Name: ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: חקור נדידה כיוונית של תאי ערמונית בשדה חשמלי באמצעות לשכת גלוונוטקסיס מותאמת אישית. השיטה מאפשרת מעקב אחרי מהירות וזווית הנדידה של תאים בזמן אמת ומסייעת להבנת התנהגות תאית בסרטן הערמונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

שורות תאי ערמונית ניתנות באדיבות על ידי ד&quot;ר לינג-יו וואנג וינג אי-ד&quot;ר Jien קונג במרכז לחקר הסרטן, UC Davis. פרויקט זה נתמך על ידי מענק galvanotaxis NIH 4R33AI080604.

1. תאי culturing ערמונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות pRNS-1-1 וערמונית PNT2 תאים על 100 מנות תרבות מ"מ במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקת antimycotic על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. רענן מדיום התרבות בכל יום עד שהתאים מגיעים 80% confluency לניסויי galvanotaxis. </li></ol> 2. צ'יימברס Galvanotaxis הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבת תאים תחתון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב קאמרי galvanotaxis פלסטיק עם 2-propanol. החל אוטם סיליקון הכיתה הימי סביב הפתחים עגולים בצד התחתון של קאמרי עם מזרק ולצרף coverglass גדול (איור 1). השתמש בצד האחורי של המוליך כותנה לדחוף את coverglass ולנגב את הדבק העודף עם צמר גפן. הפתחים עגולים יאפשר בינוני והזרם חשמלי לזרום על התאים הממוקמים בין שני המאגרים בינוניים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך coverglass קטן כדי להפוך את 6 מ"מ x 25 מפרידי מ"מ עם סמן נקודת יהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התא. החל 2 פסים של דבק סיליקון עם מזרק ו / או מרית מתכת, כדי ליצור משטח ערוץ x 25 מ"מ 10 מ"מ לקובץ מצורף תא בין 2 הפתחים עגולים על הזכוכית התחתונה. דבק 2 חתיכות של spacer זכוכית בין 2 הפתחים עגולים. השתמש בצד האחורי של החלת מהכותנה לדחוף את מפרידי ולנגב את הדבק העודף עם צמר גפן ו / או קיסמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את התא למשך 24 שעות עד שדבק סיליקון הוא נרפא. משרים את התא בלילה מים מזוקק כדי להסיר את שאריות חומצה אצטית מהדבק. ייבש את התא לשימוש מיידי, או לאחסן את התא לשימוש מאוחר יותר במכל נקי. <img alt="תרשים הגדרת תא Galvanotaxis המפרט הרכבה עם מרווחי זכוכית, זכוכית כיסוי תחתונה." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 1"> איור 1: עצרת של תא galvanotaxis התחתון. ) Coverglass גדול מחובר לחלק התחתון של חדר נקי. B) Tוו חתיכות של מפרידי זכוכית מודבקות בין 2 הפתחים עגולים כדי ליצור x 25 מ"מ ערוץ 10 מ"מ לתאים לצרף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריעת תאים בתאי galvanotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מספרם של התאים דורשים galvanotaxis הדרושים לניסוי. שורת תאים כל טיפול או דורשת קאמרית galvanotaxis יחיד. נגב את תאי galvanotaxis עם 2-propanol. לשטוף את התאים עם PBS 3 פעמים סטריליים ולבדוק את זרימת הנוזל בין 2 הפתחים עגולים בתאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקף את התאים בצלחות תרבית תאים סטריליים ולאפשר להם לאזן על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לנתק את תאי ערמונית ממנת התרבות שלהם באמצעות 5 מיליליטר 0.25% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין-EDTA עם FBS 5 מיליליטר של 10% בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי 15 מיליליטר צינורות וצנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 200 XG, 37 ° C. לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים ב 1 מיליליטר של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 μl של פתרון תא לטעון לחדר ספירה ולחשב את מספר התא. התאם את ריכוז התא עד 8 ​​x 10 4 תאים / מיליליטר עם מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תאי galvanotaxis מתוך 37 ° C החממה. זרעי 350 μl של ההשעיה התא אל תא אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בתאי הלילה בצלחת התרבות עם Kimwipe הרטוב או בתא לחות בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol><img alt="דיאגרמת נדידת תאי ערמונית עם הגדרת חממה לניתוח ניסיוני ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 2"> איור 2:. מתזמן את התאים לתא התא התחתון הוא מיובש וניקה תאי ערמונית) הם trypsinized, נספרו ומועברים לתא וטופחו לילה B) coverglass עליון מחובר ללאטום את החדר לפני צילומים... <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">ssembling תאים העליונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התא העליון לפני צילומים. מיקרוסקופ יכול להכיל רק הדמיה קאמרית galvanotaxis אחת בכל פעם. להתחמם 10 מיליליטר של מדיום התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך כל תא galvanotaxis. העבר את תא galvanotaxis מהחממות לצלחת התחממות 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים עם מדיום התרבות להסיר את התאים הפנויים. השאר 400 μl של מדיום בתא. השתמש במזרק ללמרוח משחה ואקום גבוהה על גבי שני מפרידי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverglass קטן לאטום את החדר. לחץ בעדינות במורד coverglass עם הצד האחורי של המוליך כותנה. נגב את המדיום העודף עם צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את משטח הזכוכית ולמרוח משחה ואקום גבוהה כדי לאטום את הפער בין coverglass והקאמרי. השתמש במרית מתכת כדי להפיץ את השומן. הוסף 4 מיליליטר של מדיום התרבות למאגרים הפנימיים ולבדוק את זרימת הנוזל בין המאגרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אגרגשרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך זוג צינורות PVC הארוך 2 אינץ '(503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 כותל), להפוך ולהכניס אותם לתוך כוס מיליליטר 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד 200 מ"ג Bacto-אגר ולהוסיף אותו בבקבוק 50 מיליליטר עם מדיום תרבות 10 מיליליטר כדי להפוך 2% ג'ל אגר. מיקרוגל למשך 30 שניות. טען את הג'ל אגר לצינורות פלסטיק עם pipet העברה. השאר את אגר גשרים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות כדי לחזק את אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני תרבות 2 מיליליטר למאגרים החיצוניים של תא galvanotaxis. הכנס את אגר גשרים למאגרים בינוניים הפנימיים וחיצוניים לנהל הנוכחי. </li></ol></li></ol><img alt="דיאגרמת ניסוי Galvanotaxis המציגה הגדרת תא עם גשרי אגר וכוח DC לנדידת תאים." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 3"> איור 3:. צילומי התאים בתא תרשים כדי להדגים את ההרכבה הסופית של חדר galvanotaxis. התא אטום לחלוטין עם גריז ואקום גבוה. בינוני מתווסף to למלא את המאגרים, ושני גשרים אגר מוכנסים לתוך התא. אז קאמרי galvanotaxis מועבר לבמה מיקרוסקופ ואלקטרודות מחוברות ליישם השדה החשמלי. צדתי להציג של חדר galvanotaxis התאסף מוצג על מנת להוכיח כי הזרם החשמלי זורם על התאים באמצעות הגשרים אגר והרווח בין הזכוכית המכסה. הדמיה 3. זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התא הסביבתי על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 בשעת האוויר במחזור 2 לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על המיקרוסקופ וליזום את תוכנת רכישת התמונה. כייל את הבמה מיקרוסקופ ובחר את מטרת 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תאי galvanotaxis לבמה מיקרוסקופ, לאבטח את החדר עם קלטת ולהתמקד בתאים. הכנס את האלקטרודות galvanotaxis למאגרים החיצוניים עם קתודה בצד ימין. לאבטח את החוט ואלקטרודות עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את bo הכחx ליישם שדה חשמלי לתא. מדוד את מתח הפלט עם מד המתח על פני התא להגיע 2.5 וולט לתא 25 מ"מ הארוך (100 mV / מ"מ). לשמור על עוצמת השדה במהלך הניסוי על ידי התאמת התפוקה הנוכחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10 נקודות על פני התא לצלם בתוכנה כדי ליצור עשרה זמן לשגות סרטים. להגדיר את תנאי רכישה במרווחים של 10 דקות לשעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל צילומים ולהתאים את התפוקה הנוכחית במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הניסוי, להסיר את התא מהבמה ולתקן את התאים עם אלכוהול 95%. לפרוץ את החדר עם סכין גילוח לנקות מחדש להשתמש בו. </li></ol> 4. כימות Galvanotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הזמן לשגות הסרטים ורי-אוריינט הקתודה לחלק העליון של התמונות. לייצא את הסרטים לתוכנת המעקב הסלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני לעקוב (x, y) העמדה של 10-20 תאים בכל נקודת זמן מכל סרט (4 איור, B).מרחקי ההגירה והזוויות ביחס לכיוון צפון-דרום, באותו הכיוון של השדה החשמלי, יחושבו בתוכנת מעקב תא (איור 4C). הערה: מהירות ההגירה הממוצעת מומרת ממרחק ההגירה הכולל וכולל זמן צילומים. כיווניות מומרת מהזוויות לערך קוסינוס. אם תאים לנדוד עם יווניות אקראיות, הממוצע של קוסינוס נטו יהיה קרוב לאפס. אם התאים להעביר ישירות לכיוון הקתודה, ערך קוסינוס יהיה +1. אם התאים להעביר ישירות לכיוון האנודה, ערך קוסינוס יהיה -1. </li></ol><img alt="השוואת נדידת תאים, הגירה אקראית לעומת גלוונוטקסיס, תרשים עם משוואת קוסינוס לכיוון." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 4"> איור 4: מעקב סלולארי למדוד יווניות) כיסוי של קווי מעקב עם תמונות תא.. העמדות (x, y) של התאים manuaמעקב lly בזמן לשגות הסרטים. . אם התאים לנדוד באופן אקראי, קוסינוס הממוצע הוא קרוב לאפס B) עם זאת, אם התאים נודדים לעבר הקתודה או האנודה, הערך של קוסינוס הממוצע הוא קרוב ל+ (קתודה) או -. (האנודה) 1.0 C ) כיווניות מוצגות על ידי ערך קוסינוס, אשר מומר מזוויות ההגירה (θ). קוסינוס (θ) שווה את היחס של המרחק (מרחק הגירה) לb מרחק (המרחק המוקרן לכיוון השדה החשמלי). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את המדידות. לייבא את הנתונים ליישום מסד נתונים כדי לחשב את התוצאות המשולבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים בשילוב של מהירות הגירה ממוצעת וערך קוסינוס הממוצע לגיליון אלקטרוני כדי לתכנן את הגרפים בר (איור 5). </li></ol>

<ol><li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+currents+might+guide+rostral+migration+of+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts.</a> EMBO Rep. 14 (2), 184-190 (2013).</li>
<li>Hotary, K. B., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electrical+currents+and+voltage+gradients+in+Xenopus+embryos+and+the+consequences+of+their+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption.</a> Dev Biol. 166 (2), 789-800 (1994).</li>
<li>Hotary, K. B., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+role+for+endogenous+electrical+fields+in+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development.</a> Development. 114 (4), 985-996 (1992).</li>
<li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+axon+guidance+in+embryonic+retina%3A+galvanotropism+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited.</a> Biochem Biophys Res Commun. 431 (2), 280-283 (2013).</li>
<li>Wood, M. D., Willits, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applied+electric+field+enhances+DRG+neurite+growth%3A+influence+of+stimulation+media%2C+surface+coating+and+growth+supplements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements.</a> J Neural Eng. 6 (4), 046003(2009).</li>
<li>Kucerova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+electrical+signals+in+murine+corneal+wound+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization.</a> J Cell Physiol. 226 (6), 1544-1553 (2011).</li>
<li>Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Dermal+fibroblasts+do+not+exhibit+directional+migration+on+collagen+I+in+direct-current+electric+fields+of+physiological+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength.</a> Exp Dermatol. 12 (4), 396-402 (2003).</li>
<li>Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+cellular+membrane+components+creates+the+directional+cue+guiding+keratocyte+galvanotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis.</a> Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).</li>
<li>Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+migrate+to+the+negative+pole+in+direct+current+electric+fields+comparable+to+those+measured+in+mammalian+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds.</a> J Cell Sci. 109 (1), 199-207 (1996).</li>
<li>Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC+electric+fields+induce+rapid+directional+migration+in+cultured+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells.</a> Exp Eye Res. 70 (5), 667-673 (2000).</li>
<li>Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J Cell Sci. 112 (12), 1967-1978 (1999).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+T+lymphocytes+migrate+toward+the+cathode+of+DC+electric+fields+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices.</a> Lab Chip. 11 (7), 1298-1304 (2011).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).</li>
<li>Wu, D., Ma, X., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC+Electric+Fields+Direct+Breast+Cancer+Cell+Migration%2C+Induce+EGFR+Polarization%2C+and+Increase+the+Intracellular+Level+of+Calcium+Ions.+%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. </a> Cell Biochem Biophys. 67 (3), 1115-1125 (2013).</li>
<li>Martin-Granados, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+PP1%2FNIPP1+in+steering+migration+of+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), 40769(2012).</li>
<li>Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+sodium+channel+mediates+the+directionality+of+galvanotaxis+in+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes.</a> J Cell Sci. 126 (9), 1942-1951 (2013).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).</li>
<li>Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influx+of+extracellular+Ca2%2B+is+necessary+for+electrotaxis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium.</a> J Cell Sci. 119 (22), 4741-4748 (2006).</li>
<li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+of+corneal+epithelial+sheets+in+physiological+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (13), 2548-2558 (1996).</li>
<li>Peng, H. B., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+fucoid+eggs+by+steady+electrical+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields.</a> Dev Biol. 53 (2), 277-284 (1976).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+prostatic+epithelial-cells+immortalized+by+polybrene-induced+DNA+transfection+with+a+plasmid+containing+an+origin-defective+sv40-genome%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome.</a> Int J Oncol. 4 (4), 821-830 (1994).</li>
<li>Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+sv40+in+normal+human+prostatic+epithelial+and+fibroblastic+cells+-+differentiation+pattern+of+non-tumorigenic+cell-lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines.</a> Int J Oncol. 6 (2), 333-343 (1995).</li>
<li>Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPM-FISH%2C+a+new+M-FISH+approach+using+IRS-PCR+painting+probes%3A+application+to+the+analysis+of+seven+human+prostate+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines.</a> Genes Chromosomes Cancer. 30 (2), 143-160 (2001).</li>
<li>Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+requirements+of+prostatic+epithelial+cell+lines+for+acinar+morphogenesis+and+lumen+formation+in+vitro%3A+role+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium.</a> Prostate. 67 (15), 1601-1613 (2007).</li>
<li>Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+epithelial+cell+lines+form+spheroids+with+evidence+of+glandular+differentiation+in+three-dimensional+Matrigel+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures.</a> Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+galvanotaxis+assay+for+analysis+of+neural+precursor+cell+migration+kinetics+in+an+externally+applied+direct+current+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field.</a> J Vis Exp. (68), (2012).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-controlled+directed+migration+of+neural+progenitor+cells+in+2D+and+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Pullar, C. E., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+mediates+keratinocyte+directional+migration+in+an+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field.</a> J Cell Sci. 118 (9), 2023-2034 (2005).</li>
<li>Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imposition+of+a+physiologic+DC+electric+field+alters+the+migratory+response+of+human+keratinocytes+on+extracellular+matrix+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules.</a> J Invest Dermatol. 106 (4), 642-646 (1996).</li>
<li>Feng, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+migration+of+neural+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+by+an+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field.</a> Stem Cells. 30 (2), 349-355 (2012).</li>
<li>Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+array+for+measuring+wound+generated+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Microneedle array for measuring wound generated electric fields.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).</li>
<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הניתוח של תגובת galvanotaxis של תא היה חיווי פונקציונלי חשוב עבור רבים נודדים או צמיחה סלולריות מעבד 27, 28. כאן אנו משתמשים קאמריים מחוייט עם משטח זכוכית לצלם את שתי שורות תאי ערמונית. שורות תאים אלה הפגינו דרגות שונות של galvanotaxis, ואנחנו משערים כי הלוקליזציה תאית או ההפעלה של החלבונים מתווכים-galvanotaxis עלולה להתנגש בתהליך של יצירת שורות תאים האלמותיות, וכתוצאה מכך ההבדל שנצפה בתגובת galvanotaxis. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt...

שדות חשמליים אנדוגני מתגלים ברקמות שונות, כגון עור 1, 32, 33 ומוח 2. השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כוללים פיתוח בימוי עובר 3, 4, המנחה את תולדה של תהליכים עצביים 5, 6 וקידום סגירת אפיתל קרני ופצע 1, 7. במבחנה, יישום של שדה חשמלי נוכחי ישיר לתאים בתרבית מחקה את השדה החשמלי הפיזיולוגי וגורם הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. Galvanotaxis נחקר בfibroblasts 8, קרטינוציטים דגים 9, אפיתל אדם וקרטינוציטים קרנית 10-12, לימפוציטים מסוג 13, neuroblasts 2, ובתאים עצביים 14. כאשר נחשפו לשדה המופעל, רוב התאים למדו להעביר directionally כלפי cathodal (-) הקוטב. ובכל זאת, כמה תאי סרטן, כוללים מאוד גרורתיתאי סרטן השד אנושיים ושורת תאי סרטן הערמונית האנושית PC-3M, לעבור לanodal (+) קוטב 15, 16. מספר מנגנונים מוצעים לתווך galvanotaxis או להסביר את היכולת של התאים לחוש את השדה החשמלי, כולל הפעלה של EGF קולטני 12, ערוץ נתרן אפיתל 17, PI3K וPTEN 18, ושחרורו של סידן יונים 15, 19. המנגנון הוא עדיין לא הבין באופן מלא וזה אפשרי, כי מסלולי איתות מרובים מעורבים בgalvanotaxis. שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שימושית כדי לאפיין את ההגירה כיוונית של חסיד, תאי ניעתי, או כדי לפקח על הגירת תאים בודדת 10, 12, 17 או הגירה של גיליון של תאים ומחוברות 18, 20. טכניקה זו שונה מ פנג והיפה 21, וNishimura et al. 10 עם, תאי PVC ברורים מחוייט, עם coversl הנשלףשב&quot;ס מאפשר לאחזור תא קל לאחר galvanotaxis לניתוח משני, כגון הדמיה חיסונית הקרינה. משטח הזכוכית של תאי galvanotaxis הוא אופטי תואם, המאפשר לצלם בהגדלה גבוהה ועם תאי fluorescently שכותרתו. זה גם מאפשר עיצוב ניסיוני עם שינוי של משטח הזכוכית, כגון שינוי ציפוי פני השטח או חיובים. מפרידי עשויים מס &#39;1 coverglass משמשים בתאי כדי למזער את הזרימה הנוכחית על התאים; לכן חימום ג&#39;אול, שהוא פרופורציונאלי לריבוע של הזרימה הנוכחית, לא לחמם יותר מדי את התאים במהלך הניסוי. הגשרים אגר החיבור למנוע מגע ישיר של אלקטרודות עם התאים ולמנוע שינוי של pH הבינוני או ריכוז יון בgalvanotaxis. שתי שורות תאי ערמונית אנושית שאינם סרטניות נבדקו לתגובת galvanotaxis במחקר זה. PRNS-1-1 22 וPNT2 23 שניהם SV40-הונצחו, שורות תאי גורם תלוי צמיחה המבטאות את סמני אפיתל cytokeratin 5, 8, 18 ו -19 עם ביטוי נמוך או לא של אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA). שני שורות התאים לשמור על מורפולוגיה המצולעים של תאי האפיתל נורמלים, אבל הנורמליות של כרומוזום נצפתה בkaryotyping 22, 24. למרות שpRNS-1-1 וPNT2 לשתף התנהגויות דומות ברוב הניסויים, הם עושים להראות הבדלים במבנה של מבנה acinar וב galvanotaxis. על מטריצת 3-D, Matrigel, pRNS-1-1 תאים ליצור מבני acinar חלולים עם לומן הדומה לרקמת בלוטת הערמונית הרגילה 25. עם זאת, תאי PNT2 יוצרים spheroids המוצק ללא לומן או אפיתל המקוטב 26. תאי pRNS-1-1 גם להפגין תגובת galvanotactic גבוהה מPNT2 במחקר הנוכחי. המתאם בין ההיווצרות של מבנה acinar וgalvanotaxis בpRNS-1-1 מצביע על כך שאותות galvanotactic עשויים לשחק תפקיד בארגון יחסי הציבורתנועות ostate בלוטת רקמה בתגובה לשדות חשמליים אנדוגני, ומספקת מאפיינים נוספים להפלות בין 2 שורות תאים אלה.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><תאים חזקים></חזקים></td></tr><tr><td>pRNS-1-1 תאי</td><td></td><td></td> ערמונית <td>Lee, et al. (1994)</td></tr><tr><td>תאי ערמונית PNT2</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, et al. (1995)</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>בינוני ותמיסות</חזק></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>להתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% ב-PBS, לחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td><td>להוסיף 5 מ"ל ל-500 מ"ל בינוני</td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td>-</td><td>137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 4.3 מ"מ Na<>sub2HPO4 ו-1.5 מ"מ KH2PO4 ב-1,000 מ"ל של H2 O, pH עד 7.4 ואוטוקלאב, מתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>להתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש, יש לטפל בתאים במשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות; C</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>מכשיר Galvanotaxis</חזק></td></tr><tr><td>תאי Galvanotaxis</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>תאי PVC שקופים ולא רעילים. אנא צור קשר עם המחברים לקבלת מפרט העיצוב.</td></tr><tr><td>אלקטרודות Galvanotaxis</td> חנות <td></td><td>חשמלית UCD</td><td>אלקטרודות מפותלות פלטינה עם כבלים גמישים</td></tr><tr><td>תיבת חשמל Galvanotaxis</td><td>הנדסת מצעים, קליפורניה</td><td></td><td>תפוקת מתח DC בעיצוב מותאם אישית עם מד מתח</td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית, גדולה, 45 x 50 מ"מ, מס' 1.5</td><td>פישר</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית, קטנה, 25 x 25 מ"מ, מס' 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>סמן נקודת יהלום</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>אוטם סיליקון בדרגה ימית, שקוף</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>גריז ואקום גבוה</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 6 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Nichiryo, 1.5 מ"ל</td><td>Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים כותנה</td><td>מוצרים רפואיים פורטיאן</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>ג'ונסון & ג'ונסון</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180 צינורות PVC&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>make 2% agar</td></tr> solution <tr><td>Razor</td><td>Blade Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" >Equipments and Software</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>מופעל עם רוטור A-4-62</td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4</td><td>Nexcelom</td><td>אוטומטי T4</td><td></td></tr><tr><td>תאי ספירת תאים</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>עומס 20 & #956; l פתרונות תאים לספירת</td></tr><tr><td>צלחת חימום טמפרטורת תרבות</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>כדי לשמור על תאי הגלוונוטקסיס ב-37 מעלות; C&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Eclipse TE-2000 עם במה ממונעת ותא סביבתי</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30 אובייקטיבי מצלמת</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX CCD&nbsp;</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Cooled CCD camara, מונו-צבע, 12 סיביות</td></tr><tr><td>אוויר דחוס עם 5% CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td>הזמנה מיוחדת</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Image רכישת תוכנה</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Cell תוכנת מעקב ומותאמת אישית למדידת זוויות נדידה</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced, 8.0</td><td>יוצר</td><td></td><td></td>קבצים</tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 עבור Mac</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניצול לשכות galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כגון בימוי נדידת תאים בפיתוח עובר, תולדה עצבית וריפוי פצע אפיתל. הפעלת שדה חשמלי של זרם ישיר לתאים בתרבית במבחנה גורמת הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שונה עם פולי מחוייט (ויניל כלוריד) (PVC) תאים, משטח זכוכית, אלקטרודות פלטינה והשימוש בבמה ממונעת שבו התאים הם צילמו. תאי PVC ואלקטרודות פלטינה להציג cytotoxicity נמוך והם סבירים ומחדש שמישים. משטח הזכוכית והבמה מיקרוסקופ הממונעת לשפר את האיכות של תמונות ומאפשרים שינויים אפשריים למשטח הזכוכית וטיפולים לתאים. אנחנו צילמנו את galvanotaxis של שני קווים שאינם סרטניים-הונצח SV40 ערמונית תא, pRNS-1-1 וPNT2. שתי שורות תאים אלה מראות מהירויות הגירה דומות ושניהם נודדים לעברהקתודה, אבל הם עושים להראות במידה שונה של יווניות בgalvanotaxis. התוצאות שהתקבלו באמצעות פרוטוקול זה מצביעים על כך שpRNS-1-1 ושורות תאי PNT2 עשוי להיות מאפיינים מהותיים שונים המסדירים תגובות הנדידה כיוונית שלהם.

שתי שורות של תאי ערמונית (pRNS-1-1 וPNT2) נחקרו בשיטה זו. תאים בשני הקווים להעביר במהירויות דומות של 1.0 +/- 0.3 מיקרון / min במהלך 2 שעות (איור 5 א). עם זאת, כיווניות לשדה החשמלי היא 0.7 +/- 0.3 לpRNS-1-1 הקו, ו -0.2 +/- 0.8 לקו PNT2 (איור 5). התוצאות מראות הבדל משמעותי בgalvanotaxis של שתי שורות תאים אלה (p &lt;0.01, 100 תאים היו במעקב), המצביע על כך שיש להם מנגנוני איתות תאיים שונים הגורמים לתגובות שונות כיוונית לרמזים positional. <p class=...

אנו מציגים שיטה ליישום שדה חשמלי פיזיולוגי על תאי ערמונית נודדים ואימורטליים בתא גלוונוטקסיס מותאם אישית. באמצעות שיטה זו, אנו מדגימים כי 2 קווים של תאי ערמונית לא גידוליים מדגימים דרגות שונות של כיווניות נדידה בשדה.

ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע Galvan Axxis, בדיקה להערכת הנדידה הכיוונית של תאים בשדה חשמלי מופעל. זה מושג על ידי הרכבה תחילה ולאחר מכן זריעה של תא גלבאן אקססיס עם התאים המעניינים. בשלב השני, החדר אטום ומופעל שדה חשמלי להדמיית זמן-lapse.בשלב האחרון, עוקבים אחר מהירות הנדידה של תאים בודדים והזווית ביחס לשדה החשמלי. בסופו של דבר חותם. ניתן להשתמש בהם כדי להראות כיצד התאים מגיבים לשדה החשמלי והאם הם נודדים בכיוון לקתודה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אחזור התאים הקל לאחר מתן טקסס לניתוח משני והקלות שבה ניתן לצלם את הנדידה בהגדלה גבוהה ועם תאים מסומנים פלואורסצנטיים. הדמיה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבי הרכבת תא ללא הדגמה להרכיב את התאים התחתונים. התחל בניגוב תא ציר גלוון מפלסטיק עם שני פרופנולים.לאחר מכן השתמש במזרק כדי למרוח סילר סיליקון בדרגה ימית סביב הפתחים העגולים בצד התחתון של החדר. מסדרים כיסוי גדולה מעל חומר האיטום ולוחצים אותה למקומה עם קצה מוליך כותנה, מנגבים את עודפי הדבק בעזרת צמר גפן. לאחר מכן השתמש בטוש נקודת יהלום כדי לחתוך זכוכית כיסוי קטנה כדי ליצור רווחים של שישה על 25 מילימטר ולהפוך את החדר.לאחר מכן, השתמש במזרק כדי למרוח שני פסים של סיליקון, וליצור משטח תעלה בגודל 10 על 25 מילימטר לחיבור תאים בין שני הפתחים העגולים בזכוכית התחתונה. לאחר מכן הדביקו שני חללי זכוכית בין הפתחים העגולים, דחפו את החללים כלפי מטה בעזרת מוליך כותנה חדש ונגבו את עודפי הדבק כפי שהודגם זה עתה. נסה את החדר למשך 24 שעות עד לריפוי.למחרת, יש להשרות את החדר במים מזוקקים למשך הלילה כדי להסיר את שאריות החומצה האצטית מהדבק לפני זריעת התאים על החדר. יבש ונגב את התאים עם שני פרופנול כפי שהודגם זה עתה. שטפו אותם עם PB S3 סטרילי פעמים ואז בדקו את זרימת הנוזל בין שני הפתחים העגולים בתאים.לאחר אישור התאים במצב תקין, סגרו אותם בכלי תרבית סטריליים והניחו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. בזמן שהתאים מאזנים, נתק את תאי הערמונית מצלחת התרבית שלהם עם חמישה מיליליטר טריפסין EDTA ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, נטרל את התגובה עם חמישה מיליליטר של 10% FBS.ב-PBS, העבירו את התאים המנותקים לצינורות של 15 מיליליטר ולאחר מכן צנטריפוגה למשך חמש דקות. בשעה 200 פעמים, G, שאפו את המדיום ואז השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום. לאחר מכן, לאחר ספירת התאים, התאם את ריכוז התאים לשמונה על 10 לארבעת התאים למיליליטר עם מדיום תרבית וזרע.350 מיקרוליטר של תרחיף התאים על כל תא. דגרו את התאים בתא למשך הלילה בצלחת תרבית עם מגבון קים רטוב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, התחל להרכיב את התאים העליונים על ידי חימום תחילה של 10 מיליליטר תרבית, בינונית עד 37 מעלות צלזיוס לכל תא AXS גלוון.בזמן שהמדיה מתחממת, העבירו תא Galvan axxis מהחממה לצלחת חימום של 37 מעלות צלזיוס ושטפו את החדר במדיום תרבית. כדי להסיר את התאים הלא מחוברים, השאירו 400 מיקרוליטר של מדיום בתא ולאחר מכן השתמשו במזרק כדי למרוח שומן ואקום גבוה על גבי שני חללי הזכוכית. אטמו את החדר בעזרת זכוכית כיסוי ומוליך כותנה, ואז יבשו את משטח הזכוכית.לאחר מכן, מרחו את שומן הוואקום הגבוה בעזרת מזרק כדי לאטום את הפער בין זכוכית הכיסוי לתא. ואז להוסיף את מדיום התרבות למאגרים הפנימיים. הסר בועות ובדוק את זרימת הנוזל בין המאגרים.כדי להפוך את גשרי האגר חותכים זוג צינורות PVC בגודל שני אינץ ', הופכים אותם ואז מניחים את החלקים בכוס של 100 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 מיליגרם של אגר בוהן בקט לבקבוק של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר מדיום תרבית להכנת ג'ל אגר 2%. לאחר מיקרוגל למשך 30 שניות, השתמש בפיפטה העברה כדי להעמיס את ג'ל האגר לתוך צינור הפלסטיק והשאיר את גשרי האגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי למצק את האגר.לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של מדיום תרבית למאגרים החיצוניים של תא הגל, והכנס את גשרי האגר למאגרי המדיום הפנימיים והחיצוניים כדי להוליך את הזרם לביצוע הדמיית זמן-lapse של הנדידה. התחל בהעברת תא הגלוואן לתא סביבתי של 37 מעלות צלזיוס בשלב המיקרוסקופ, אבטחת החדר עם סרט והתמקדות בתאים תחת מטרה של פי 10. לאחר מכן, הכנס את האלקטרודות של Galvan Axxis למאגרים החיצוניים עם הקתודה בצד ימין, ואבטח את החוט והאלקטרודות בעזרת סרט.לאחר מכן הפעל את תיבת החשמל כדי להפעיל שדה חשמלי על החדר, והשתמש במד מתח כדי למדוד את מתח המוצא על פני החדר כדי להגיע ל-2.5 וולט עבור התא באורך 25 מילימטר. כעת בחר 10 נקודות ברחבי החדר ליצירת 10 סרטוני דולג זמן, והגדר את תנאי הרכישה למרווחים של 10 דקות למשך שעתיים. לאחר מכן התחל לצלם והתאם את זרם הפלט לפי הצורך כדי לשמור על חוזק השדה במהלך הניסוי.בסיום הניסוי יש להסיר את החדר מהבמה ולקבע את התאים ב-95% אלכוהול. ואז לשבור את החדר. ניתן לשמור את תלוש הכיסוי למועד מאוחר יותר.צביעה והדמיה. נקה את החדר לשנים הבאות. כדי לכמת את Galvan Axxis, סובב את סרטי דולג הזמן כדי לכוון את הקתודה לראש התמונות.ייצא את הסרטים לתוכנת מעקב התאים ועקוב ידנית אחר מיקום ה-XY של 10 עד 20 תאים בכל נקודת זמן מכל סרט, מרחקי הנדידה והזוויות ביחס לכיוון צפון דרום, אותו כיוון של השדה החשמלי יחושב בתוכנת מעקב התאים. לבסוף, שמור את המדידות וייבא את הנתונים ליישום מסד נתונים כדי לחשב את התוצאות המשולבות. בניסוי מייצג זה של Galvan Axxis לשורות של תאי ערמונית נקבע כי הם נודדים במהירויות דומות במהלך שעתיים.עם זאת, הכיווניות לשדה החשמלי הייתה 0.7 פלוס מינוס 0.3 עבור ה-PRNS קו אחד, ו-0.2 פלוס מינוס 0.8 עבור קו ה-PNT השני, מה שמצביע על הבדל משמעותי בציר הגלוון של שני קווי התאים הללו, מה שמרמז על מנגנוני האיתות התאיים שלהם מכוונים תגובות הגירה דיפרנציאליות לשדה החשמלי לאחר פיתוח שיטת גובן טקסס. טכניקה זו מסייעת לחוקרים לחקור את המנגנונים של נדידת תאים כיוונית בשדה האלקטרו.

utilizing-custom-designed-galvanotaxis-chambers-to-study-directional

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זמן לשגות הדמיה של התרבות רקמת 3D מאפשר ללמוד התנהגות הנדידה של תאים בודדים שמקורם רוממות ganglionic בתגובה תמצית חלבון מופרדים מן קליפת המוח.

התנהגות הנדידה של תאים שנוצר תרבויות רוממות Ganglionic

גישה לנתח את ההגירה של תאים (תאי explanted רכס עצביים גזע) הוא תאר. שיטה זו היא זולה, עדינה, ומסוגלת להבחין chemotaxis משני chemokinesis והשפעות אחרות על קוטביות נדידה כגון אלה נגזרים מאינטראקציות תא תא בתוך התרבות העיקרית הגזע עצבי פסגת התא.

ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

שיטה כמותית ללימודי הגירה ספונטנית של תאים בmicroenvironment מרותק חד ממדי מתוארת. שיטה זו מנצלת את ערוצי microfabricated והוא יכול לשמש כדי לחקור הגירה של מספר הגדול של תאים בתנאים שונים בניסויים אחת.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

נדידת תאים היא חלק חשוב בהתפתחות ובחיים האנושיים. על מנת להבין את המנגנונים שיכולים לשנות את נדידת התאים, אנו מציגים מערכת דיפוזיה של שיפוע מישורי כדי לחקור כימוטקסיס במטריצת קולגן תלת מימדית, המאפשרת להתגבר על מגבלות תא הדיפוזיה המודרניות של מבחנים קיימים.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

מכשירים מיקרופלואידיים רבים פותחו לשימוש בחקר אלקטרוטקסיס. עם זאת, אף אחד מהשבבים הללו אינו מאפשר מחקר יעיל של השפעות השדה הכימי והחשמלי בו-זמנית (EF) על התאים. פיתחנו מכשיר מבוסס פולימתיל-מתאקרילט המציע EF דו-קיום מבוקר טוב יותר וגירוי כימי לשימוש במחקר אלקטרוטקסיס.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

מבחני chemotaxis חזותיים חיוניים להבנה טובה יותר של איך איקריוטיים תאים לשלוט נדידת תאים כיוונית בתיווך chemoattractant. כאן אנו מתארים שיטות מפורטות: 1) בזמן אמת, ניטור ברזולוציה גבוהה של מבחני chemotaxis מרובים, ו -2) בו זמנית לדמיין את שיפוע chemoattractant ואת דינמיקת spatiotemporal של איתות אירועים בתאי HL60 דמוי נויטרופילים.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

פרוטוקול זה מפרט שיטה להתאמה אישית למדוד נדידת תאים בתגובת chemoattractants שעשוי לשמש גם כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס.

תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

כאן, אנו מתארים טכניקות הדמיה לחיות תאים למדוד באופן כמותי את ההעברה ואת הפלישה בתאי גזע המוח גידול גליובלסטומה לאורך זמן, תחת תנאים מרובים של הטיפול.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

חקור נדידה כיוונית של תאי ערמונית בשדה חשמלי באמצעות לשכת גלוונוטקסיס מותאמת אישית. השיטה מאפשרת מעקב אחרי מהירות וזווית הנדידה של תאים בזמן אמת ומסייעת להבנת התנהגות תאית בסרטן הערמונית.

ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

גלה סרטונים נוספים