחקור את המנגנונים של נדידת תאים כיוונית בשדה האלקטרו.