Name: חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: למד לדמיין תדר סטרומולות בכלורופלסטים של Nicotiana benthamiana באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. השיטה מספקת נתונים אמינים על דינמיקת מבני הכלורופלסט בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.O.B. ו-A.M.R. נתמכו על ידי מלגות קדם-דוקטורט מהקרן הלאומית למדע.

<ol><li>Koussevitzky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+chloroplasts+converge+to+regulate+nuclear+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression.</a> Science. 316 (5825), 715-719 (2007).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNAS+Plus%3A+Organelle-nucleus+cross-talk+regulates+plant+intercellular+communication+via+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).</li>
<li>Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+states+of+plastids+and+mitochondria+differentially+regulate+intercellular+transport+via+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata.</a> Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).</li>
<li>Nomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast-mediated+activation+of+plant+immune+signalling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis.</a> Nat. Commun. 3, 926(2012).</li>
<li>Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncharacterized+apocarotenoid-derived+signal+generated+in+%CE%B6-carotene+desaturase+mutants+regulates+leaf+development+and+the+expression+of+chloroplast+and+nuclear+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).</li>
<li>Caplan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+stromules+runction+during+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Chloroplast stromules runction during innate immunity.</a> Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).</li>
<li>Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromules%3A+recent+insights+into+a+long+neglected+feature+of+plastid+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).</li>
<li>Gray, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+stromules+are+induced+by+stress+treatments+acting+through+abscisic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid.</a> Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).</li>
<li>Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplasts+extend+stromules+independently+and+in+response+to+internal+redox+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).</li>
<li>Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis+gene-promoter+fusions+in+leaf+epidermal+cells+of+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants.</a> Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).</li>
<li>Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+and+loss+of+photosynthetic+membranes+during+plastid+differentiation+in+the+shoot+apex+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).</li>
<li>Chiang, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+GATA+transcription+factors+GNC+and+CGA1+reveals+their+key+role+in+chloroplast+development%2C+growth%2C+and+division+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).</li>
<li>Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+stromule+branching+coincides+with+contiguous+endoplasmic+reticulum+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).</li>
<li>Erickson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-derived+cytokinin+influences+plastid+morphology+and+starch+accumulation+in+Nicotiana+benthamiana+during+transient+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 127(2014).</li>
<li>Ho, J., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+stromules+in+vitro+from+chloroplasts+isolated+from+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana.</a> PLoS One. 11 (2), e0146489(2016).</li>
<li>Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrunkard%2C+JO+%22Method.+Mol.+Biol%22">Method. Mol. Biol</a>. , 185-198 (2015).</li>
<li>Schattat, M. H., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+stromule+formation+by+extracellular+sucrose+and+glucose+in+epidermal+leaf+tissue+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 11, 115(2011).</li>
<li>Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoly%2C+D+%22Method.+Mol.+Biol%22">Method. Mol. Biol</a>. 684, 321-325 (2011).</li>
<li>Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromule+formation+is+dependent+upon+plastid+size%2C+plastid+differentiation+status+and+the+density+of+plastids+within+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell.</a> Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאשר חוקרים stromules, שלושה גורמים חשובים חייבים להיחשב לכל אורכו: (i) מניפולציה של רקמות הצמח חייב להישמר עד למינימום הכרחי, (ii) מערכת הניסוי חייבת להישמר עקבית, וכן (iii) אסטרטגיות דגימה חייבות להיות מתוכננות בקפידה כדי להבטיח חזק, מנותחי נתונים לשחזור. Stromules להפליא דינמי: הם יכולים להאריך לסגת במהירות לנגד עיניו של משקיף תחת מיקרוסקופ. יתר על כן, תדירות stromule משתנית באופן משמעותי בתגובת מגוון רחב של ט...

כלורופלסטים הם אברונים דינמיים בתאי צמחים האחראים לפוטוסינתזה ולשורה של תהליכים מטבוליים אחרים. מסלולי איתות מהכלורופלסט משפיעים באופן משמעותי גם על הפיזיולוגיה וההתפתחות של הצמח, ומתאמים את תגובות הצמח לעקה סביבתית, פתוגנים ואפילו צורת עלים1-6. לאחרונה, ביולוגים התעניינו בהיבט לא מובן היטב של מבנה הכלורופלסט: סטרומולים, צינורות דקים מאוד מלאים בסטרומה המשתרעים מפני השטח של הכלורופלסט7.
הפונקציות הביולוגיות של סטרומולים נותרו לא ידועות, אם כי ידוע שתדירות הסטרומולים משתנה בתגובה לגירויים סביבתיים7-9, וסטרומולים עשויים להיות מסוגלים להעביר מולקולות איתות בין אברונים6. כל סוגי הפלסטידים (לא רק הכלורופלסטים הירוקים, הפוטוסינתטיים, אלא גם לוקופלסטים שקופים, עמילופלסטים מלאי עמילן וכרומופלסטים פיגמנטיים, אם להזכיר כמה סוגים של פלסטידים) מייצרים סטרומולים, וסטרומולים נמצאים בכל מיני צמחי היבשה שנבדקו עד כה. סטרומולים יכולים להתארך ולסגת באופן דינמי, להופיע או להיעלם תוך שניות, או שהם יכולים להישאר נייחים יחסית לזמן רב. אחד המכשולים העיקריים העומדים בפני ביולוגים של סטרומולים הוא שסטרומולים נחקרים לעתים קרובות באמצעות שיטות, רקמות ומינים שונים באופן דרמטי, מה שמקשה על השוואות בין הספרות הביולוגית של סטרומולים. בהמשך, שיטות עבודה סטנדרטיות ותיאורים יסודיים של מערכות הניסוי המשמשות לחקר סטרומולים יהיו קריטיים לגילוי התפקוד של מאפיינים אלה בכל מקום של מורפולוגיה של כלורופלסט.
כאן אנו מתארים שיטות להמחשת היווצרות סטרומולים בכלורופלסטים האפידרמיסיים של עלי Nicotiana benthamiana. במזופיל, כלורופלסטים ארוזים בצפיפות בתאים גדולים ותלת מימדיים, מה שמקשה על הדמיה מדויקת ומהירה של סטרומולים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. לעומת זאת, תאי האפידרמיס שטוחים יחסית, מכילים פחות כלורופלסטים ונמצאים על פני העלה, מה שמאפשר הדמיה קלה ומהירה של סטרומולים. N. benthamiana היא מערכת מודל אידיאלית לניסויים אלה מכיוון שבניגוד למיני צמחים רבים, כל התאים באפידרמיס של N. benthamiana מייצרים כלורופלסטים10. באפידרמיס של רוב הצמחים, כולל Arabidopsis thaliana, רק לתאי השמירה הפיוניים יש כלורופלסטים, בעוד שלתאי אפידרמיס אחרים יש "לוקופלסטים", פלסטידים שקופים, אמורפיים יחסית ולא פוטוסינתטיים9,11,12. לפיכך, בעוד ששדה ראייה יחיד של A. thaliana epidermis עשוי להראות רק קומץ כלורופלסטים בזוג תאי שמירה, שדה ראייה של N. benthamiana epidermis יכלול עשרות ואף מאות כלורופלסטים. עם זאת, ניתן לשנות את כל השיטות המתוארות כאן כדי לחקור שאלות אחרות בביולוגיה של סטרומול; לדוגמה, השתמשנו באותה גישה כדי לחקור סטרומולים של לויקופלסט של A. thaliana9.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer-Biotech</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp;</td><td>קארל זייס בע"</td><td>מ דגם: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring blender</td><td>Waring&nbsp;</td><td>דגם: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>פיג'י</td><td>fiji.sc</td><td></td><td>תוכנת קוד פתוח לניתוח תמונות ביולוגיות</td></tr></tbody></table>

חזותי תדר stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

סטרומולים, או "צינוריות מלאות סטרומה", הן הרחבות צרות וצינוריות מפני השטח של הכלורופלסט הנצפות באופן אוניברסלי בתאי צמחים אך תפקידיהן נותרים מסתוריים. לצד תשומת הלב הגוברת לתפקידם של כלורופלסטים בתיאום תגובות הצמח ללחץ, העניין בסטרומולים והקשר שלהם לדינמיקת איתות כלורופלסט גדל בשנים האחרונות, בסיוע התקדמות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ופלואורופורים של חלבונים המאפשרים הדמיה מהירה ומדויקת של דינמיקת סטרומולים. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבדיקת תדירות סטרומולה בכלורופלסטים האפידרמיסיים של Nicotiana benthamiana, מערכת מודל מצוינת לחקירת הביולוגיה של סטרומולה כלורופלסט. אנו מספקים גם שיטות להדמיית סטרומולים של כלורופלסט במבחנה על ידי מיצוי כלורופלסטים מעלים. לבסוף, אנו מתארים אסטרטגיות דגימה וגישות סטטיסטיות לניתוח הבדלים בתדירות סטרומולים בתגובה לגירויים, כגון לחץ סביבתי, טיפולים כימיים או השתקת גנים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקולים אלה כנקודת התחלה לפיתוח שיטות חדשות לניסויים חדשניים כדי לחקור כיצד ומדוע כלורופלסטים מייצרים סטרומולים.

פרוטוקול זה שימש כדי להמחיש תדירות stromule ביום ובלילה של cotyledons של נ צעירים שתילי benthamiana. פרוסות מתוך ערימת z- מוזגו לתוך תמונה אחת (איור 1 א). למטרות חזותיות, הדימוי הזה היה אז desaturated ונהפך, כך stroma מופיע שחור (איור 1B). כלורופלסטים תויגו גם כחסר stromules (כוכבית ירוקה) או שיש לפחות אחד stromule (כוכבית מגנט). 87 כלורופלסטים אפידרמיס דמיינו, 33 יש stromules. לפיכך, תדר...

מתוארים פרוטוקולים לחקירת הדינמיקה של סטרומולים של כלורופלסט, הצינורות המלאים בסטרומה המשתרעים מפני השטח של כלורופלסטים.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא להדגים ולקבוע את שכיחות הסטרומולות (stromules) באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאים חיים בתוך עלים, ולהדגים סטרומולות in vitro באמצעות כלורופלסטים שהופקו מעלים. שיטות ניסיוניות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של תאי צמחים ובמחקר של כלורופלסטים על ידי גילוי אופן פעולתן של הסטרומולות. היתרון המרכזי של טכניקות אלו הוא שהן מניבות נתונים עקביים וחזקים, גם עבור מבני כלורופלסטים דינמיים ביותר אלו.הרעיון למחקר בידוד הכלורופלסטים עלה כיוון שחלק מהמחקרים הצביעו על כך שהיווצרות סטרומולות (stromules) דורשת מבנים ציטזוליים, כגון השלד התאי, לצורך היווצרותן. לכן, החלטנו לטחון את התא ולבדוק האם סטרומולות עדיין יכולות להיווצר. כדי להכין דגימות עלים, התחילו בשימוש בלהב תער חד מאוד כדי לחתוך מקטע קטן מעלה של Nicotiana benthamiana.מיד לאחר חיתוך נתח העלה, טבלו אותו במזרק של 5 ml מלא במים. לאחר מכן, הוציאו את האוויר מהמזרק וצרו ואקום על ידי כיסוי פיית המזרק עם האצבע, לפני משיכת הבוכנה. שחררו את הבוכנה בעדינות כדי למנוע נזק לנתח העלה.לאחר מכן, חזרו על פעולת הוצאת האוויר פעמיים או שלוש, או עד שהאוויר יוסר והעלה ייראה בצבע ירוק כהה. הוסיפו טיפת מים לזכוכית כיסוי, והניחו את נתח העלה על הטיפה. לאחר מכן, הוסיפו טיפת מים נוספת על חלקו העליון של העלה, והניחו זכוכית כיסוי.במידה וישנן בועות אוויר, הקש בעדינות על זכוכית המכסה עד להסרתן. באמצעות תאורה חודרת ועדשה אובייקטיבית 20x, התמקד בשדה ראייה קרוב למרכז חתך העלה, כך שייראו מספר כלורופלסטים בו-זמנית. שמור תמונה בתאורה חודרת, כדי שניתן יהיה להבחין בין סוגי התאים מאוחר יותר במידת הצורך.לאחר מכן, עברו להארה בלייזר עם מסנני העירור והפליטה המתאימים לפלואורופור שבשימוש, ושמרו תמונה נוספת. באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, בחרו בערוץ ה-GFP, ולחצו כדי להתאים את מפתח ה-pinhole ליחידת Airy אחת. בחרו בסריקת לייזר (laser scanning) כדי להתחיל בויזואליזציה של הדגימה, ולאחר מכן לחצו על ערוץ ה-GFP ועל הגבר הגלאי (detector gain) כדי לצמצם את עוצמת הלייזר תוך שמירה על ויזואליזציה ברורה של הסטרומולות (stromules).בשלב הבא, הכינו ניסוי Z stack שיאסוף סדרה של תמונות דרך אפידרמיס העלה בשדה הראייה. התאימו את מהירות הסריקה ורזולוציית התמונה לפי הצורך כדי להבטיח שה-Z stack ייאסף במהירות. לאחר מכן, שמרו את ה-Z stack לצורך ניתוח מאוחר יותר.באמצעות Image J, מרגשו את ה-Z stack לתמונה אחת באמצעות עוצמת maksymalית (maximum intensity) בתוכנה. לאחר מכן, זהו וספרו ידנית את כל הכלורופלסטים בתמונה. עבור כל כלורופלסט, קבעו באופן ויזואלי האם נראים סטרומול (stromules) אחד או יותר המשתרעים מהכלורופלסט בתמונת ה-Z stack הממוזגת.כדי להפיק כלורופלסטים שלמים, הכינו תמיסת מיצוי קרה באמצעות הרכיבים הבאים. לאחר מכן, בעזרת NaOH ו-HCl, כווננו את ה-pH ל-6.9, ושמרו בקירור לפני השימוש. הכינו תמיסת בידוד, וכווננו את ה-pH ל-7.6.אם העלים אינם מבטאים סטרומופלואורופור (stromofluorophore) מקודד גנטית, הכין תמיסת Carboxyfluorescein diacetate, או CFDA. כדי לבודד כלורופלסטים, הסר כ-5 עד 10 גרם של עלים מכמה צמחים ושטוף אותם קצר במים קרים. לאחר מכן, העבר מיד את העלים ל-50 מיליליטר של בופר מיצוי קר.בעזרת בלנדר ובמספר פולסים קצרים, טחנו את העלים, ולאחר מכן סננו את התערובת דרך שתי עד שלוש שכבות של בד גזה להסרת שאריות עלים. חלקו את תמצית הכלורופלסטים לשתי מבחנות צנטריפוגה בנפח 50 milliliter, ובצעו צנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 750 x g. השליכו את הנוזל העליון (supernatant), והשתמשו ב-10 milliters של בופר בידוד כדי להחזיר את הכלורופלסטים הירוקים לתליה.לאחר מכן, סנטריפוגו שוב למשך דקה אחת ב-750 x g, השליכו את supernatant, והשתמשו בבופר בידוד כדי לתלות מחדש את הכלורופלסטים עד לנפח סופי של חמישה מיליליטרים. אם הכלורופלסטים הגיעו מצמחים טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים המכוונים לפלסטידים, העבירו 20 microliters של הכלורופלסטים לזכוכית כיסוי והוסיפו כיסוי זכוכית. לאחר מכן, בצעו מיקרוסקופיה.כדי לצבוע כלורופלסטים מצמחים שאינם מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים המכוונים לפלסטידים, הוסיפו 5 µL של תמיסת מלאי CFDA בריכוז 50 mM ל-5 mL של כלורופלסטים בבופר בידוד. לאחר דגירה של הכלורופלסטים למשך חמש דקות, העבירו מנה קטנה (aliquot) לסרטית, הוסיפו כיסוי זכוכית ובצעו מיקרוסקופיה. לבסוף, השתמשו בסט פילטרים של FITC או GFP ובעדשה אובייקטיבית 20x כדי להדגים מספר כלורופלסטים בו-זמנית.או עדשה עם הגדלה גבוהה יותר כדי להדמיאן כלורופלסט בודד ומבודד. כאן מוצגת ערימה ממוזגת (merged stack) המראה את תדירות ה-GFP בסטומולות (stomules) של נבטי N.Benthamiana צעירים. בפאנל זה, התמונה עברה ביטול רוויה והיפוך צבעים, כך שהסטרומה מופיעה בשחור.הכלורופלסטים סווגו ככאלה שאין להם סטרומולות, או כאלה שיש להם לפחות סטרומולה אחת. מתוך 87 הכלורופלסטים האפידרמליים שנדגמו, ל-33 היו סטרומולות, שכיחות של 37.9 אחוזים בעלה זה. גרף זה מייצג ניתוח של למעלה מ-23,000 כלורופלסטים ומאות תאים מעלה בודד מ-21 צמחים שונים.השכיחות הממוצעת של הסטרומולות (stromules) במהלך היום הייתה 20.8 פלוס או מינוס 1.8 אחוזים, והשכיחות הממוצעת של הסטרומולות בלילה הייתה 12.8 פלוס או מינוס 0.9 אחוזים, מה שמעיד על שכיחות גבוהה משמעותית בשעות היום, כפי שנקבע באמצעות מבחן Welch's T. באיור זה, נצפו סטרומולות של כלורופלסטים in vitro לאחר בידוד מ-N.benthamiana המבטאת GFP המכוון לפלסטידים, או לאחר שימוש ב-CFDA לצביעת כלורופלסטים מ-N.benthamiana או מ-Spinachia oleracea. בעת ביצוע דימוי של תאים חיים של סטרומולות, חשוב לעבוד במהירות ולמניפולציה מינימלית של רקמת הצמח.בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון השתקת גנים או טיפולים כימיים, כדי לגלות שחקנים מולקולריים או מסלולים נוספים המעורבים ביצירת סטרומולות (stromules) ובתפקודן. טכניקה זו שימשה חוקרים בביולוגיה של תאי צמחים ובחסינות צמחים כדי לחקור את תפקידן של הסטרומולות במסלולי איתות תאיים ובתגובות של צמחים לפתוגנים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן חישוב שכיחות הסטרומולות בעלה, וכיצד לצפות בסטרומולות בתוך כלורופלסטים שבודדו.וזכרו כי הלייזרים והמתח החשמלי המספקים את ההזנה למיקרוסקופ קונפוקאלי סורק הם עלולים להיות מסוכנים ביותר, וחשוב להבין את דרישות המערכת לשימוש בציוד זה.

visualizing-stromule-frequency-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

מקור: Schlimpert, S. et al. הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים השלם של S. venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים המלא של החיידק Streptomyces venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי כדי להמחיש נביטה, צמיחת קורים ונבגים בזמן אמת.

הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים של Streptomyces venezuelae

סרטון זה מדגים כיצד שלפוחיות עצביות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי לדמיין את תנועתן. ראשית, פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי מודגר עם סוכן טרנספקציה ולאחר מכן מוכנס לתרבית של נוירונים. לאחר מכן, תמונות של הנוירונים נרכשות ומנותחות כדי לעקוב אחר תנועת השלפוחיות.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות מיקרוסקופ STED בו-זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של microtubule פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B שהופצו על coverslips מצופה נוגדנים לקולטן B-cell, מודל עבור השלב הראשוני היווצרות מערכת החיסון סינפסה.

להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים...

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

4D מיקרוסקופ של שמרים

מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

למד לדמיין תדר סטרומולות בכלורופלסטים של Nicotiana benthamiana באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. השיטה מספקת נתונים אמינים על דינמיקת מבני הכלורופלסט בצמחים.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים