חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

פרוטוקול זה ממחיש את הצעדים החשובים רצופים הנדרש כדי להעריך את הרלוונטיות של ניטור חיוניות פרמטר בתהליכי תיקון ה-DNA להחיות Bacillus subtilis נבגים לאחר הטיפול עם לחץ נמוך פלזמה על-ידי מעקב מתויג פלורסצנטיות DNA תיקון חלבונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים זמן לפתור קונפוקלית וסריקה.

המטרה הכוללת של מערך שיטות עוקבות זה היא לדמיין ולנטר פרמטרים של חיוניות בתיקון DNA בהחייאת נבגי Bacillus subtilis לאחר טיפול בפלזמה בלחץ נמוך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי שנפתר בזמן ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק. השיטה שלנו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השבתה ועיקור מיקרוביאלים. זה עוזר לנו לנתח את ההשפעה המזיקה של טיפול בפלזמה בלחץ נמוך על אינדיקטורים ביולוגיים כגון נבגי Bacillus subtilis.

היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שאנו משלבים מספר שיטות לקביעת תצוגה, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים וניטור תיקון ה-DNA באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תוצאת זמן על מנת לאמת את ההשפעה המזיקה של טיפול בפלזמה בלחץ נמוך. כדי לבצע ייצור נבגים, העבירו תרבית לילה של חמישה מיליליטר מזן B.subtilis המתאים בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה ל-200 מיליליטר של מדיום נבגי מעצב נוזלי בעוצמה כפולה וטפחו אותו עם אוורור נמרץ ב-37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות לפחות או יותר עד שיותר מ-95% מהתרבית נבגה. קצרו נבגים בצינורות של 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב-3000 גרם למשך 15 דקות וטהרו את הדגימות באמצעות H2O מזוקק סטרילי בשלבי כביסה חוזרים ונשנים.

בדוק את מצב הטוהר והנביטה על ידי מיסקרוסקופיה של ניגודיות פנים וודא כי תרחיפי נבגים מורכבים מיותר מ-99% מנבגי פאזה בהירים והם נקיים מתאים וגטטיביים, נבגים מונבטים ופסולת תאים, אחרת ניסויי מיקרוסקופיה נוספים עלולים להיות מופרעים. קבע את טיטר הנבגים על ידי ציפוי של 50 מיקרוליטר של דילול סדרתי פי עשרה על אגר LB כדי לחשב את ה-CFUs ולדגור את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה. לאחר קביעת CFU, התאם את הדגימה ל-10 עד 9 נבגים למיליליטר על ידי ריכוז או שימוש במים סטריליים כדי לדלל את הדגימות.

הנח מנשא דגימה בצורת שקופיות מיקרוסקופיות מעוקרות או החלקות כיסוי עגולות של 25 מילימטר בתוך יחידת ריסוס התרסיס המופעלת חשמלית ביישור עם הזרבובית. העבירו את תרבית הנבגים לכניסת נוזל הזרבובית והתחילו את הריסוס ב-0.15 שניות בלחץ של 1.3 בר. תרחיף הנבגים המרוסס יוצר סרט דק על המגלשה המיקרוסקופית שמתייבש במהירות תוך שניות ליצירת שכבת מונו נבגים מפוזרת באופן אחיד.

אחסן את נושאי הדגימה המטופלים בכלי סטרילי בטמפרטורת החדר. כדי לנקות ולחמם את כל המשטחים במערכת הפלזמה, הפעל את המערכת בחמישה פסקל עם פלזמת ארגון ב-500 וואט למשך חמש דקות. הטיפול המקדים מפחית את הדבקת המולקולות מהאוויר הסביבתי כגון חנקן, חמצן ומים במהלך אוורור החדר.

לאחר אוורור החדר, הנח בזהירות את הדגימות על מדפי זכוכית במרכז כלי הכור. סגור את החדר ופנה אותו. לאחר מכן, השתמש בגז התהליך הרצוי כדי למלא את החדר ולווסת את הלחץ במערכת לחמישה פסקל.

לאחר מכן, התחל את תהליך הפלזמה. לאחר זמן התהליך שהוגדר, כבה את אספקת החשמל והגז ואוורר בזהירות את המערכת כדי למנוע ניפוח הדגימות ממחזיק המדגם. לאחר האוורור, הסר את הדגימות ואחסן אותן בכלי סטרילי.

עבור בקרות שאינן מטופלות בפלזמה, חשוף דגימות לוואקום רק בנוכחות גז התהליך השווה לזמן הפלזמה הארוך ביותר המיושם. הכן תמיסה של 10% פוליוויניל אצטט או PVA חיטוי והשתמש ב -500 מיקרוליטר ממנו כדי לכסות בזהירות את נושאי הדגימה. לאחר שנתנו להם להתייבש באוויר במשך ארבע שעות, השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להסיר את שכבת ה-PVA המיובשת המכילה כעת את דגימת הנבגים ולהעביר אותה לצינור תגובה של 2 מיליליטר.

הוסף מיליליטר אחד של מים סטריליים לצינור ומערבל אותו כדי להמיס את שכבת ה-PVA כדי לשחזר יותר מ-95% מהנבגים המסוגלים לנבוט. השתמש במים סטריליים כדי לדלל באופן סדרתי את הדגימה ב-1 עד 10 בצלחת של 96 בארות. לאחר ציפוי של 50 מיקרוליטר מכל דילול על אגר LB, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה, ספרו את מספר המושבות וקבעו את ה-CFUs למיליליטר.

לניסויי נביטה, הכינו כרית אגר בעובי 1.5 ק"ג בעובי מילימטר על ידי הרתחת 700 מיקרוליטר מדיום ופיפטה אותה למיקרוסקופיה סטרילית. לאחר 10 דקות, השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך כרית אגר LB של שמונה מילימטר על שמונה מילימטר על מילימטר אחד, והעביר בזהירות את האגר על גבי שכבות הנבגים החד-שכבתיות המונחות על פתקי כיסוי זכוכית של 25 מילימטר שכבר מותקנים בתא הדמיה. שיטת אגר פוט משלבת שתי פונקציות ספציפיות.

זה מייצב את הדגימות במישור האופטי במהלך מיקרוסקופ לייזר והוא מגביל את תנועת התאים לרוחב. מלבד השימוש בו עבור מאמרי נביטה, ניתן ליישם שיטה זו על מיקרואורגניזמים אחרים כמו גם על תאים אוקריוטיים. לאחר כיסוי הדגימה באגר, העבירו במהירות את החלקה של מכסה הזכוכית לתא הדמיה.

שמור את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס על במה מחוממת במהלך כל תהליך ההדמיה. השתמש בשלושה שכפולים ביולוגיים לפחות עבור כל תנאי. לאחר הדמיית הדגימות על ידי סריקת לייזר קונפוקלית אוטומטית ומיקרוסקופ שדה בהיר, הקלט סדרות זמן-lapse עם עוצמת לייזר של 2.6% והגדר את הצמצם הקונפוקלי לחמש יחידות אוויר ותדירות דגימה של פריים אחד ל-30 שניות מאפס לחמש שעות בהתאם לניסוי.

שימוש במינונים גבוהים של אור מונוכרומטי, עלול לעכב לחלוטין את נביטת הנבגים במהלך מיקרוסקופ לייזר. לכן, השתמש בעוצמת הלייזר ובמרווחים ארוכים יותר לקבלת מסגרות בודדות. במקרה של צבירת נבגים, פיזור נבגים רב שכבתי או זיהום על ידי חלקיקי אבק, עלולה להתרחש חסימה של טיפול הפלזמה או הצללה ולאפשר נביטה של נבגים מוצלים.

כדי לבצע מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, לאחר שחד-שכבות הנבגים קודדו בפלדיום זהב, דמו את הדגימות עם SEM פליטת השדה המופעל במתח תאוצה של חמישה קילו-וולט כולל גלאי אלקטרונים משני inlan כדי לחשוף ניגודיות טופוגרפית. כפי שמוצג בגרף זה, טיפול בפלזמה בנבגי B.subtilis מביא לירידה בהישרדות עם הגדלת משך הטיפול בפלזמה. תמונות SEM אלה חושפות מבנים דמויי רכס אורכיים אופייניים, הנראים כל הזמן בכל הנבגים המטופלים והלא מטופלים.

טיפול בפלזמה עד 30 שניות, אינו גורם לשינויים משמעותיים במורפולוגיה של פני הנבגים בהשוואה לביקורת. הגדלת משך הטיפול בפלזמה מובילה למשטח גרגירי יותר וניתן להבחין בסדקים וסדקים קטנים בנבגים שטופלו במשך 120 או 240 שניות. בזמן זה נפתרו ניסויי מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית, כמעט כל הנבגים שטופלו בוואקום כבקרה נובטים ומפתחים מורפולוגיה של תאים בצורת מוט עם אורך אחיד למדי של תאים בודדים.

לעומת זאת, נבגים שטופלו במשך 15 שניות בפלזמה כבר מראים יכולת נביטה מופחתת של פחות מ-75 פלוס מינוס ארבעה אחוזים. בנוסף, תאים גדלים למוטות ארוכים מאוד או נשארים קטנים ונדבקים במעטפת הנבגים. לאחר 30 שניות של טיפול בפלזמה, רק 25 פלוס מינוס שישה אחוזים מהנבגים נובטים ותאים צמחיים מתעכבים באופן משמעותי בצמיחה ומשתנים באורכם.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לאשר את איכות החד-שכבות של הנבגים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה על מנת להבטיח שאין נבגים חופפים או נובטים. לאחר פיתוחה, שיטת כרית האגר לייצוב תמונה, סללה את הדרך לחוקרים בעיקור פלזמה ומיקרוסקופ תאים חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד להכין חד-שכבות נבגים על שקופיות זכוכית, קביעת שימוש באמצעות טיפולי פלזמה להשבתת נבגים ולבצע מיקרוסקופ אלקטרונים חי וסריקה.

בניגוד לשיטות טיהור אחרות, למשל אתילן אוקסיד או קרינת גמא, עיקור פלזמה הוא גישה יעילה ובטוחה להפחתת מספר מיקרואורגניזמים לא רצויים כמעט על כל סוג של משטח.