חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולקבוע את תדירות הסטרומולים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של תאים חיים בתוך עלים, ולהמחשת סטרומולים במבחנה באמצעות כלורופלסט המופק מעלים. שיטות ניסיוניות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של תאי צמחים ובמחקר כלורופלסט על ידי גילוי כיצד סטרומולים מתפקדים. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שהן מייצרות נתונים הניתנים לשחזור וחזקים, אפילו של מבני כלורופלסט דינמיים מאוד.

היה לנו את הרעיון למחקר בידוד הכלורופלסט מכיוון שחלק מהמחקרים הציעו שהיווצרות סטרומולים דורשת מבנים ציטוזוליים, כמו שלד הציטו, כדי להיווצר. אז החלטנו למזג את התא, ולראות אם עדיין יכולים להיווצר סטרומולים. להכנת דגימות עלים, התחל בשימוש בסכין גילוח חד מאוד כדי לחתוך קטע קטן מעלה Nicotiana benthamiana.

מיד לאחר חיתוך קטע העלים, טבלו אותו במזרק של חמישה מיליליטר מלא במים. לאחר מכן, הסר את האוויר מהמזרק, והחל ואקום באמצעות אצבע כדי לכסות את פתח המזרק, לפני משיכת הבוכנה. שחרר בעדינות את הבוכנה כדי למנוע פגיעה בחלק העלה.

לאחר מכן חזור על הסרת האוויר פעמיים או שלוש, או עד להסרת האוויר, והעלה נראה ירוק עמוק. הוסף טיפת מים למגלשה, והניח את קטע העלים על הטיפה. לאחר מכן מוסיפים עוד טיפת מים לראש העלה, ומוסיפים פתק כיסוי.

אם יש בועות אוויר, הקש בעדינות על החלקת הכיסוי עד להסרתן. עם אור מועבר, ומטרה של פי 20, התמקדו בשדה ראייה ליד מרכז קטע העלה, והדמיינו מספר כלורופלסטים בו זמנית. שמור תמונה עם אור מועבר, כך שניתן יהיה להבחין בין סוגי תאים מאוחר יותר במידת הצורך.

לאחר מכן עבור לתאורת לייזר עם מסנני העירור והפליטה המתאימים לפלואורופור שבו נעשה שימוש, ושמור תמונה נוספת. באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, בחר את ערוץ ה-GFP ולחץ כדי לכוונן את צמצם החור ליחידה אוורירית אחת. בחר סריקת לייזר כדי להתחיל לדמיין את הדגימה, ולאחר מכן לחץ על ערוץ ה-GFP ורווח הגלאי כדי למזער את עוצמת הלייזר תוך הדמיה ברורה של סטרומולים.

לאחר מכן, הכינו ניסוי מחסנית Z שיאסוף את סדרת התמונות דרך אפידרמיס העלה בשדה הראייה. התאם את מהירות הסריקה ורזולוציית התמונה לפי הצורך כדי לוודא שערימת Z נאספת במהירות. לאחר מכן שמור את מחסנית Z לניתוח מאוחר יותר.

באמצעות תמונה J, מזג את מחסנית Z לתמונה אחת באמצעות העוצמה המקסימלית בתוכנה. לאחר מכן זהה וספור ידנית את כל הכלורופלסטים בתמונה. עבור כל כלורופלסט, קבע חזותית אם נראה סטרומול אחד או יותר המשתרע מהכלורופלסט בתמונת מחסנית Z הממוזגת.

כדי לחלץ כלורופלסטים שלמים, הכינו מאגר מיצוי קר באמצעות הריאגנטים הבאים. לאחר מכן, עם NaOH ו-HCl, התאימו את ה-pH ל-6.9, וקיררו לפני השימוש. הכן מאגר בידוד והתאם את ה-pH ל-7.6.

אם העלים אינם מבטאים סטרומופלואורופור מקודד גנטית, הכינו תמיסת Carboxyfluorescein diacetate, או CFDA. כדי לבודד כלורופלסטים, הסר כ -5 עד 10 גרם עלים ממספר צמחים ושטוף לזמן קצר במים קרים. לאחר מכן העבירו מיד את העלים ל -50 מיליליטר של מאגר מיצוי קר.

בעזרת בלנדר עם כמה פולסים קצרים, טוחנים את העלים, ואז מסננים את התערובת דרך שתיים עד שלוש שכבות של בד גבינה כדי להסיר פסולת עלים. מחלקים את הכלורופלסט המופק לשני צינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר, וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-750 x גרם. השליכו את הסופרנטנט, והשתמשו ב-10 מיליליטר של מאגר בידוד כדי להשעות מחדש את הכלורופלסטים הירוקים.

לאחר מכן צנטריפוגה שוב למשך דקה אחת ב-750 x גרם, השליכו את הסופרנטנט והשתמשו במאגר בידוד כדי להשהות מחדש את הכלורופלסטים עד לנפח סופי של חמישה מיליליטר. אם הכלורופלסטים הם מצמחים טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי פלסטיד, העבירו 20 מיקרוליטר של הכלורופלסטים לשקופית והוסיפו פתק כיסוי. לאחר מכן בצע מיקרוסקופיה.

כדי להכתים כלורופלסטים מצמחים שאינם מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי פלסטיד, הוסף חמישה מיקרוליטרים של מלאי CFDA של 50 מילי-מולרי לחמשת מיליליטר הכלורופלסטים במאגר בידוד. לאחר שאפשרתם לכלורופלסטים לדגור במשך חמש דקות, העבירו מנה קטנה לשקופית, הוסיפו פתק כיסוי ובצעו מיקרוסקופיה. לבסוף, השתמש בסט מסנני FITC או GFP ובמטרה פי 20 כדי לדמיין מספר כלורופלסטים בו זמנית.

או מטרה גבוהה יותר לדמיין כלורופלסט מבודד יחיד. ערימה ממוזגת המציגה את תדירות הסטומולה של GFP באוכלוסייה של שתילי N.Benthamiana צעירים מוצגת כאן. בפאנל זה, התמונה הייתה רוויה והפוכה כך שהסטרומה נראית שחורה.

הכלורופלסטים סומנו כחסרי סטרומול, או כבעלי סטרומול אחד לפחות. מתוך 87 כלורופלסטים אפידרמיסיים שנראו, ל-33 יש סטרומולים, בשכיחות של 37.9 אחוזים בעלה זה. הגרף הזה מייצג ניתוח של יותר מ-23,000 כלורופלסטים, וכמה מאות תאים מעלה בודד מ-21 צמחים שונים.

תדירות הסטרומולים הממוצעת במהלך היום הייתה 20.8 פלוס מינוס 1.8 אחוזים, ותדירות הסטרומולה הלילית הממוצעת הייתה 12.8 פלוס מינוס 0.9 אחוזים, מה שמצביע על תדירות גבוהה משמעותית בשעות היום, כפי שנקבע על ידי מבחן ה-T של וולש. באיור זה, סטרומולים של כלורופלסט נצפו במבחנה לאחר בידוד מ-N.benthamiana המבטא GFP ממוקד פלסטיד, או לאחר שימוש ב-CFDA כדי לצבוע כלורופלסטים מ-N.benthamiana, או Spinachia oleracea. בעת ביצוע הדמיית תאים חיים של סטרומולים, חשוב לעבוד במהירות, ולתפעל את רקמת הצמח כמה שפחות.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו השתקת גנים או טיפולים כימיים כדי לגלות שחקנים מולקולריים נוספים או מסלולים המעורבים בהיווצרות ותפקוד סטרומול. טכניקה זו שימשה חוקרים בביולוגיה של תאי צמחים וחסינות צמחים כדי לחקור את תפקידם של סטרומולים במסלולי איתות תאיים ותגובות צמחים לפתוגנים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחשב את תדירות הסטרומול בעלה, וכיצד להתבונן בסטרומולים בכלורופלסטים שחולצו.

וזכרו שהלייזרים והמתח החשמלי המספקים מיקרוסקופ קונפוקלי אלקטרוני סורק יכולים להיות מסוכנים ביותר, וחשוב להבין את דרישות המערכת לשימוש בציוד זה.