Name: שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג וקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: למדו כיצד להשתמש בהפרעת RNA דרך בליעה אוראלית של RNA דו-גדילי בליפוזומים כדי להשתיק גנים במעי התיכון של תיקן גרמני. שיטה זו מציעה אסטרטגיות חדשות לבקרת מזיקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מטייוואן (משרד המדע והטכנולוגיה, 100-2923-B-002-002-MY3 ביותר 106-2313-B-002-011-MY3 כדי H.J.L.), צ'כיה (גרנט אוניברסיטת סוכנות דרום בוהמיה, gaju ב להעניק 065/2017/P Y.H.L), ו (ספרד משרד הכלכלה הספרדית ואת התחרותיות, מעניקה CGL2012-36251 ו- CGL2015-64727-P X.B., הממשלה קטלאנית, להעניק 2014 SGR 619 X.B.); זה גם קיבלו תמיכה כספית מהקרן האירופאית כלכלי ולפיתוח אזורי (פדר כספים X.B.).

1. סינתזה והכנה של dsRNA
<ol><li>לזהות את האתרים היעד dsRNA באזור 3' לא מתורגם של גנים היעד. DsTub משמש עבור מיקוד הגן α-טובולין (באמבטיה) (מספר גישה GenBank: KX228233), dsEGFP כמו פקד dsRNA שלילי מתוכנן מרצף משופר פלורסצנטיות ירוק חלבון (EGFP; מספר גישה GenBank: LC311024).</li>
	<li>לבצע הגברה סטנדרטי PCR לסנתז את התבניות dsRNA עם גנים ספציפיים תחל המכיל את רצף יזם T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). ה-PCR הגברה תנאים ומידע פריימר להשתמש הם אלה דיווח מאת לין ואח. (2017) 12 (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להמשיך עם הכנה dsRNA באמצעות תיעוד T7 קיט (ראה טבלה של חומרים), ההוראות של היצרן. הערה: להניב כמות גבוהה dsRNA, לערבב שני בתגובות שפופרת אחת (ב µL 40 סה כ), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של DNase (ראה טבלה של חומרים) לתוך dsRNA דגימות למשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לתבניות DNA תקציר.</li>
	<li>להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL (ראה טבלה של חומרים), 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.</li>
	<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.</li>
	<li>לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.</li>
	<li>להסיר את אתנול וביו -גלולה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי למשך 3 דקות, ולאחר מכן resuspend dsRNA עם RNase ללא מים.</li>
	<li>לקבוע את כמות dsRNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח (ראה טבלה של חומרים) לפי הוראות היצרן ולהתאים לריכוז הרצוי (לדוגמה, µg/µL 0.25 עבור הכנת dsRNA lipoplexes).</li>
	<li>אחסן את הדגימות dsRNA ב-20 ° C עד 3 חודשים.</li>
</ol>2. הכנת dsRNA Lipoplexes
<ol><li>µL 4 מהתרכובת תרביות תאים למהול (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%. לדלל 4 µL של dsRNA (1 µg) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%.</li>
	<li>להוסיף את הפתרון ריאגנט ליפוזום מדולל מיד לתוך הפתרון מדולל dsRNA בבת אחת. מערבולת בקצרה כדי לערבב אותם, ואז תקופת דגירה של 15 דקות ב 25 º C. הערה: לא מערבבים את הפתרונות בסדר הפוך.</li>
	<li>Lipoplexes dsRNA מוכנים לשימוש. בתוך שעה של הכנה ושימוש למחוק לאחר 1 שעה. הערה: על פי הוראות היצרן, lipoplexes אמור לשמש בהקדם האפשרי.</li>
</ol>3. אוסף של אנזימים חוץ-תאית מ Hemolymph ומיץ פיתול
<ol><li>
מאגר מלוחים חרקים (מניות x 10)
	<ol>
<li>מערבבים את 900 מ"ל מים מזוקקים כפול עם 109.3 g NaCl, 15.7 גרם אשלגן כלורי, 6.3 g CaCl2ו- 8.3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>להתאים את ה-pH את 6.8, ולמלא עד 1,000 מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף hemolymph
	<ol>
<li>עזים ומתנגד הג'וקים על הקרח עד שהם לא זזים במשך 3 דקות.</li>
		<li>החזק את הג'וק עם שתי אצבעות (באגודל ובאצבע) ולאחר תגביר את הצד הבטני של המקק.</li>
		<li>השתמש את המספריים ויבתר כדי לחתוך את הקצה של coxa של רגל אחורית. הערה: חותכים לצומת המחובר בין coxa לבין תל הירך. הכריתה של החלק השני של coxa היה פחות יעיל כדי לאסוף את hemolymph.</li>
		<li>לסחוט את הבטן בעדינות עם האצבע האמצעית, ולאסוף את hemolymph לדמם החתך עם micropipette 10 µL.</li>
		<li>מאגר של hemolymph של כמה ג'וקים (5 אנשים) צינור microcentrifuge. הערה: שמור את צינורות microcentrifuge על הקרח כדי למנוע melanization. נפח ממוצע של hemolymph המתקבל מקק זכר הוא 2-3 µL.</li>
		<li>ספין למטה hemolymph בקצרה עם צנטריפוגה benchtop 10 s.</li>
		<li>העברת לנפח הרצוי של hemolymph (כלומר, 10 µL), ערבב את זה עם µL 50 x 1 מאגר מלוחים חרקים.</li>
		<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C עד שיהיו תוצאות hemocytes. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.</li>
		<li>לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A28015.</li>
		<li>התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף מיץ פיתול
	<ol>
<li>עזים ומתנגד הג'וקים על קרח. לשדך הג'וקים בצד הגחוני על הצלחת ניתוח קר 1 x מאגר מלוחים חרקים באמצעות סיכות חרקים.</li>
		<li>לנתח את הבטן עם פינצטה משובחים. הסר את הבטן כולה (כולל הבטן הקדמי, אמצע, האחוריות) כדי מאכל טריים עם 1 x מאגר מלוחים חרקים.</li>
		<li>להסיר את הבטן הקדמי ואת האחוריות, העבר במהירות את פיתול לרכבת התחתית microcentrifuge המכיל 100 µL מאגר מלוחים חרקים.</li>
		<li>מאגר של midguts של מקקים 6 באותו צינור ו מערבולת 10 s.</li>
		<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C כדי לסובב את hemocytes ואת הבטן רקמות. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.</li>
		<li>לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A28015.</li>
		<li>התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dsRNA Assay השפלה
<ol><li>להכין טרי 4 µL של dsRNA עירום או dsRNA lipoplexes (1 µg).</li>
	<li>מערבבים מיץ dsRNA אנזימים פתרונות עם µL 10 מאגר מלוחים חרקים (בקרה), שחולצו מן hemolymph, או פיתול.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של EGTA (20 מ מ) או מים נטולי RNase כדי להפריד בין דגימות כפקדי עבור עיכוב של אנזים פעילויות.</li>
	<li>תקופת דגירה של שעה אחת או יותר (6, 12 או 24 שעות) ב 25 º C.</li>
	<li>להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL ו- 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.</li>
	<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.</li>
	<li>לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.</li>
	<li>להסיר את אתנול צניפה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי עבור 3 מינימלית dsRNA Resuspend עם מים ללא RNase µL 10.</li>
	<li>בדוק את תקינות dsRNA שטופלו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל על 1.5% agarose ג'ל.</li>
</ol>5. אוראלי מינהל dsRNA
<ol><li>לשמור על ג'וקים בדיאטה ad libitum של מזון יבש (מזון). לשלול אספקת מים המקקים יום אחד לפני dsRNA בליעה ניסויים.</li>
	<li>החזק מקק על ידי גרירה כנפיו עם המלקחיים גמיש (איור 1, שלב 5). הערה: לא אתפוס את חלקי הגופות של ג'וקים.</li>
	<li>להכין את dsRNA lipoplexes, וכן dsRNA עירום, האכלה, כמתואר בסעיף 2. הערה: Lipoplexes dsRNA צריך להיות מוכן טרי לפני האכלה.</li>
	<li>להאכיל µL 4 של dsRNA lipoplexes או dsRNA עירום (250 ng) עם micropipette.</li>
	<li>לאט לאט pipet ה-droplet של הפתרון dsRNA לסגור mouthparts של מקקים ולתת את הג'וקים להבלע ה-droplet לחלוטין.</li>
	<li>ביצוע הניסויים בליעה פעמיים ביום (h 1 לאחר אורות ו- h 1 לפני האורות) עבור 8 ימים או 16 ימים ברציפות. הערה: כל המקקים רכשה מים רק באמצעות האכלה ידנית עם dsRNA ריאגנטים פתרון או שליטה (למשלמים חינם נוקלאז, תמיסת גלוקוז, ריאגנט ליפוזום) במהלך הניסויים בליעה.</li>
	<li>לספק בקבוקי מים המקקים לאחר 16 ימי בליעה של dsRNA ניסויים.</li>
</ol>6. להעריך את נוקאאוט
<ol><li>בזמן שבחרת נקודות (2, 9, 17 ימים לאחר assay בליעה dsRNA), לאסוף את החרקים dsEGFP - או dsTub-מתייחסים ומנתחים הרקמות שבחרת (למשל, פיתול).</li>
	<li>לבצע PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). לרביעיית-PCR הגברה התנאים והמידע תחל כפי שדווח על ידי לין ואח. (2017) 12.</li>
	<li>להעריך את הבקרה וחרקים שטופלו dsRNA מדי יום כדי לבדוק את התמותה ולהסיר את הג'וקים כי הם כבר לא נעים.</li>
</ol>

<ol><li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicing+and+slicing%3A+The+core+machinery+of+the+RNA+interference+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway.</a> FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/journal/19376448/312">International Review of Cell and Molecular Biology</a>. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).</li>
<li>San Miguel, K., Scott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+insecticides%3A+dsRNA+is+stable+as+a+foliar-applied+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide.</a> Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).</li>
<li>Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+efficiency%2C+systemic+properties%2C+and+novel+delivery+methods+for+pest+insect+control%3A+What+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far.</a> Front. Physiol. 7, (2016).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).</li>
<li>Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+a+cDNA+encoding+extracellular+dsRNase+and+its+expression+in+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Wynant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+functional+characterization+and+phylogenetic+analysis+of+double+stranded+RNA+degrading+enzymes+present+in+the+gut+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).</li>
<li>Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+hypertrehalosemic+hormone+receptor+in+relation+to+hemolymph+trehalose+and+to+oxidative+stress+in+the+cockroach+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica.</a> Exp. Endocrinol. 2, 114(2012).</li>
<li>Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+permethrin+susceptibility+by+glutathione+S-transferase+%28BgGSTD1%29+in+the+German+cockroach+%28Blattella+germanica%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica).</a> J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).</li>
<li>Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+taiman+in+insect+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">A role for taiman in insect metamorphosis.</a> PLOS Genet. 10, 1004769(2014).</li>
<li>Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-2+family+regulates+insect+metamorphosis+by+controlling+the+juvenile+hormone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).</li>
<li>Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+dsRNA+lipoplexes+to+German+cockroach+protects+dsRNA+from+degradation+and+induces+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response.</a> Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).</li>
<li>Gharavi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+cationic+polyamines+for+chiral+microcapsules+and+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).</li>
<li>Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingested+double-stranded+RNAs+can+act+as+species-specific+insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+migratory+locusts+to+systemic+RNA+interference+via+double-stranded+RNA+injection+and+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding.</a> Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).</li>
<li>Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+BmToll9-1+and+RNAi+machinery+genes+to+exogenous+dsRNA+in+the+midgut+of+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori.</a> J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).</li>
<li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+mosquito+and+mosquito-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control.</a> Insects. 8, 4(2017).</li>
<li>Taning, C. N. T., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10340-016-0736-9">Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages.</a> J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).</li>
<li>Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+systems+for+in+vivo+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Lipidic systems for in vivo siRNA delivery.</a> AAPS J. 11, 639-652 (2009).</li>
<li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).</li>
<li>Xia, Y., Tian, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+properties+on+liposomal+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery.</a> Biomaterials. 79, 56-68 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מציג שיטה עבור RNAi יעיל באמצעות משלוח אוראלי של dsRNA lipoplexes, הכוללת הגנה מפני עיכול ribonuclease במיץ פיתול המקק הגרמני. כפי שמוצג מחקרים אחרים במינים חרקים שונים, האפקט RNAi המסכן דרך משלוח אוראלי של dsRNA בעיקר מהצהוב מאת ההשפלה של dsRNA8,9,10. פרוטוקול זה מייצר ליפוזומים לשרת בתור רכב מגן ב משלוח אוראלי של dsRNA נגד השפלה בבטן. בנוסף, הכנת dsRNA lipoplexes הוא פשוטים וישימים בקלות כמו אוראלי RNAi, בפרט עבור ...

RNAi הוכח בתור שיטה יעילה כדי ביטוי גנים תמונות ציפורים באמצעות מנגנון של שביל שתיקה post-transcriptional מופעלות על ידי מולקולות dsRNA פרוקריוטים רבים1. בעשור האחרון של המחקר, RNAi הפך להיות כלי שימושי כדי ללמוד את הפונקציות של גנים מפיתוח להתנהגות depleting הביטוי של גנים ספציפיים באמצעות הזרקת ו/או האכלה של dsRNA ב taxa שונים של חרקים2,3. בשל ירידה לפרטים החוסן של אפקט depleting, היישום של RNAi הוא להיות נחשב כיום כאסטרטגיה פוטנציאליים על המזיק בקרת ניהול4,5. עם זאת, היעילות של RNAi משתנה מאוד בין מיני חרקים, בהתאם של גנים שונים מהווים מטרה ואת שיטות משלוח. גוף גדל והולך של הראיות עולה כי חוסר היציבות של dsRNA, אשר נפגמים בשל ribonucleases, הוא גורם קריטי היעילות המוגבלת של RNAi5,6. למשל, הרגישות RNAi הנמוכה בסקסטה Manduca יש כבר מוסברת על ידי העובדה dsRNA מעורבב עם hemolymph היה מפורק במהירות בתוך שעה7. באופן דומה, הנוכחות של אלקליין nucleases ב פיתול, אשר ביעילות לבזות dsRNA בלע, הוא בחריפות מתואם עם יעילות נמוכה RNAi הזמנות חרקים שונים8,9,10.
מסירת dsRNA אוראלי הוא מעניין במיוחד עבור היישום של RNAi אסטרטגיה בקרת מזיקים, אבל שיטה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת nucleases ב פיתול לא עדיין פותחה, אשר היה פוטנציאל כדי להבטיח אפקטיביות RNAi באמצעות האכלה. עם זאת, בעיית חוסר של RNAi כדי משלוח אוראלי של dsRNA דווחה על-ידי להאכיל כמות גדולה של dsRNA, למשל 50 µg, טוואי המשי, או האכלה ברציפות במשך 8 ימים (8 dsRNA µg סה כ) בהמין המדומה. המקק הגרמני, במיוחד germinica, היא רגישה מאוד RNAi על ידי ההזרקה של dsRNA11,12,13,14, אך לא מגיבים dsRNA באמצעות האכלה. לאחרונה, לין. et al. (2017) הדגימו כי dsRNA במארז עם תוצאות נושאות ליפוזום RNAi מוצלחת כדי נוקאאוט בביטוי הגן α-טובולין התמותה משמעותי פיתול והקו הדק של תיקן גרמני15. כמו ההשפלה של dsRNA בפיתול הגורם המגביל של RNAi אוראלי, נושאות ליפוזום לשמש רכב על dsRNA מפני השפלה, אשר זה רלוונטי ברצון ושאר חרקים עם פעילויות נוקלאז חזק בבטן. ראוי לציין, הסיבה לבחירת הכימית תרביות תאים מסוים (ראה טבלה של חומרים) היינו כמו מנשא ליפוזום בפרוטוקול הנוכחי הוא זה נבדק על תרביות תאים קו תא חרקים עם רעילות פחות, על פי הוראות היצרן. לפי ההשוואה של תרביות תאים ליפוזום שונים במערכות Gharavi. ואח (2013) 16, היעילות של RNA מפריעות קטן transfecting (siRNA) הוא כ זהה בין זה לבין מערכות אחרות זמינים מסחרית אשר שימשו dsRNA מערכות אספקה אחר חרקים17,18 . יתר על כן, שיטת האכלה שלנו הוא זהיר מספיק כדי להבטיח שהכמות הנכונה של dsRNA בליעתו על ידי כל מקק, כי התוצאות אינן מאושרות ועמיד. לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי לבין תוצאות מדגימים כי השימוש dsRNA lipoplexes משפר את יציבות dsRNA ופותח את הדלת בעיצוב של משלוח אוראלי האסטרטגיה של RNAi, אשר הינה גישה מבטיחה להדברה של עתיד.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA במבחנה מגיב טרנספקציה</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>להכנת ליפופלקסים</td></tr><tr><td>תערובת Taq בתוספת</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>עבור PCR</td></tr><tr><td>מהיר SYBR ירוק מאסטר מיקס</td><td>ABI&nbsp;</td><td>4385612</td><td>לערכת qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>לזיהוי UTR 3 אינץ'&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת תמלול MEGAscript T7</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>לסינתזה של dsRNA</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>הסר תבנית DNA מ-dsRNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>עבור dsRNA או מיצוי RNA כולל</td></tr><tr><td>RQ1 RNase Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>הסר תבנית DNA מסך ה-RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>כלורופורם&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>עבור dsRNA או מיצוי RNA כולל</td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>עבור dsRNA או מיצוי RNA כולל</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>עבור dsRNA או מיצוי RNA כולל</td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>להכנת מים ללא RNase</td></tr><tr><td>תמיסת גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>להכנת ליפופלקסים</td></tr><tr><td>נתרן כלורי, NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>נוסחת חיץ מלח חרקים</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי, KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>נוסחת חיץ מלח חרקים</td></tr><tr><td>סידן כלורי, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>נוסחת</td></tr> <tr><td>חיץ מלח חרקיםמגנזיום כלוריד הקסהידרט, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>נוסחת חיץ מלח לחרקים</td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>מעכב אנזים</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td>&nbsp;</tr><tr><td>ניתוח מספריים</td><td>FST</td><td></td><td>נתיחת ג'וקים</td></tr><tr><td>פינצטה עדינה</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>דיסקציה של ג'וקים</td></tr><tr><td>פינצטה גמישה</td><td>FST</td><td></td><td>אחזקת ג'וקים&nbsp;</td></tr><tr><td>פיפטמן</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td>הכנת מדגם</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>אקסיגן</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>הכנת</td></tr><tr><td>מדגם קצה פיפטה&nbsp;</td><td>הכנת דגימת</td> <td>Axygen</td><td></td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>הכנת דגימה</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מיניספין</td><td>קבוצת Gruffin</td><td>GMC 206</td><td>לסיבוב נוזלי למטה&nbsp;</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>הכנת דגימה</td></tr><tr><td>מד pH&nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>עבור pH להתאים</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח</td><td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>חומצת גרעין</td></tr><tr><td>כמותית PCR ציקלר תרמי</td><td>ABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>לתבנית PCR או&nbsp; דגירה של סינתזת dsRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR כמותי בזמן אמת</td><td>ABI&nbsp;</td><td>StepOne פלוס</td><td>ביטוי גנים כמותי</td></tr><tr><td>רכזי ואקום צנטריפוגלי</td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>עבור dsRNA או מיצוי RNA כולל</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>לטעינת דגימות PCR בזמן אמת&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>לגן אלקטרופורזה של חומצות גרעין</td></tr> גן <tr><td>specfifc קדימה preimer</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>גן Specfifc הפוך preimer</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT</td></tr><tr><td>GA dsTub תבנית קדימה פריימר</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>תבנית dsTub פריימר הפוך</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT CTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP תבנית קדימה preimer</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC</td></tr><tr><td>GAG dsEGFP תבנית הפוכה preimer</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA CC</td></tr><tr><td>אמבטיה qPCR קדימה פריימר</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT</td></tr><tr><td>GGC אמבטיה qPCR הפוך preimer</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR קדימה פריימר</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>EF1 qPCRreverse preimer</td><td>tri-I ביוטק</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAA GAC GA</td></tr></tbody></table> G

שימוש מעשי של rna הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי rna ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

התערבות ב RNA (RNAi) הוחל באופן נרחב על חשיפת בפונקציות ביולוגיות של גנים רבים, יש כבר וליטוש של המזיק שליטה בכלי הפועלים על ידי הפרעה של ביטוי גנים חיוניים. למרות שיטות שונות, כגון זריקה, האכלה, ההשרייה דווחו על מסירה מוצלחת של זוגיות גדילי RNA (dsRNA), היעילות של RNAi דרך משלוח אוראלי של dsRNA זה משתנה מאוד בין קבוצות חרקים שונים. המקק הגרמני, במיוחד גרמנית, היא רגישה מאוד ההזרקה של dsRNA, כפי שמוצג על ידי מחקרים רבים שפורסמו בעבר. המחקר הנוכחי מתאר שיטה כדי להדגים כי dsRNA אנקפסולציה עם נשאים ליפוזום מספיקה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת מיץ פיתול. ראוי לציין, ההזנה רציפה של dsRNA אנקפסולציה באמצעות ליפוזומים משמעותית מפחית את הביטוי טובולין, פיתול, והוביל למוות של מקקים. לסיכום, ניסוח וניצול מיטבי של dsRNA lipoplexes, אשר להגן dsRNA נגד nucleases, יכול להיות שימוש מעשי של RNAi הדברת חרקים בעתיד.

ערכה פשוטה של הפרוטוקול למסירה אוראלי של dsRNA מוצג באיור 1, שבו מוצגים השלבים המפתח עבור הכנת dsRNA lipoplexes.
על מנת לחקור את ההגנות המוקנות על ידי ליפוזום נושאות על השפלה dsRNA במיץ פיתול של גרמנית דרבוזמינותו של ex-vivo שבו נערך dsTub lipoplexes היו מודגרות בעסיס פיתול, שלמות dsRNA לאחר מכן נותחו על 1.5% agarose ג'ל. איור 2 מציג פעילות חזקה של נוק...

כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לדלל את ביטוי הגנים במעיים של ג'וקים באמצעות הפרעות RNA באמצעות בליעה אוראלית של RNA דו-גדילי עטוף בנשאי ליפוזום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפיתוח שיטות הדברה חדשות, כגון האם הפלת גנים חיוניים בשדה הפתוח יכולה להרוג מזיקים? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהליפוזום מגן על ה-RNA הדו-גדילי הספציפי לגן כדי להבטיח את העברתו לתא המטרה.ידגימו את ההליך ג'יה-שין הואנג, פוסט-דוקטורנט, ויון ליו, טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הרדימו את הג'וקים על קרח עד שהם לא זזים במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הרם חרק באמצעות האגודל והאצבע המורה כדי לגשת לצד הגחון שלו.לאחר מכן, השתמש במספריים מנתחים כדי לחתוך את קצה הקוקסה של רגל אחורית בין הקוקסה לטרוכנטר. חיתוך במקום אחר בקוקסה פחות יעיל עבור אוספי המולימפ. כעת, מקם מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר בחתך, ולחץ את הבטן בעדינות תוך כדי משיכת ההמולימפה המדממת.חזור על תהליך זה עד שההמולימפה מחמישה ג'וקים נאסף לצינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד. לאחר מכן, סובב לזמן קצר את המולימפה המאוגדת למשך 10 שניות. לאחר מכן, שלב 10 מיקרוליטר של המולימפה עם 50 מיקרוליטר של מאגר מלח חרקים 1x.כעת, צנטריפוגה את המולימפה המדולל למשך 10 דקות כדי לשלוף את ההמוציטים מהתמיסה. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. לבסוף, כמת את ריכוז החלבון הכולל באמצ

practical-use-rna-interference-oral-delivery-double-stranded-rna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד...

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה microinjection לנו יש סטנדרטית, ומשמש מזה מספר שנים כדי לספק כמויות מסוימות של חומצות גרעין ישירות hemolymph של יתושים וזבובים הבית. פרוטוקול זה תוצאות בתמותה הזרקת מינימלית ומאפשר במינון בקורלציה מדידות של פוריות.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר קווים מנחים שלב אחר שלב לטכניקות הפעולה של RNAi ב - P. americana.

יישומים של הפרעות RNA במקק אמריקאי

מוצג כאן פרוטוקול להעברת ננו-חלקיקים chitosan/dsRNA בזחלי בומביקס מורי תולעי משי כדי לגרום להשתקת גנים באמצעות בליעה.

התערבות RNA זחל בתולעי משי Bombyx mori באמצעות Chitosan/dsRNA אספקת ננו-חלקיקים

שיטה זו מתארת סינתזה in vitro בתפוקה גבוהה של mRNA עם כיסוי (capped) וללא כיסוי (uncapped), מפלסמיד ליניארי המכיל את הגן של לוסיפראז Gaussia (GLuc). ה-RNA מטוהר, וחלק מה-RNA ללא הכיסוי עובר תהליך כיסוי אנזימטי באמצעות אנזים הכיסוי של נגיף ה-Vaccinia. בשלב הסופי, ה-mRNA מוחדר (transfection) לתאי HeLa, ותעליל התרבית של התאים נבדק לפעילות לוסיפראז.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

למדו כיצד להשתמש בהפרעת RNA דרך בליעה אוראלית של RNA דו-גדילי בליפוזומים כדי להשתיק גנים במעי התיכון של תיקן גרמני. שיטה זו מציעה אסטרטגיות חדשות לבקרת מזיקים.

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

גלה סרטונים נוספים