ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

המטרה הכוללת של טכניקת ציטומטריה ספקטרלית זו היא להבחין בין פלואורוכרומים שונים באמצעות כל ספקטרום הפליטות שלהם. מעבר לכך, פרוטוקול זה מאפשר יישום של אוטופלואורסצנציה כפרמטר עצמאי, המאפשר ניתוח נכון של תאים מבודדים מאיברים מוצקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי אימונולוגיה והתפתחות ביולוגיה של תאי גזע, כגון כיצד לזהות אוכלוסיות תאים נדירות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת הייחודית שלה לנתח בו זמנית מספר רב של פרמטרים, ולנהל את האוטופלואורסצנטיות של רקמות מוצקות. למרות ששיטה זו משמשת להכנת תרחיף תא בודד שמקורו במעי ובלב, ניתן ליישם אותה גם על איברים אחרים, כגון ריאות, שלד, שרירים, כבד, שומן וכליות. כדי להתחיל, יש לבודד ולשטוף את המעי הדק מעכבר בוגר.

לאחר מכן, הניחו את הטישו על מגבת נייר, ובעזרת מספריים חדים, הסירו בזהירות את המדבקות של פייר. פתח את המעי על ידי חיתוך לאורך וחלק אותו לחתיכות סנטימטר אחד. לאחר מכן, העבירו את הטישו לכוס מלאה ב-30 מיליליטר HBSS בתוספת עשרה אחוז FCS, ודגרו אותה ב-37 מעלות צלזיוס תוך ערבוב מתמיד במשך 30 דקות.

לאחר השלמת הדגירה העבירו את תרחיף התא לצינור פלסטיק של 15 מיליליטר ומערבלו אותו במרץ במשך חמש דקות. לאחר מכן, דגרו את התרחיף על קרח למשך עשר דקות כדי לאפשר לשברים גדולים ולא מנותקים למשקע. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש וסובבו את התאים בעוצמה של 120 פעמים G במשך שבע דקות.

לאחר הגלולה, אנו משעים את התאים בעשרה מיליליטר של אחוז אחד FCS ב-HBSS וסופרים אותם באמצעות תא נויבאואר. לפני צביעת התאים, העבירו אחת פעמים עשר עד תאי המעי השישי לצינור של חמישה מיליליטר כדי להכין בקרה שלילית. להכנת דגימה, הוסף פעם אחת עשר עד שישית של תאי המעי, ואחריה שני מיליליטר של HBSS עם אחוז אחד FCS לצינור חדש של חמישה מיליליטר וצנטריפוגה את התרחיף ב-120 פעמים G, בארבע מעלות צלזיוס, למשך חמש דקות.

לאחר השלכת הסופרנטנט, אנו משעים את התאים ב-50 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים. עטפו את נייר האלומיניום של הצינור ודגרו את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר השלמת הדגירה, הוסף לדגימה שני מיליליטר של אחוז אחד FCS ב-HBSS וצנטריפוגה ב-120 פעמים G, ארבע מעלות צלזיוס, למשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של 0.5 מיקרוגרם לתמיסת פרופידיום יודיד. לאחר עריפת ראשו של עובר עכבר, יש להשרות את גופו בצלחת פטרי, מרופדת במגבת נייר רטובה מראש, וממולאת ב-50 מיליליטר של אחוז אחד FCS ב-HBSS. תחת סטריאומיקרוסקופ בצע חתך בצד ימין של חזה העובר ופתח בזהירות את בית החזה, הימנע מפגיעה בלב.

תפסו את כלי הדם הגדולים ומשכו החוצה את הלב המחובר לריאות ולבלוטת התימוס. העבירו את האיברים לצלחת פטרי של 35 מיליליטר מלאה בשני מיליליטר של אחוז אחד FCS ב-HBSS. לאחר מכן, בודדו את הלב מהאיברים ומרקמת החיבור שמסביב.

לאחר שטיפת הלב, יש להשרות אותו במיליליטר אחד של תמיסה אנזימטית מחוממת מראש, ובעזרת מלקחיים עדינים ואזמל, לטחון את האיבר לחתיכות מילימטר מעוקב אחד תחת סטריאומיקרוסקופ. הוסף מיליליטר נוסף של תמיסה אנזימטית מחוממת מראש והעביר את הרקמה המפוצלת לצינור מכוסה של חמישה מיליליטר. דגרו את הדגימה במצב אופקי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר השלמת הדגירה, הומוגניזציה של הרקמה על ידי פיפטינג חוזר ונשנה של המתלה עם פיפטה P1000. לאחר מכן, הניחו את הדגימות, הממוקמות אנכית, בצד עד ששברי הרקמות הלא מעוכלות ישקעו. העבירו את הסופרנטנט לצינור של 50 מיליליטר.

הוסף שני מיליליטר של עשרה אחוז FCS ב-HBSS והשאר את התאים המבודדים על קרח. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של תמיסה אנזימטית מחוממת מראש לצינור של חמישה מיליליטר המכיל את משקעי הרקמה הלא מעוכלת, והמשיכו לעכל את הרקמה כפי שהוצג קודם לכן עד שלא נצפתה רקמה שנותרה. צנטריפוגה את תרחיף התאים המתקבל ב -120 פעמים G למשך עשר דקות.

לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של אחוז אחד FCS ב-HBSS, ללא סידן ומגנזיום. כדי להכתים את תאי הלב, העבירו 200 מיקרוליטר של תרחיף התאים לבארות של צלחת 96 בארות תחתונה עגולה. צנטריפוגה את הצלחת ב -480 פעמים G למשך דקה אחת והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, השעו מחדש את תאי הלב ב-100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים. עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדגרים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר השלמת הדגירה, שטפו את תאי הלב ב-200 מיקרוליטר של אחוז אחד FCS ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום, וצנטריפוגה את התרחיף ב-480 פעמים G למשך דקה אחת.

לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של אחוז אחד FCS ב-HBSS ללא סידן ויון מגנזיום, והעבירו את התרחיף לצינור של חמישה מיליליטר מלא מראש ב-200 מיקרוליטר של אחוז אחד FCS ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום. לבסוף, הוסף 400 מיקרוליטר של אחוז אחד FCS ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום, המכילים 0.5 מיקרוגרם למיליליטר פרופידיום יודיד וסנן את תרחיף התא דרך רשת ניילון של 70 מיקרו. כדי לדמיין את התאים, טען את הדגימה המוכתמת לציטומטריית זרימה ולחץ על תצוגה מקדימה, ולאחר מכן רשום עד פעמיים עשרה עד שישי אירועים בדגימה על ידי לחיצה על רכישה.

בכרטיסיית הניתוח, פתח את חלון פלטת הצבעים ורשום את כל הפרמטרים שנלמדו על ידי הוספת הפלואורוכרום יחד עם הסמן המתאים לו. הקפד לכלול פרמטרים של אוטופלואורסצנטיות וכדאיות. בחלון הבקרה, בתוך רשימת הצינורות, נתח את הדגימה המוכתמת הראשונה המכילה חרוזי פיצוי.

לאחר מכן, בגליון העבודה, לחץ על כלי עיצוב המצולע ושער את אוכלוסיית החרוזים בעלילת FSC SSC. לחץ פעמיים על השער כדי ליצור חלקת בת של החרוזים המגודר. ואז שער חרוזים חיוביים ושליליים בנפרד.

אמת את אוכלוסיית הבת שנבחרה על ידי שער עוקב וביטול חריגים בכל חלק חיובי ושלילי. לאחר מכן, העלה את השערים השליליים והחיוביים בחלון ביטול הערבוב. לאחר מכן, בחר את דגימת התאים הלא מוכתמים ברשימת הצינורות ותכנן שערים נפרדים לתאים אוטו-פלואורסצנטיים ולא אוטו-פלואורסצנטיים.

לאחר הגדרת השערים השליליים והחיוביים עבור כל הפרמטרים, כולל אוטופלואורסצנטיות וכדאיות, לחץ על חשב. לאחר מכן, החל ביטול ערבוב על הדגימות שנותחו. כדי לנתח נתונים, שער את התאים בחלקה של SSC לעומת FSC והוצא תאים מתים מוכתמים בפרופידיום יודיד.

לבסוף, קבע שערים לכל האוכלוסיות המעניינות. מוצגות כאן תוצאות של ניתוחי ציטומטריית זרימה וציטומטריה ספקטרלית של התאים שבודדו מלב העובר וצבועים בנוגדנים נגד TER119, אנטי-CD45 ואנטי-Sca-1. תת-קבוצה של תאים אוטו-פלואורסצנטיים זוהתה על ידי שני ציטומטרים קונבנציונליים בעוד שבציטומטריה ספקטרלית תאים אלה לא הוגדרו כאוטו-פלואורסצנטיים ונכללו באוכלוסייה השלילית CD45 TER119.

התאים שזוהו על ידי ציטומטריית זרימה קונבנציונלית כאוטו-פלואורסצנטיים, אך לא תאים חיוביים CD31 נותחו לאחר מכן לביטוי התעתיקים הספציפיים לקרדיומיוציטים. רמות גבוהות של טרופונין לבבי ומיוציטים פרוזדוריים כמו תעתיקי רכבת נמצאו באוכלוסיית תאים אוטו-פלואורסצנטיים, מה שמאשר כי תת-קבוצה גדולה של מיוציטים לבביים חסרה בציטומטריית זרימה קונבנציונלית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשמונה שעות, אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל השלבים יבוצעו על קרח ובאחוזה בזמן כדי להבטיח שהתאים יישארו ברי קיימא. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע חלבונים תוך-תאיים וניתוחים של סמני שטח נוספים על מנת לענות על שאלות הנוגעות למסלולים מולקולריים ספציפיים. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה וביולוגיה התפתחותית או תאי גזע לחקור ולבודד אוכלוסיות נדירות מאיברים שונים.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולהכתים תאים מרקמות תאיות, וכיצד לנתח ביטוי סמני פני השטח על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרלית המתגברת על מגבלות הנובעות מאוטופלואורסצנציה של תאים. אל תשכח שעבודה עם פרופידיום יודיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש ב-PPE בעת ביצוע הליך זה.