ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

המטרה הכללית של טכניקת הספקטרל ציטומטריה זו היא להבחין בין פלואורוכרומים שונים באמצעות ספקטרומי הפליטה המלאים שלהם. יתרה מכך, פרוטוקול זה מאפשר את יישום האוטופלואורסצנציה כפרמטר עצמאי, מה שמאפשר ניתוח נכון של תאים שבודדו מאיברים מוצקים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה ופיתוח הביולוגיה של תאי גזע, כגון הדרך לזיהוי אוכלוסיות תאים נדירות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא יכולתה הייחודית לנתח בו-זמנית מספר רב של פרמטרים, ולנהל את האוטופלורסצנציה של רקמות מוצקות. אף על פי ששיטה זו משמשת להכנת תרחיף תאים בודדים המופק מהמעי ומהלב, ניתן להחילה גם על איברים אחרים, כגון ריאה, שריר שלד, כבד, רקמת שומן וכליה. ראשית, יש לבודד ולשטוף את המעי הדק מעכבר בוגר.

לאחר מכן, הניחו את הרקמה על נייר סופג, ובעזרת מספריים חדים, הסירו בזהירות את ה-Peyer's patches. פתחו את המעי על ידי חיתוך לאורכו וחלקו אותו למקטעים של סנטימטר אחד. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לכלי כימי המכיל 30 milliliters של HBSS מועשר ב-ten percent FCS, והדגירו אותה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תחת ערבוב מתמיד למשך 30 דקות.

עם סיום הדגירה, העבירו את תרחיף התאים לפרועת פלסטיק של 15 מיליליטר ובצעו ערבוב חזק במכשיר וורטקס (vortex) למשך חמש דקות. לאחר מכן, הדגרו את התרחיף על קרח למשך עשר דקות כדי לאפשר לשברים גדולים שאינם מופרדים לשקוע. לאחר מכן, העבירו את העילאי לפרועת חדשה וסובבו את התאים בנפח של 120 ×g למשך שבע דקות.

לאחר השקיעה, נשחה את התאים בעשרה מיליליטר של 1% FCS ב-HBSS ונספור אותם באמצעות תא נב באואר (Neubauer chamber). לפני צביעת התאים, העבירו 1x10⁶ תאי מעי למבחנה של חמישה מיליליטר כדי להכין בקרת שלילה. כדי להכין דגימה, הוסיפו 1x10⁶ תאי מעי, ולאחריהם שני מיליליטר של HBSS עם 1% FCS, למבחנה חדשה של חמישה מיליליטר וסבבו את התמיה בצנטריפוגה ב-120 ×g, בטמפרטורה של 4°C, למשך חמש דקות.

לאחר השליכה של הנוזל העליון (supernatant), נשחיה את התאים ב-50 µL של תמיסת הנוגנים. נעטוף את המבחנה בנייר אלומיניום ונדגיר את התאים בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. עם סיום הדגירה, נוסיף למדגם 2 mL של 1% FCS ב-HBSS ונצנטריפיג אותו ב-120 ×g, בטמפרטורה של 4 °C, למשך חמש דקות.

שפכו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את המשקע ב-200 µL של תמיסת propidium iodide בריכוז 0.5 µg/mL. לאחר עקיפת ראשו של עובר עכבר, השרו את גופו בתוך צלחת פטרי, מרופדת בנייר סופג רטוב ומלאה ב-50 mL של 1% FCS ב-HBSS. תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, בצעו חתך בצדו הימני של בית החזה של העובר ופתחו בזהירות את בית החזה, תוך הימנעות מפגיעה בלב.

תפסו את כלי הדם הגדולים ושלפו את הלב המחובר לריאות ולתימוס. העבירו את האיברים לצלחית פטרי בנפח 35 מיליליטר המכילה שני מיליליטר של 1% FCS ב-HBSS. לאחר מכן, בודדו את הלב מהאיברים הסובבים וממרקמת החיבור.

לאחר שטיפת הלב, השרה אותו ב-1 ml של תמיסה אנזימטית שחוממה מראש, ובאמצעות פינצטה עדינה וסקלפל, קצץ את האיבר לחתיכות של 1 mm³ תחת מיקרוסקופ סטריאו. הוסף 1 ml נוסף של תמיסה אנזימטית שחוממה מראש והעבר את הרקמה המקצוצת למבחנה עם פקק בנפח 5 ml. דגור את הדגימה במצב אופקי בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.

עם סיום הדגירה, הומוגניזו את הרקמה באמצעות פיפוט חוזר של התסמין עם פיפט P1000. לאחר מכן, הניחו את הדגימות במצב אנכי בצד, עד ששברי הרקמות שלא התעכלו ישקעו. העבירו את הנוזל העליון למבחנה של 50 milliliters.

הוסיפו שני מיליליטרים של 10% FCS ב-HBSS ושמרו את התאים המבודדים על קרח. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטרים של תמיסה אנזימטית שחוממה מראש לשפרו של חמישה מיליליטרים המכיל את משקע הרקמה שלא עובש, והמשיכו בעיכול הרקמה כפי שהודגם קודם לכן עד שלא תצפה רקמה שנותרה. סנטריפוגו את תרחיף התאים שהתקבל ב-120 ×g למשך עשר דקות.

לאחר מכן, השליכו את הנוזל העילאי ותלו את התאים ב-1 milliliters של 1% FCS ב-HBSS, ללא קטיוני סידן ומגנזיום. לצביעת התאים הלביאתיים, העבירו 200 microliters של תרחיף התאים לבארי של פלטת 96 בארים בעגולה. סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-480 ×g למשך דקה אחת והשליכו את הנוזל העילאי.

לאחר מכן, השהו מחדש את תאי הלב ב-100 µL של תמיסת הנוגדנים. עטפו את הפלטה בנייר אלומיניום והדגירו אותה בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. עם סיום הדגירה, שטפו את תאי הלב ב-200 µL של 1% FCS ב-HBSS נטול סידן ומגנזיום, וסובבו את התוך-סלולית ב-480 ×g למשך דקה אחת.

לאחר מכן, השעה מחדש את התאים ב-200 µL של 1% FCS ב-HBSS נטול יוני סידן ומגנזיום, והעבר את התרחיף למבחנה של 5 mL שמולאה מראש ב-200 µL של 1% FCS ב-HBSS נטול סידן ומגנזיום. לבסוף, הוסף 400 µL של 1% FCS ב-HBSS נטול קטיוני סידן ומגנזיום, המכיל 0.5 µg/mL של propidium iodide, וסנן את תרחיף התאים דרך רשת ניילון של 70 µm. כדי להimagen את התאים, טען את הדגימה הצבועה למכשיר flow cytometry ולחץ על preview, ולאחר מכן רשום עד 2×10⁶ אירועים בדגימה על ידי לחיצה על acquire.

בלשונית הניתוח, פתח את חלון פלטת הצבעים ורשום את כל הפרמטרים הנחקרים על ידי הוספת הפלואורוכרום יחד עם הסמן המתאים לו. ודא שכללת פרמטרים של autofluorescence וחיוניות (viability). בחלון הבקרה, בתוך רשימת המבחנות, נתח את הדגימה הראשונה שצבועה בצבע בודד ומכילה חרוזי פיצוי (compensation beads).

לאחר מכן, בגיליון העבודה, לחצו על כלי עיצוב הפוליגון (polygon design tool) וסמנו (gate) את אוכלוסיית החרוזים בגרף FSC SSC. לחצו פעמיים על השער (gate) כדי ליצור גרף בת (daughter plot) של החרוזים שסומנו. לאחר מכן, סמנו את החרוזים החיוביים והשליליים בנפרד.

אששו את אוכלוסיית הבת שנבחרה באמצעות gating רצופי וסילוק חריגים בכל אחד מהמקטעים החיוביים והשליליים. לאחר מכן, העלו את ה-gates השליליים והחיוביים לחלון ה-un-mixing. בשלב הבא, בחרו את דגימת התאים שאינם צבועים מרשימת המבחנות והגדירו gates נפרדים לתאים עם פלואורסצנציה עצמית ולתאים ללא פלואורסצנציה עצמית.

לאחר הגדרת השערים השליליים והחיוביים עבור כל הפרמטרים, כולל פלואורסצנציה עצמית וחיוניות, לחצו על calculate. לאחר מכן, החילו un-mixing על הדגימות שנותחו. כדי לנתח את הנתונים, הגדירו שער לתאים בגרף של SSC מול FSC והחריגו תאים מתים שצבעו ב-propidium iodide.

לבסוף, קבעו את השערים (gates) עבור כל האוכלוסיות הרלוונטיות. מוצגים כאן תוצאות של ניתוחי פלוו-ציטומטריה וציטומטריה ספקטרלית של תאים שבודדו מלב לב עוברי ונצבעו עם נוגדנים נגד TER119, CD45 ו-Sca-1. תת-אוכלוסייה של תאים בעלי פלואורסצנציה עצמית זוהתה על ידי שני ציטומטרים קונבנציונליים, בעוד שבציטומטריה ספקטרלית תאים אלו לא הוגדרו כבעלי פלואורסצנציה עצמית ונכללו באוכלוסייה השלילית ל-CD45 ו-TER119.

התאים שזוהו באמצעות פלוו ציטומטריה קונבנציונלית כבעלי פלואורסצנציה עצמית, אך לא כתאים חיוביים ל-CD31, נותחו לאחר מכן לבדיקת הביטוי של תמלילים הספציפיים לקריומיocytes. רמות גבוהות של Cardiac troponin ותמלילים דמויי myocytes של העליות נמצאו באוכלוסיית התאים בעלי הפלואורסצנציה העצמית, מה שמאשר שתת-קבוצה גדולה של cardiomyocytes מפספסת בפלוו ציטומטריה קונבנציונלית. לאחר שליטה בשיטה, ניתן לבצעה בכשמונה שעות, במידה והיא מבוצעת כהלכה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יש לבצע את כל השלבים על קרח ובאופן מהיר כדי להבטיח את חיוניות התאים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע ניתוחים של חלבונים תוך-תאיים ושל סמנים נוספים על פני השטח כדי לענות על שאלות הנוגעות למסלולים מולקולריים ספציפיים. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה של התפתחות או תאי גזע לחקור ולבודד אוכלוסיות נדירות מאיברים שונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה של האופן שבו מבודדים וצובעים תאים מרקמות תאיות, וכיצד מנתחים ביטוי של סממנים על פני השטח באמצעות ציטומטריה זרימה ספקטרלית (spectral flow cytometry), המתגברת על מגבלות הנובעות מאוטופלורסצנציה של התאים. זכרו כי עבודה עם propidium iodide עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש בציוד מגן אישי (PPE), בעת ביצוע הליך זה.