שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לדלל את ביטוי הגנים במעיים של ג'וקים באמצעות הפרעות RNA באמצעות בליעה אוראלית של RNA דו-גדילי עטוף בנשאי ליפוזום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפיתוח שיטות הדברה חדשות, כגון האם הפלת גנים חיוניים בשדה הפתוח יכולה להרוג מזיקים? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהליפוזום מגן על ה-RNA הדו-גדילי הספציפי לגן כדי להבטיח את העברתו לתא המטרה.

ידגימו את ההליך ג'יה-שין הואנג, פוסט-דוקטורנט, ויון ליו, טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הרדימו את הג'וקים על קרח עד שהם לא זזים במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הרם חרק באמצעות האגודל והאצבע המורה כדי לגשת לצד הגחון שלו.

לאחר מכן, השתמש במספריים מנתחים כדי לחתוך את קצה הקוקסה של רגל אחורית בין הקוקסה לטרוכנטר. חיתוך במקום אחר בקוקסה פחות יעיל עבור אוספי המולימפ. כעת, מקם מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר בחתך, ולחץ את הבטן בעדינות תוך כדי משיכת ההמולימפה המדממת.

חזור על תהליך זה עד שההמולימפה מחמישה ג'וקים נאסף לצינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד. לאחר מכן, סובב לזמן קצר את המולימפה המאוגדת למשך 10 שניות. לאחר מכן, שלב 10 מיקרוליטר של המולימפה עם 50 מיקרוליטר של מאגר מלח חרקים 1x.

כעת, צנטריפוגה את המולימפה המדולל למשך 10 דקות כדי לשלוף את ההמוציטים מהתמיסה. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. לבסוף, כמת את ריכוז החלבון הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis בנפח מיקרו, והתאם את הריכוז של כל דגימה לשישה מיליגרם חלבון למיקרוליטר.

כדי לאסוף מיץ מעי אמצעי, ראשית, יש להרדים את הג'וקים על קרח. לאחר מכן, העבירו אחד לצלחת חיתוך עמוסה במאגר מלח חרקים קר 1x, והשתמשו בסיכות חרקים כדי לאבטח אותו עם הגחון כלפי מעלה. כעת, נתחו את הבטן בעזרת פינצטה עדינה.

לאחר מכן, הסר את כל המעי והעביר אותו לכלי טרי עם מאגר מלח חרקים 1x. לאחר מכן, בודדו את המעי האמצעי, שהוא האזור שבין היבול לבין הצינוריות המלפיגיות. לשם כך, הסר את החלק הקדמי של החיה והסר את המעי האחורי.

לאחר מכן, העבירו במהירות את המעי האמצעי לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם 100 מיקרוליטר של מאגר מלח חרקים. אסוף את המעיים האמצעיים משישה ג'וקים לאותו צינור. לאחר מכן, מערבל את הצינור למשך 10 שניות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת למשך 10 דקות כדי להפריד את ההמוציטים ורקמות המעי. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי, והתאימו את הריכוז לשישה מיליגרם חלבון למיקרוליטר. יש להשתמש בליפופלקסים RNA דו-גדיליים תוך שעה מההכנה.

במהלך הכנתם, הקפידו לשלב את כל המגיב המדולל עם ה-RNA הדו-גדילי המדולל בו זמנית. לאחר מכן, מערבולת במהירות ודוגרים על התערובת. לאחר שתהיה מוכן, ערבבו ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת ה-RNA הדו-גדילית עם 10 מיקרוליטר של מאגר מלח חרקים כבקרה, או ערבבו אותו עם 10 מיקרוליטר של אנזימים מיצוי שנלקחו ממיץ המולימפה או מעי אמצעי.

לאחר מכן, בצע בקרה מעכבת אנזימים על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של EGTA. אחרת, הוסף שני מיקרוליטר מים ללא RNase. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך שעה או יותר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה מוסיפים 200 מיקרוליטר מגיב מיצוי ו -40 מיקרוליטר כלורופורם, ואז מערבולת. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבירו 150 מיקרוליטר מכל סופרנטנט לצינור חדש, וזרזו את הרנ"א הדו-גדילי מכל דגימה על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של איזופרופנול ודגירה של הדגימות על קרח למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה שוב את הדגימות והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את כדורי ה-RNA פעמיים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של אתנול 70% לכל כדור וצנטריפוגה של הצינור. לאחר הכביסה השנייה, יבש את כדורי ה- RNA הדו-גדיליים באמצעות רכז ואקום צנטריפוגלי למשך שלוש דקות.

לאחר מכן, השעו מחדש את הכדורים ב-10 מיקרוליטר מים ללא RNase. לבסוף, בדוק את תקינות ה-RNA הדו-גדילי המטופל באמצעות ג'ל אגרוז 1.5%. האכילו את הג'וקים פעמיים ביום, שעה לאחר הדלקת האורות ושעה לפני כיבוי האורות.

עשו זאת במשך שמונה או 16 ימים ללא הפסקות. במהלך תקופה זו, הג'וקים צריכים להיות רעבים למים. להאכלה, יש ליפופלקסים טריים של RNA דו-גדילי ו-RNA דו-גדילי עירום זמינים.

עבור הבולוס, השתמש עם ארבעה מיקרוליטרים של ליפופלקסים RNA דו-גדיליים או 250 ננוגרם של RNA דו-גדילי עירום. כדי להאכיל ג'וק, ראשית, תפסו אותו בכנפיים באמצעות מלקחיים גמישים. אין לתפוס חלקי גוף של ג'וק.

לאחר מכן, פיפטה לאט את טיפת התמיסה קרוב לחלקי הפה, וצפה כיצד המקק בולע את הטיפה. לאחר ההאכלה האחרונה, ספקו בקבוקי מים לג'וקים. לאורך כל תקופת ההאכלה, העריכו את החרקים מדי יום כדי לבדוק את התמותה והסירו את כל הג'וקים שכבר לא זזים מהניסוי.

מתן אוראלי מתמשך של ליפופלקסים דו-גדיליים הצליח להפחית את ביטוי הטובולין במעי האמצעי מ-40% ביום התשיעי ל-60% ביום ה-17. לשם השוואה, ל-RNA דו-גדילי עירום לא הייתה השפעה. סביר להניח שהסיבה לכך היא שחשיפה של ה-RNA הדו-גדילי העירום למיץ המעי האמצעי הביאה לפירוק תוך שעה, בעוד שה-RNA הדו-גדילי המצומד לליפוזום נשאר יציב.

לא רק שרמות ה-RNA ירדו, אלא שהזנה מתמשכת של ליפופלקסי RNA דו-גדיליים של טובולין הביאה גם לקטלניות משמעותית. לא סביר שזה נובע מהווקטור, שכן ליפופלקסים הנושאים RNA דו-גדילי ל-EGFP לא הביאו לקטלניות. בעת ניסיון מערכת אספקה אוראלית זו של הפרעות RNA, חשוב לבצע הזנה רציפה של RNA דו-גדילי למשך מספר ימים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע את שלב ההאכלה תוך שתי דקות לכל חרק אם הוא מבוצע כראוי. במידת הצורך, ניתן ליישם ניסוחים שונים של ננו-חלקיקי ליפוזום כדי לשפר את הליך ההזנה ואת יעילות ה-RNAi. בסופו של דבר, טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחום ההדברה לחקור אסטרטגיות הדברה חדשות באמצעות RNAi.