הדמיה וכימות של זיווג בסיסי RNA בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה באמצעות דיווחי RNA ברוקולי מפוצל

אנו מיישמים את מבחן דוח RNA ברוקולי מפוצל כדי לזהות ולכמת זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה. בדיקות כימיות וסימולציות מצביעות על אינטראקציות RNA אך אינן יכולות למדוד אותן ישירות. פרוטוקול זה מאפשר הערכה ישירה ומדויקת בתוך אשכולות RNA.

לאחר הכנת תבניות ה-DNA לשעתוק RNA במבחנה, נגב את משטח העבודה, מדפי הצינורות והפיפטות בתמיסת ניקוי ריבונוקלאז. השתמש בקצוות מסוננים ללא ריבונוקלאז לכל שלבי הפיפטרינג. הפשיר את בופר התגובה ותמיסות הנוקלאוטידים שסופקו עם ערכת השעתוק יחד עם יורידין טריפוספט ציאנין 5, או UTP-Cy5, על הקרח.

צנטריפוגה את כל הצינורות ב-2,000 גרם לשתי שניות לפני השימוש. לאחר מכן חשב את מספר בסיסי התימין ב-DNA. קבעו את הנפחים הנדרשים של UTP ו-UTP-Cy5 לתגובה של שעתוק של 20 מיקרוליטר תוך שמירה על צפיפות תיוג עקבית בין מיני RNA.

לאחר מכן, הכינו תגובת שעתוק של 20 מיקרוליטר על ידי שילוב המגיבים המוצגים. ערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וצנטריפוגה ב-2,000 גרם למשך שתי שניות. לאחר דגירה של התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות, הוסיפו מיקרוליטר אחד של דאוקסיריבנוקלאז שסופק עם הערכה, ערבבו היטב באמצעות פיפטינג, וחזרו לצנטריפוגה.

לאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות. העבר את התגובה לצינור של 1.5 מיליליטר. הוסיפו 115 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז ו-15 מיקרוליטר של תמיסת עצירת אצטט אמוניום שסופקה עם הערכה.

לאחר הערבוב, צנטריפוגה את התמיסה ב-2,000 גרם למשך שתי שניות. לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטר של פנול כלורופורם לצינור וערבבו בעדינות כדי לשלב את השלבים. צנטריפוגה ב-16,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מעבירים את הפאזה המימית העליונה לצינור חדש. הוסף נפח שווה של כלורופורם לתמיסה המועברת וערבב היטב כדי להבטיח אינטראקציה נכונה בין הפאזה. עכשיו צנטריפוגה ב-16,000 גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס וחזרו על תהליך הפרדת השלבים שוב.

לאחר מכן מעבירים את שכבת המים של כ-100 עד 150 מיקרוליטר לצינור חדש. הוסיפו 900 מיקרוליטר של איזופרופנול וערבבו היטב. לאחר חלוקת התמיסה בצינורות נפרדים, אחסן את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד חודש.

צנטריפוגה את דגימת ה-RNA באיזופרופנול ב-16,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את האיזופרופנול מבלי להפריע לגלגלת ה-RNA. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של 70% אתנול שהוכן במים ללא נוקלאז לכדור.

צנטריפוגה ב-16,000 גרם לשתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת האתנול, הוסף מיליליטר אחד של 70% אתנול שהוכן במים ללא נוקלאז לצינור וחזור על הצנטריפוגה. במהלך שטיפת האתנול הסופית, הסר את רוב האתנול באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.

צנטריפוגה קצרה ב-2,000 גרם לשתי שניות בצנטריפוגה קטנה על שולחן והסרת כל אתנול שנותר באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר. לאחר שהכדור ה-RNA מיובש, יש להחזיר אותו ל-20 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. שמור את הדגימה על הקרח והגן עליה מאור.

באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח, מדוד את ריכוז ה-RNA והטוהר. ודא שיחס הספיגה ב-260 על 280 ננומטר הוא בערך 2.0 והיחס ב-260 על 230 ננומטר גדול מ-2.0. הפשיר צינור עם תמיסת תפירמין 100 מילימולר ו-50% פוליאתילן גליקול 8,000 על הקרח.

הכינו מחדש את בופר הקיפול מחדש של 10X RNA על ידי שילוב הרכיבים המוצגים. לאחר ערבוב יסודי של הרכיבים על ידי פיפטינג, צנטריפוגה ב-2,000 גרם למשך שתי שניות בצנטריפוגה קטנה על שולחן. למצב הקיפול המשותף, בצינור PCR בנפח 200 מיקרוליטר, יש לשלב RNA מתועתק במבחנה הנושא רצף עליון או תחתון, בופר קיפול מחדש של RNA, ומים ללא נוקלאז.

ערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ובצנטריפוגה כפי שהודגם קודם. חממו את הדגימה ב-90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. העבר מיד את הדגימה לטמפרטורת החדר.

הגן מפני האור ודוגר במשך שעה. לתנאי קיפול נפרדים, חממו את דגימת ה-RNA בצינור PCR בנפח 200 מיקרוליטר ואז הניחו אותה מיד על קרח למשך לפחות 15 דקות. בצינור PCR בנפח 200 מיקרוליטר, יש לשלב RNA מתועתק במבחנה הנושא רצף עליון או תחתון, 10 פעמים בופר קיפול RNA, ומים ללא נוקלאז.

דגר את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מוגן מאור. כעת משלבים את דגימות ה-RNA שמכילות את הרצפים העליונים והתחתונים לצינור PCR אחד וערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב-2,000 גרם לשתי שניות בצנטריפוגה קטנה על שולחן.

דגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשני המצבים, הוסף שישה מיקרוליטרים של תערובת אחת עד שתיים של 100 מילימולר ספרמין ו-50% פוליאתילן גליקול 8,000. לאחר ערבוב התוכן, צנטריפוגה ב-2,000 גרם למשך שתי שניות בצנטריפוגה מיניאטורית על הספסל.

עכשיו מערבבים שני מיקרוליטרים של DFHBI-1T מילימולר אחד לתגובה ולצנטריפוגה שוב. טען את התגובה לזכוכית כיסוי עם תא זכוכית. דגרו את התא בטמפרטורת החדר במשך ארבע שעות בחושך עם הכיסוי פתוח כדי למזער את האידוי.

טען את זכוכית הכיסוי עם חדר זכוכית על שלב המיקרוסקופ. הפעל את הלייזר, ואז השתמש בעיניים כדי לאתר ולהתמקד בדגימה. הגדר את המיקרוסקופ כך שיצלם כל אזור מעניין עם ערוץ הציאנין 5 תחילה בכל מישור Z.

לאחר מכן דמיינו את אותו אזור מעניין באמצעות ערוץ החלבון הפלואורסצנטי הירוק. הגדר את זמן החשיפה ל-500 מילישניות לכל הערוצים. לאחר מכן כוון את עוצמת הלייזר ל-80% עבור תעלת החלבון הפלואורסצנטי הירוקה ו-40% עבור ערוץ הציאנין 5.

באמצעות גודל צעד Z של 150 ננומטר, יש לצלם אזור החלקה של כיסוי מחוץ לטיפה התגובה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, כמת זיווג בסיסים בין-מולקולריים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. בעת השראת אשכולות ה-RNA, שני ה-RNA יצרו אשכולות בנפרד או יחד.

פלואורסצנציה של DFHBI-1T בתוך אשכולות RNA הייתה נמוכה משמעותית עבור RNA עליון או תחתון בלבד בהשוואה למצב הקיפול המשותף. בתנאי קיפול נפרד, אות DFHBI-1T המנורמל היה 0.031, בדומה לרמות הבסיס שנצפו רק בחלק העליון או התחתון. שו-טופ, שו-בוטום, שו-אנטי-טופ ושו-אנטי-בוטום בנפרד הראו פלואורסצנציה מינימלית של DFHBI-1T.

קיפול משותף של shu-top עם shu-bottom או shu-anti-top עם shu-anti-bottom יצר אות DFHBI-1T גבוה יותר מאשר קיפול נפרד. קיפול משותף של שו-טופ ושו-בוטום הביא לעלייה של פי 5.63 בפלואורסצנציה מנורמלת של DFHBI-1T. קיפול נפרד של שו-טופ ושו-בוטום הראה עלייה של 1.04 קיפול בלבד הדומה לרמות הבסיס.

שו-טופ מעורבב עם שו-אנטי-בוטום ושו-אנטי-טופ מעורבב עם שו-בוטום הראה פלואורסצנציה גבוהה יותר של DFHBI-1T מאשר זוגות בעלי כיוון זהה בשני תנאי הקיפול. קיפול משותף של שו-טופ עם שו-אנטי-בוטום ושו-אנטי-טופ עם שו-בוטום הביא לעליות של 61.86 ו-82.60 פי פלואורסצנציה של DFHBI-1T בהתאמה. קיפול נפרד של זוגות מעורבים אלו הניב עליות קטנות יותר של 2.69 ו-4.94 פעמים בהתאמה.

השיקול החשוב ביותר הוא שיצירת אותות עמידים עשויה לדרוש תגובות צפיפות בעוד שהרגישות תלויה בדימריזציה יעילה וקיפול של RNA ברוקולי מפוצל. בדיקה זו משלימה את גישות משיכת RNA למטה ואלקטרופורזה ג'ל לחקר זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA. מבחן זה יכול לבחון את השפעות רצפי ה-RNA, הליקזים ויונים על זיווג בסיסים בין-מולקולריים בתוך אשכולות RNA.