Assay גיבוש רך אגר המושבה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת צמיחה בלתי תלויה של עיגון תאי. זה מושג על ידי ציפוי שכבת אגר על צלחת תרבית התאים ומאפשר לה להתקשות. השלב השני הוא ציפוי תערובת של תאים באגר מעל החלק העליון של שכבת האגר הקודמת.

לאחר מכן, התאים מורשים ליצור מושבות במשך תקופה של מספר שבועות. השלב האחרון הוא צביעת המושבות לצורך הדמיה וכימות. בסופו של דבר, בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה משמשת כדי להראות צמיחה עצמאית של אנקורג' כאינדיקציה לטרנספורמציה תאית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון הבדיקה הגנטית של קלון, הוא שבדיקת היווצרות מושבת אגר רכה דורשת מהתאים ליצור מושבות באופן עצמאי באנקורג'. התחל את ההליך על ידי תיוג כל באר של תרבית רקמה שטופלה. צלחת שש בארות כראוי לכל קו תאים או מצב הנחקר.

לאחר מכן, הכינו שני מדיום תרבית Xcel על ידי המסת גרם אחד של מדיום אבקה ו-0.2 גרם נתרן ביקרבונט במים נטולי יונים לנפח סופי של 50 מיליליטר. העבירו את המדיום הזה דרך פילטר 0.2 מיקרון. הוסף רכיבים נוספים הדרושים לתרבית רגילה של קו התאים המעניין.

לדוגמה, לגדל קו תאים CMT 1 67 במדיום RPMI 1640 בתוספת תמיסת סטרפטומיצין של 10% FBS ו-1% פניצילין. יש לחמם בינוני עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים לפני השימוש. כעת הכינו מדיום תרבית Xcel אחד.

לאחר מכן הכינו אגר אצילי 1% על ידי הוספת גרם אחד של אגר אצילי ל -100 מיליליטר מים נטולי יונים. לאחר מכן הכינו 0.6% אגר אצילי על ידי הוספת 0.6 גרם אגר אצילי ל -100 מיליליטר מים נטולי יונים. לאחר מכן, חיטוי תערובות האגר האצילות.

לאחר מכן הכינו תמיסת מלאי של מיליגרם אחד למיליליטר ניטרו כחול טטרה אוליאום כלוריד ב-XPBS אחד לצורך צביעת המושבות. בהליך זה, יש לחמם במיקרוגל את בקבוק האגר האצילי 1% למשך כדקה עד שתי דקות תוך חימום במיקרוגל. עקוב מקרוב אחר התמיסה כדי למנוע רתיחה.

לאחר מכן המשיכו לחמם ולערבב לסירוגין עד שהאגר מומס לחלוטין והתמיסה ברורה. לאחר מכן, הניחו את תמיסת האגר המומסת ואת מדיום התרבות Prewarm two x בדלי קרח מלא ב-42 מעלות צלזיוס. מי ברז.

בנוסף, הניחו צינור חרוטי של 50 מיליליטר במחזיק צינור בדלי הקרח עם מים חמים. לאחר מכן, העבירו את הדלי למכסה המנוע של תרבית התאים. לאחר מכן הוסף שישה מיליליטר של מדיום תרבית ושישה מיליליטר של תמיסת אגר אצילית 1% לצינור החרוטי של 50 מיליליטר.

פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים לערבוב. עבודה בקצב מהיר תמנע התקשות מוקדמת של האגר הרך. לאחר מכן, צייר כ -5.5 מיליליטר תערובת עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר.

אפשר לבועות האוויר לעלות לראש עמוד הפיפטה. לאחר מכן הפקידו 1.5 מיליליטר מהתערובת לכל באר והימנעו משקיעה של בועות אוויר כלשהן. מכסים את הצלחת ומניחים לתערובת האגר להתמצק במכסה המנוע של תרבית התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

ראשית, קצרו תאים על ידי טריפסין ודללו אותם מאחד עד חמישה בתרבית, בינונית לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. ספור את התאים וחשב את מספר התאים הדרושים לבאר כדי להכין תרחיף תאים סופי בשלב זה. לאחר מכן, ממיסים תמיסת אגר 0.6% במיקרוגל.

הנח אותו בדלי קרח המכיל מים חמים יחד עם צינור חרוטי של 50 מיליליטר במחזיק צינור ומתלה התא הסופי. לאחר מכן העבירו את דלי הקרח עם 0.6% אגר מומס למכסה המנוע של תרבית התאים לשלבים הבאים. כדי להכין נפח כולל של 12 מיליליטר של מתלה תאים לצלחת שש בארות, פיפטה ראשונה של שישה מיליליטר של תרחיף תאים לתוך הצינור החרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן הוסף שישה מיליליטר של 0.6% אגר לצינור. שמור את התערובת על 42 מעלות צלזיוס כדי למנוע התקשות מוקדמת וכדי למקסם את הישרדות התאים. לאחר מכן, פיפטה את התערובת במהירות, פעמיים-שלוש כדי להפיץ את התאים.

צייר 5.5 מיליליטר תערובת עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר ואפשר לכל בועות אוויר לעלות לראש עמוד הפיפטה. ואז הפקידו 1.5 מיליליטר מהתערובת לכל אחד. ובכן, אפשר לתערובת אגר התאים להתמצק בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית התאים למשך 30 דקות לפני שמכניסים אותה לחממת תרבית תאים לחה של 37 מעלות צלזיוס.

הוסף 100 מיקרוליטר של מצע גידול על שכבת האגר העליונה פעמיים בשבוע כדי למנוע התייבשות ואפשר כ-21 יום להיווצרות מושבה נאותה. כדי להכתים את התאים, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת טטרה אוליאום כלוריד כחול ניטרו לכל באר ודגר את הצלחת למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר שהמושבות מוכתמות, צלמו את הבארות באמצעות ההדמיה וספרו את המושבות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

מוצג כאן מבחן היווצרות מושבת אגר רכה של תאי CMT 1 67 LNCX LPC X ו- CMT 1 67 LL עבר שבעה תשע מקורזל על תאים מבטאים . הווקטור המבטא תאי CMT 1 67 L ו- CXL PC X ו- CMT 1 67 LL עבר שבעה מקורזלים. תשעה תאים מבטאים יתר צופו בבדיקת היווצרות מושבת אגר רכה CMT 1 67 LL עבר שבעה תשעה תאים מקורזלים הראו ירידה ניכרת בהיווצרות המושבה לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הסרטן לחקור טרנספורמציה תאית במבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך תאים לצמיחה עצמאית של אנקורג'.