Summary
דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.
Abstract
עובר דג הזברה הופך פופולרי מודל חוליות vivo לחקר התפתחות לב ומחלות לב אדם עקב אמבריולוגיה יתרון שלה בגנטיקה 1,2. אודות 100-200 עוברי זמינים בכל שבוע מזוג אחד של דגים בוגרים. עוברי שקוף המתפתחים ברחם לשעבר להפוך אותם אידיאליים להערכת פגמים לב 3. הביטוי של הגן כל ניתן להשפיע באמצעות morpholino טכנולוגיית הזרקה או RNA 4. יתר על כן, קדימה מסכי גנטית יצרו כבר רשימה של מוטציות שעלולות להשפיע על היבטים שונים של cardiogenesis 5.
הר שלם immunostaining היא טכניקה חשובה במודל זה חיה כדי לחשוף את דפוס הביטוי של החלבון ברקמות ממוקדות מסוים 6. עם זאת, תמונות ברזולוציה גבוהה שיכולים לחשוף מבנים הסלולר או subcellular היה קשה, בעיקר בשל locat הפיזייון של הלב חדירה לקויה של הנוגדנים.
כאן, אנו מציגים שיטה כתובת אלה צווארי בקבוק ידי ביתור הלב הראשון ולאחר מכן לנהל את התהליך מכתים על פני השטח של המיקרוסקופ שקופית. כדי למנוע אובדן של דגימות לב קטן כדי להקל על הטיפול פתרון, אנחנו מוגבלים דגימות לב בתוך עיגול על פני השטח של המיקרוסקופ מגלשות רתומות עט immEdge. לאחר מכתים, אותות הקרינה ניתן לצפות ישירות על ידי מיקרוסקופ המתחם.
השיטה החדשה שלנו משפר באופן משמעותי את החדירה של נוגדנים, שכן לב מהדגים עובריים רק מורכב משכבות תאים בודדים. תמונות באיכות גבוהה של לבבות שלמים ניתן להשיג תוך זמן התהלוכה הרבה מופחת עבור עוברי דג הזברה בן 2 מיום ליום 6. בשיטה שלנו ניתן להאריך פוטנציאל כתם איברים אחרים גזור מן דג הזברה או חיות קטנות אחרות.
Protocol
1. הכנת שקופיות קאמרית humidified
- החדר humidified ניתן מתיבת כגון תיבת קצה התרוקן. לעטוף גם את החדר ואת לכסות ברדיד אלומיניום כדי להגן על דגימות מן האור.
- בתוך החדר, לשים ערימה של מגבות נייר רטוב כדי לשמור על לחות בתוך החדר, אשר ימנע את דגימות לב מהתייבשות. הגדר microplate קטן בחלק העליון של מגבת נייר כמו מתלה עבור השקופיות.
- צייר או קווים או עיגולים על פני השטח של המיקרוסקופ שקופית באמצעות עט immEdge לעשות בארות דגימות לב ממד על 5x5 מ"מ. בואו שקופיות יבש.
- שים את השקופיות בחדר humidified ולהוסיף 50ul פורמלדהיד 4% טרי היטב כל אחד.
2. Dissection הלב העוברי
- להרדים את העובר דג במים ביצה E3 7 המכיל tricaine 0.4% למשך 1 דקה בערך עד התנועה לעצור דגים הגוף אבל עדיין יש לי לב תקיןמכות.
- שים שקופיות מיקרוסקופ קעור על הבמה של מיקרוסקופ לנתיחה. העברת עוברים לבאר concaved.
- התאימו את צירוף האור של המיקרוסקופ לנתח כדי לגלות בבירור את הלב. בהתאם העדפה אישית, זה יכול להיות גם שדה כהה או DIC כמו תנאי אור מקוטב.
- נקו שני מזרקים אינסולין עם אתנול 75%, אז יבש.
- כוון את המיקרוסקופ לנתיחה כדי הגדלה גבוהה להתמקד בלב. פיזית לתקן את העובר על ידי הוספת טיפ מחט לתוך גבול חלמון-somite קרוב הראש. הכנס עוד קרוב מחט לאזור הלב ולמשוך את הלב מהר. אם הלב אינו מופרד לחלוטין מן העובר, לנתק את רקמות מחובר הנותרים בין הלב לבין החלמון.
- כוון את המיקרוסקופ כדי הגדלה נמוך ולהתמקד בלב מופרדים. השתמש pipetteman 10μl ולהגדיר אותו נפח 1μl. החל קצה pipetteman כדי או לצייר או לגעתלב המדגם, כך יהיה מבודד בלב או בתוך או לעיקול על פני השטח של קצה.
- טובלים את קצה פיפטה בתמיסת פורמלדהיד 4% בשקופיות מוכן לדכא את הבוכנה פיפטה לשחרר את הלב לתוך התמיסה. המתח של פני המים גם עוזר לשחרר את הלב מקצה פיפטה לפתרון. שים פחות מ 3 לבבות היטב כל אחד.
3. Immunostaining
- סגור את החדר והניח אותו על שייקר עם תנועת נדנדה עדין. תקן המדגם הלב במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- נגבו את המים על גבו של השקופיות ולשים את השקופיות על הבמה של מיקרוסקופ לנתיחה עבור חיץ מחליפים.
- טובלים את קצה מן pipetteman 10μl לאזור ריק כל טוב ולשמור על קצה רחוק ככל האפשר מן דגימות לב. קח מזהיר, כדי למנוע את הצמדת לב אל קצה, שכן ליבם עשוי לנוע עם זרימת מים כאשר הפתרון הוא נשאב לתוך קצה. לשנותלוקליזציה קצה, במידת הצורך.
- השלך את הפתרון על גבי רקמה ולהימנע ייצור כל בועות קצה מאז מדגם הלב הולך לאיבוד בקלות בנוכחות של בועות אוויר. שמירה על דגימות הלב יבש חלקית לזמן קצר יכול לעזור לבבות להישאר מחובר השקופיות.
- הוסף 50μl PBST כדי לכסות את המדגם לב לדגור בחדר humidified בתנועת נדנדה איטי 5 דקות. חזור על לשטוף עוד פעם אחת. לאחר שלב זה, דגימות הלב ניתן לאחסן בתא humidified עד 1 שבוע 4 ° C.
- בלוק מדגם לב עם סרום כבשים 10% PBST שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- דגירה המדגם לב עם נוגדנים ראשוניים, כגון דילול 1:200 של נוגדן β-catenin ו 1:200 דילול mef2 נוגדן ספציפי, כבשה 10% סרום / PBST שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את המדגם עם הלב שלוש פעמים PBST (5 דק '. כל אחד) בטמפרטורת החדר.
- דגירה המדגם עם המשנינוגדנים, כגון דילול של 1:1000 עכבר אנטי Alexa-tagged ו / או נגד ארנב נוגדנים, ב PBST שעה 0.5.
- שטפו את הלב עם דגימות שלוש פעמים PBST (5 דק '. כל אחד) בטמפרטורת החדר.
4. הדמיה
- הסר PBST ולהוסיף 10 בינוני הרכבה μl היטב כל אחד. הסלע קאמרית במשך מספר דקות עד לפתרון מתבהרת.
- הסר ביותר של המדיום גובר לכסות את כל בארות שקופית אחת עם זכוכית מיקרוסקופ לכסות (24x50).
- דגים תמונה לב באמצעות Zeiss Axioplan 2 מיקרוסקופ המצויד ApoTome (Carl Zeiss).
5. נציג תוצאות
דוגמה של תמונה אשר חושף קרום גרעינים של כל cardiomyocytes דג הזברה הוא באיור. 1. נוגדנים mef2c ו β-catenin שימשו יחד כתם דגימות לב גזור מעובר hpf 52 דג הזברה. בעוד נוגדן כתמים mef2c את הגרעינים של cardiomyocytes, β-cateninנוגדן חושף את הגבול של כל תא 80-10. על ידי התאמת בשלב של המיקרוסקופ המתחם, תמונות של דגימות לב יכול להיות מותאם לכיוון זהה, אשר יאפשר את התצפית של עקמומיות החיצונית עקמומיות פנימית בלב 11. המספר הכולל cardiomyocyte, גודל התא cardiomyocyte, ואת המעגליות לאחר מכן ניתן למדוד.
דוגמה נוספת אשר חושף את המבנה sarcomeric לב עוברי מוצג באיור. 2. ביצענו immunostaining באמצעות F59, נוגדן שרירן, בלב העוברית גזור. הרשת myofibril בלב שלם עובריים יכולים להתגלות בבירור בהגדלה נמוכה, בעוד הלהקה מפוספס של נימה עבה יכול להתגלות בהגדלה גבוהה יותר (איור 2) 6.
באיור 1. Immunostaining של mef2 (אדום) ו β-catenin (ירוק) כדי להראות את הגרעינים ואת outlאינס של cardiomyocytes בתוך החדר דג הזברה. בר סולם = 10μm
באיור 2. Immnostaining של שרירן להראות את חוט עבה החדר דג הזברה בהגדלה או נמוך (A) או הגדלה גבוה (B). בבר בקנה מידה = 10μm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לעומת שיטות קלאסיות immunostaining כל הר, בשיטה שלנו יש את היתרונות הבאים. ראשית, אותות ניאון חזק הרבה יותר ניתן להשיג באופן עקבי בשל חדירה משופרת. ב שיטת הר שלם immunostaining, רקמת העור צפוף המקיף את הלב משמעותית את החדירה של נוגדנים רבים, וכתוצאה מכך רקע גבוה בכל הגוף. בעיה זו חמורה במיוחד עבור עוברי מבוגר יום 3 לאחר ההפריה (DPF). לעומת זאת, רק לבבות גזור מורכבת שכבות תאים ספורים, עיבוד חדירה הרבה יותר טוב. שנית, בגלל החדירה משופרים בהרבה, כל התהליך של immunostaining ניתן להפחית מהיום 1 עד מספר שעות בלבד. צמצמנו בהצלחה את תקופת הדגירה מ 1 שעה עד 30 דקות עבור חלק נוגדנים כגון Actinin, Integin צמודות קינאז (ודומיו), ו - β-catenin נוגדנים ספציפיים. שלישית, תמונות ברזולוציה גבוהה ניתן להשיג באופן עקבי מכל הלב שלםכדי לחשוף מידע הסלולר / subcellular. בגלל לוקליזציה של הלב בתוך שק pericardiac שנמצא ליד החלמון, גבוה יותר אובייקטיבי עדשות הגדלה לא ניתן להשתמש בעוברים התמונה בשלמותה. לכן, הלב צריך להיות גזור אם תמונות של לב שלם יש צורך. עם זאת, חומרי ניקוי כגון טריטון-x-100 המשמשים לשיפור החדירה את ההליך הר שלם מכתים להחליש את העוברים. כתוצאה מכך, לבבות נשברים בקלות במהלך ההליך לנתיחה. לעומת זאת, לב חי הוא הרבה יותר חזק, אשר ניתן להפריד בקלות בין הרקמות השכנות. לכן, מורפולוגיה שלמים נשמרים בקלות רבה יותר באמצעות השיטה המוצעת. למרות לנתח לב דג הזברה קטן עשוי להיראות מאתגר, רוב האנשים יכולים בקלות לנהל הליך זה לאחר מספר שיטות.
יש לנו שימוש בשיטה זו כדי להכתים לבבות מגיל DPF 2 עד 6 DPF. בגלל המיקום הפיזי שלה, לבבות בין הרוזן אפילוier מבוים עוברי קשה לנתח. נותר רק לקבוע אם שיטה זו ניתן להתאים את הזחל או לבבות מבוגר. כדאי לציין כי נזק מקומי ללב עלולה לגרום בתהליך לנתיחה, הכוללת כוח פיזי. סיבוך זה ניתן להתגבר על ידי הערכת מספר לבבות, ולאחר מכן בחירה תמונות עם תוצאות עקביות ואת המורפולוגיה שמרו הטוב ביותר.
בגלל ברזולוציה משופרת בהרבה, שיטה זו יכולה לשמש כדי לחשוף מבנים הן הסלולר subcellular לב דג הזברה מתפתח. לדוגמה, יש לנו מיושם כבר בשיטה זו כדי לספור המספר הכולל של cardiomyocytes, לכמת את גודל cardiomyocyte בודדים, כדי להעריך את התפשטות אפופטוזיס, וכן לחשוף את תהליך ההרכבה sarcomere 6,12. יחד עם כלים גנטיים ייחודיים דג הזברה, השיטה הנוכחית תאפשר את לימוד הביולוגיה קרדיווסקולרים זה במודל vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים Beninio Jomok על עזרתו בעלי דג הזברה. עבודה זו ממומנת על ידי NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E.
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A.
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
