הכנה לפרוטאומיקה חד-תאית לניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות ליזיס הקפאת חום ונשא איזוברי

SCoPE2 יכול לכמת אלפי חלבונים מאלפי תאי יונקים בודדים ללא נוגדנים. פרוטוקול זה יכול לסייע בחשיפת הטרוגניות פרוטאומית שאחרת הייתה בלתי נראית לניתוחים בתפזורת. פרוטאומיקה של תא בודד, תוך שימוש בגישת SCoPE2, תוכננה להיות נגישה לחוקרים עם מגוון משאבים, החל מפיפטה בלבד, וכלה ברובוטיקה לטיפול בנוזלים.

SCoPE2 ישים באופן נרחב לתחומי מחקר רבים, כולל סרטן ואימונולוגיה, בכך שהוא מספק תובנה לגבי האופן שבו חלבונים הם דיפרנציאליים בשפע בין תאים בודדים מאותה אוכלוסייה. כדי להתחיל, התחל את הליך תזה התא על ידי הצבת צלחת 384 באר עם תאים בודדים ממוינים לתוך מחזור תרמי, חימום אותו במשך 10 דקות ב 90 מעלות צלזיוס ולאחר מכן קירור ב 12 מעלות צלזיוס. סובבו את הצלחת לזמן קצר בספינר של צלחת ספסל בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס.

סוניקו את הצלחת במשך חמש דקות בסוניק אמבט מים בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הניחו אותו על קרח. כדי להמשיך בעיכול טריפסין, הכינו 100 מיקרוליטרים של תערובת המאסטר והוסיפו 0.2 מיקרוליטרים של תערובת האב לכל באר של צלחת 384 באר באמצעות מטפל בנוזל.

אוטמים את הצלחת, מערבלים במשך חמש שניות, ומסתובבים מטה בספינר של צלחת ספסל בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס. מחממים את צלחת ה-384 במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כשטמפרטורת המכסה מוגדרת ל-52 מעלות צלזיוס. כדי להגדיר תגובת תיוג מסת טנדם, הוציאו את 85 המילימולרים של תגי מסת טנדם מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

לפני פתיחתם, מחממים את הצינורות לטמפרטורת החדר ומדללים את התוויות ל -22 מילימול באצטוניטריל נטול מים. באמצעות אסטרטגיית תיוג זו, הוסף 0.5 מיקרוליטרים של תגי מסה טנדם מדוללים לכל באר של צלחת 384 באר, באמצעות רובוט חלוקת נוזלים או פיפטה ידנית. אוטמים את הצלחת, מערבלים במשך חמש שניות, ומסתובבים מטה בספינר של צלחת ספסל בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס.

תנו לתגובת הסימון להתקדם בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס למשך שעה. להמרווה של תגובת תיוג מסת טנדם, הוסף 0.2 מיקרוליטרים של 0.5% הידרוקסילאמין, מדולל במים ברמת HPLC, לכל באר של צלחת 384 באר באמצעות מטפל בנוזל. אטמו את הצלחת, ערבבו במשך חמש שניות והסתובבו מטה בספינר של צלחת ספסל לפני שתשמרו על הצלחת בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הכנת ניתוח LC-MS מתחילה על ידי הסרת המוביל המשולב או חומר הייחוס מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. עבור כל סט, פיפטה מיקרוליטר אחד של נשא וחומר התייחסות לתוך הבאר הראשונה, יהיה חלק מסט אחד. פיפטה את הנפח המלא מהבאר הראשונה לבאר שלאחר מכן.

המשיכו להעביר את הנפח השלם מבאר אחת לאחרת עד שכל הבארות הכלולות בסט אחד שולבו בבאר הסופית. עבור כל סט, הוסף חמישה מיקרוליטרים של 50% אצטוניטריל מדולל במים ברמת HPLC עבור באר התא הבודד הראשונה שתיכלל בכל ערכה. פיפטה את הנפח המלא מהבאר הראשונה לבאר שלאחר מכן.

המשך להעביר את הנפח המלא מתא אחד למשנהו, עד שכל הבארות הכלולות בערכה אחת שולבו בבאר הסופית. כעת העבירו כל סט לתוספות הזכוכית האוטומטיות שלהם. יבשו את הדגימות לאחר שכל הסטים משולבים ומונחים בתוספות זכוכית.

לפני ניתוח LC-MS-MS, יש להוסיף 1.2 מיקרוליטרים של 0.1% חומצה פורמית לכל ערכה כדי להשהות את הפפטידים המסומנים. הנח את הדוגמאות האוטומטיות שהוכנסו לבקבוקוני הדגימה האוטומטית מזכוכית, וסגור כל דגימה באמצעות מכסה. מערבלים כל בקבוקון במשך חמש שניות כדי לוודא שהחידוש הושלם, ואז מסתובבים בספינר בקבוקון בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס.

ודא שכל דגימה נמצאת בתחתית ההוספה ולא ניתזת בצדדים. הנח את הבקבוקונים במגש הדגימה האוטומטית ועבור כל ערכה, הכנס דגימת מיקרוליטר אחת לניתוח LC-MS-MS. ייתכן שיעילות העיכול וההתוויה של התאים הבודדים לא תיבדק באופן ישיר כמו אצל הנשא, אך תוכנת DO-MS מספקת עלילות המעריכות את יעילות העיכול והתווית.

עיכול לקוי מסומן על ידי יחס גבוה של עוצמת פפטידים miscleaved לעמיתיהם שסועים לחלוטין. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון בקבוצות הוא חלק הנתונים החסרים בעוצמת יון הדיווח החציונית בכל ערוץ תיוג מסה טנדם. כאשר תאים בודדים מוכנים בהצלחה, נתונים חסרים לכל תא ובקרה חיובית נמוכים בהרבה מדגימות בקרה שליליות.

טיפול זהיר בנוזלים במהלך הכנת דגימת LC-MS-MS הוא קריטי להתאוששות מרבית של פפטידים. ניתן להכין דגימות קטנות של כ-100 פיקוגרמות עד 100 ננוגרם לבאר לניתוח פרוטאומיקה באמצעות נשא איזוברי. SCoPE2 מנגישה מדידות פרוטאומיקה חד-תאית לחוקרים ברחבי העולם על ידי שימוש רק בריאגנטים נפוצים ובציוד זמין מסחרית.

זה מקובל על עיבוד ידני או אוטומציה בתפוקה גבוהה על ידי טיפול רובוטי בנוזלים.