חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

המטרה הכללית של נוהל זה היא להדגים ולקבוע את שכיחות הסטרומולות (stromules) באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאים חיים בתוך עלים, ולהדגים סטרומולות in vitro באמצעות כלורופלסטים שהופקו מעלים. שיטות ניסיוניות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של תאי צמחים ובמחקר של כלורופלסטים על ידי גילוי אופן פעולתן של הסטרומולות. היתרון המרכזי של טכניקות אלו הוא שהן מניבות נתונים עקביים וחזקים, גם עבור מבני כלורופלסטים דינמיים ביותר אלו.

הרעיון למחקר בידוד הכלורופלסטים עלה כיוון שחלק מהמחקרים הצביעו על כך שהיווצרות סטרומולות (stromules) דורשת מבנים ציטזוליים, כגון השלד התאי, לצורך היווצרותן. לכן, החלטנו לטחון את התא ולבדוק האם סטרומולות עדיין יכולות להיווצר. כדי להכין דגימות עלים, התחילו בשימוש בלהב תער חד מאוד כדי לחתוך מקטע קטן מעלה של Nicotiana benthamiana.

מיד לאחר חיתוך נתח העלה, טבלו אותו במזרק של 5 ml מלא במים. לאחר מכן, הוציאו את האוויר מהמזרק וצרו ואקום על ידי כיסוי פיית המזרק עם האצבע, לפני משיכת הבוכנה. שחררו את הבוכנה בעדינות כדי למנוע נזק לנתח העלה.

לאחר מכן, חזרו על פעולת הוצאת האוויר פעמיים או שלוש, או עד שהאוויר יוסר והעלה ייראה בצבע ירוק כהה. הוסיפו טיפת מים לזכוכית כיסוי, והניחו את נתח העלה על הטיפה. לאחר מכן, הוסיפו טיפת מים נוספת על חלקו העליון של העלה, והניחו זכוכית כיסוי.

במידה וישנן בועות אוויר, הקש בעדינות על זכוכית המכסה עד להסרתן. באמצעות תאורה חודרת ועדשה אובייקטיבית 20x, התמקד בשדה ראייה קרוב למרכז חתך העלה, כך שייראו מספר כלורופלסטים בו-זמנית. שמור תמונה בתאורה חודרת, כדי שניתן יהיה להבחין בין סוגי התאים מאוחר יותר במידת הצורך.

לאחר מכן, עברו להארה בלייזר עם מסנני העירור והפליטה המתאימים לפלואורופור שבשימוש, ושמרו תמונה נוספת. באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, בחרו בערוץ ה-GFP, ולחצו כדי להתאים את מפתח ה-pinhole ליחידת Airy אחת. בחרו בסריקת לייזר (laser scanning) כדי להתחיל בויזואליזציה של הדגימה, ולאחר מכן לחצו על ערוץ ה-GFP ועל הגבר הגלאי (detector gain) כדי לצמצם את עוצמת הלייזר תוך שמירה על ויזואליזציה ברורה של הסטרומולות (stromules).

בשלב הבא, הכינו ניסוי Z stack שיאסוף סדרה של תמונות דרך אפידרמיס העלה בשדה הראייה. התאימו את מהירות הסריקה ורזולוציית התמונה לפי הצורך כדי להבטיח שה-Z stack ייאסף במהירות. לאחר מכן, שמרו את ה-Z stack לצורך ניתוח מאוחר יותר.

באמצעות Image J, מרגשו את ה-Z stack לתמונה אחת באמצעות עוצמת maksymalית (maximum intensity) בתוכנה. לאחר מכן, זהו וספרו ידנית את כל הכלורופלסטים בתמונה. עבור כל כלורופלסט, קבעו באופן ויזואלי האם נראים סטרומול (stromules) אחד או יותר המשתרעים מהכלורופלסט בתמונת ה-Z stack הממוזגת.

כדי להפיק כלורופלסטים שלמים, הכינו תמיסת מיצוי קרה באמצעות הרכיבים הבאים. לאחר מכן, בעזרת NaOH ו-HCl, כווננו את ה-pH ל-6.9, ושמרו בקירור לפני השימוש. הכינו תמיסת בידוד, וכווננו את ה-pH ל-7.6.

אם העלים אינם מבטאים סטרומופלואורופור (stromofluorophore) מקודד גנטית, הכין תמיסת Carboxyfluorescein diacetate, או CFDA. כדי לבודד כלורופלסטים, הסר כ-5 עד 10 גרם של עלים מכמה צמחים ושטוף אותם קצר במים קרים. לאחר מכן, העבר מיד את העלים ל-50 מיליליטר של בופר מיצוי קר.

בעזרת בלנדר ובמספר פולסים קצרים, טחנו את העלים, ולאחר מכן סננו את התערובת דרך שתי עד שלוש שכבות של בד גזה להסרת שאריות עלים. חלקו את תמצית הכלורופלסטים לשתי מבחנות צנטריפוגה בנפח 50 milliliter, ובצעו צנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 750 x g. השליכו את הנוזל העליון (supernatant), והשתמשו ב-10 milliters של בופר בידוד כדי להחזיר את הכלורופלסטים הירוקים לתליה.

לאחר מכן, סנטריפוגו שוב למשך דקה אחת ב-750 x g, השליכו את supernatant, והשתמשו בבופר בידוד כדי לתלות מחדש את הכלורופלסטים עד לנפח סופי של חמישה מיליליטרים. אם הכלורופלסטים הגיעו מצמחים טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים המכוונים לפלסטידים, העבירו 20 microliters של הכלורופלסטים לזכוכית כיסוי והוסיפו כיסוי זכוכית. לאחר מכן, בצעו מיקרוסקופיה.

כדי לצבוע כלורופלסטים מצמחים שאינם מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים המכוונים לפלסטידים, הוסיפו 5 µL של תמיסת מלאי CFDA בריכוז 50 mM ל-5 mL של כלורופלסטים בבופר בידוד. לאחר דגירה של הכלורופלסטים למשך חמש דקות, העבירו מנה קטנה (aliquot) לסרטית, הוסיפו כיסוי זכוכית ובצעו מיקרוסקופיה. לבסוף, השתמשו בסט פילטרים של FITC או GFP ובעדשה אובייקטיבית 20x כדי להדגים מספר כלורופלסטים בו-זמנית.

או עדשה עם הגדלה גבוהה יותר כדי להדמיאן כלורופלסט בודד ומבודד. כאן מוצגת ערימה ממוזגת (merged stack) המראה את תדירות ה-GFP בסטומולות (stomules) של נבטי N.Benthamiana צעירים. בפאנל זה, התמונה עברה ביטול רוויה והיפוך צבעים, כך שהסטרומה מופיעה בשחור.

הכלורופלסטים סווגו ככאלה שאין להם סטרומולות, או כאלה שיש להם לפחות סטרומולה אחת. מתוך 87 הכלורופלסטים האפידרמליים שנדגמו, ל-33 היו סטרומולות, שכיחות של 37.9 אחוזים בעלה זה. גרף זה מייצג ניתוח של למעלה מ-23,000 כלורופלסטים ומאות תאים מעלה בודד מ-21 צמחים שונים.

השכיחות הממוצעת של הסטרומולות (stromules) במהלך היום הייתה 20.8 פלוס או מינוס 1.8 אחוזים, והשכיחות הממוצעת של הסטרומולות בלילה הייתה 12.8 פלוס או מינוס 0.9 אחוזים, מה שמעיד על שכיחות גבוהה משמעותית בשעות היום, כפי שנקבע באמצעות מבחן Welch's T. באיור זה, נצפו סטרומולות של כלורופלסטים in vitro לאחר בידוד מ-N.benthamiana המבטאת GFP המכוון לפלסטידים, או לאחר שימוש ב-CFDA לצביעת כלורופלסטים מ-N.benthamiana או מ-Spinachia oleracea. בעת ביצוע דימוי של תאים חיים של סטרומולות, חשוב לעבוד במהירות ולמניפולציה מינימלית של רקמת הצמח.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון השתקת גנים או טיפולים כימיים, כדי לגלות שחקנים מולקולריים או מסלולים נוספים המעורבים ביצירת סטרומולות (stromules) ובתפקודן. טכניקה זו שימשה חוקרים בביולוגיה של תאי צמחים ובחסינות צמחים כדי לחקור את תפקידן של הסטרומולות במסלולי איתות תאיים ובתגובות של צמחים לפתוגנים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן חישוב שכיחות הסטרומולות בעלה, וכיצד לצפות בסטרומולות בתוך כלורופלסטים שבודדו.

וזכרו כי הלייזרים והמתח החשמלי המספקים את ההזנה למיקרוסקופ קונפוקאלי סורק הם עלולים להיות מסוכנים ביותר, וחשוב להבין את דרישות המערכת לשימוש בציוד זה.