Summary
Una forma rápida para llevar a cabo la inmunotinción del corazón embrionario del pez cebra se describe. En comparación con el enfoque de montaje inmunotinción todo, este método aumenta considerablemente la penetración de los anticuerpos, lo que permite obtener imágenes de alta resolución que revelan la estructura celular / subcelular en el corazón dentro de un tiempo de procesamiento muy reducida.
Abstract
Embrión de pez cebra se convierte en un popular modelo de vertebrados vivo para el estudio de desarrollo cardiaco y las enfermedades del corazón humano, debido a su ventajosa embriología y la genética 1,2. Unos 100-200 embriones están disponibles todas las semanas de un par de peces adultos. Los embriones transparentes que se desarrollan fuera del útero lo hacen ideal para la evaluación de defectos cardíacos 3. La expresión de cualquier gen pueden ser manipulados a través de la tecnología morpholino o ARN de inyección 4. Por otra parte, hacia las pantallas de genética ya han generado una lista de mutantes que afectan a las diferentes perspectivas de la cardiogénesis 5.
Toda la inmunotinción de montaje es una técnica importante en este modelo animal para revelar el patrón de expresión de la proteína dirigida a un determinado tejido 6. Sin embargo, las imágenes de alta resolución que pueden revelar las estructuras celulares o subcelulares han sido difíciles, debido principalmente a la física location del corazón y de la escasa penetración de los anticuerpos.
A continuación, presentamos un método para hacer frente a estos cuellos de botella mediante la disección de corazón y luego llevar a cabo el proceso de tinción de la superficie de un portaobjetos de microscopio. Para evitar la pérdida de las muestras de corazón pequeño y para facilitar el manejo de la solución, que limita las muestras de corazón dentro de un círculo en la superficie del portaobjetos dibujado por una pluma immEdge. Después de la tinción, las señales de fluorescencia puede ser observada directamente por un microscopio compuesto.
Nuestro nuevo método mejora significativamente la penetración de los anticuerpos, ya que un corazón de un pez de embriones sólo se compone de capas de células de unos pocos. Imágenes de alta calidad de los corazones intactos se pueden obtener en un plazo muy reducido para la procesión de embriones de pez cebra edades comprendidas entre los día 2 al día 6. Nuestro método puede ser potencialmente extenderse a otros órganos disecados mancha de cualquiera de pez cebra y otros animales pequeños.
Protocol
1. Preparación de las placas y cámara húmeda
- La cámara húmeda se puede hacer de una caja como una caja vacía punta. Envuelva tanto la cámara y la tapa con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz.
- Dentro de la cámara, poner un montón de toallas de papel húmedo para mantener la humedad dentro de la cámara, lo que evitará que las muestras de corazón de secado. Establecer una microplaca pequeña en la parte superior de la toalla de papel en un estante para las diapositivas.
- Dibujar líneas o círculos en la superficie de un portaobjetos de microscopio utilizando el lápiz immEdge hacer pozos para las muestras de corazón con una dimensión de 5x5 mm. Deje que los portaobjetos secos.
- Poner los portaobjetos en la cámara húmeda y añadir 50 ul formaldehído fresco 4% en cada pocillo.
2. La disección del corazón embrionario
- Anestesiar a los embriones de pez en el agua de huevo E3 7, que contiene 0,4% tricaína de 1 minuto hasta que el movimiento del cuerpo de peces, pero todavía tienen parada normal del corazónpaliza.
- Ponga un portaobjetos cóncavo en el escenario de un microscopio de disección. Transferir los embriones al pozo cóncavo.
- Ajustar la combinación de la luz del microscopio de disección para revelar claramente el corazón. Dependiendo de la preferencia personal, podría ser cualquiera de campo oscuro o CID-como condición de la luz polarizada.
- Limpiar dos jeringas de insulina con un 75% de etanol, luego se seca.
- Ajustar el microscopio de disección a un aumento mayor y se centran en el corazón. Para fijar físicamente un embrión mediante la inserción de una aguja en el límite con la yema somite cerca de la cabeza. Insertar otra aguja cerca de la región del corazón y tirar el centro hacia fuera rápidamente. Si el corazón no está totalmente separada del embrión, cortar el tejido que ha quedado conectado entre el corazón y la yema.
- Ajustar el microscopio para reducir la ampliación y se centran en el corazón separado. Use un pipetteman 10μl y configurarlo para que el volumen 1μl. Aplicar la punta de la pipetteman Para dibujar o tocar elcorazón de la muestra, de manera que el corazón aislado será dentro o adjunto a la superficie de la punta.
- Sumerja la punta de la pipeta en la solución de formaldehído al 4% en portaobjetos preparados y bajar el pistón de la pipeta para liberar el corazón en la solución. La tensión de la superficie del agua también ayuda a liberar el corazón de la punta de la pipeta a la solución. Con menos del 3 corazones en cada pocillo.
3. Inmunotinción
- Cerrar la cubeta y lo puso en la coctelera con un movimiento de vaivén. Fijar la muestra del corazón durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Limpie el agua en la parte posterior de las diapositivas y poner las diapositivas en el escenario de un microscopio de disección para el intercambio de buffer.
- Que moje la punta de un pipetteman 10μl en una región vacía en cada pozo y mantener la punta de la medida de lo posible a partir de muestras de corazón. Tomar precauciones para evitar que el corazón inherentes a la punta, ya que los corazones puedan moverse con el flujo de agua cuando la solución se introduce en la punta. Cambiola localización de la punta, si es necesario.
- Deseche la solución en un pañuelo y evitar la producción de las burbujas en la punta ya que la muestra del corazón se pierde fácilmente en la presencia de burbujas de aire. Mantener las muestras de corazón parcialmente seco por un corto tiempo puede ayudar a los corazones de permanecer conectados a las diapositivas.
- Añadir 50μl PBST para cubrir la muestra y se incuba en el corazón de la cámara húmeda en un movimiento de balanceo lento durante 5 minutos. Repita el enjuague una vez más. Después de este paso, las muestras del corazón pueden ser almacenados en la cámara húmeda hasta 1 semana a 4 ° C.
- Bloque de la muestra de corazón con suero de oveja 10% en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Incubar la muestra de corazón con los anticuerpos primarios, tales como dilución 1:200 de la β-catenina de anticuerpos y la dilución 1:200 de MEF2 anticuerpo específico, en el 10% suero de oveja / PBST durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar la muestra con el corazón PBST tres veces (5 min. Cada uno) a temperatura ambiente.
- Incubar la muestra con la secundariaanticuerpos, tales como dilución 1:1000 de Alexa-etiquetados anti-ratón y / o anticuerpos anti-conejo, en PBST durante 0,5 horas.
- Lavado de las muestras de corazón con PBST tres veces (5 min. Cada uno) a temperatura ambiente.
4. Imágenes
- Quitar PBST y se añaden 10 l medio de montaje en cada pocillo. Rocas de la cámara durante varios minutos hasta que la solución se aclare.
- Eliminar la mayor parte del medio de montaje y cubrir todos los pozos en una diapositiva con una cubierta de cristal de microscopio (24x50).
- Corazón la imagen de peces utilizando Zeiss Axioplan 2 microscopio equipado con ApoTome (Carl Zeiss).
5. Resultados representante
Un ejemplo de una imagen que revela la membrana y el núcleo de todos los cardiomiocitos del pez cebra se muestra en la fig. 1. anticuerpos MEF2C y β-catenina se utiliza junto a manchar las muestras de corazón disecado de 52 HPF embrión de pez cebra. Mientras que las manchas de MEF2C anticuerpos de los núcleos de cardiomiocitos, β-cateninaanticuerpos revela el borde de cada celda de 8.10. Mediante el ajuste de la platina del microscopio compuesto, las imágenes de las muestras de corazón se puede ajustar a la misma orientación, lo que permitirá la observación de la curvatura exterior y la curvatura interna en el corazón 11. El número de cardiomiocitos total, tamaño de la celda de cardiomiocitos, y la circularidad se puede medir.
Otro ejemplo que revela la estructura del sarcómero de un corazón embrionario se muestra en la fig. 2. Se realizó inmunotinción con F59, un anticuerpo miosina, en un corazón disecado embrionarias. La red de miofibrillas en el corazón embrionario completo puede ser revelado claramente a un menor aumento, mientras que la banda estriada del filamento grueso se puede revelar a mayor aumento (Fig. 2) 6.
Figura 1. Inmunotinción de MEF2 (rojo) y β-catenina (verde) para mostrar los núcleos y outlines de los cardiomiocitos en un ventrículo del pez cebra. Barra de escala = 10μm
Figura 2. Immnostaining de la miosina para mostrar el filamento grueso en un ventrículo del pez cebra en cualquiera de bajo aumento (A) o aumento (B). Barra de escala = 10μm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En comparación con los métodos clásicos de todo el montaje inmunoticción, nuestro método tiene las siguientes ventajas. En primer lugar, mucho más fuertes señales fluorescentes pueden ser obtenidos consistentemente, debido a una mejor penetración. En el método de tinción de montaje conjunto, el denso tejido de la piel que rodea el corazón reduce significativamente la penetración de muchos anticuerpos, lo que resulta en el fondo de alto en todo el cuerpo. Este problema es especialmente grave para los embriones de más de 3 días después de la fertilización (dpf). Por el contrario, el corazón disecado sólo consisten en una pocas capas de células, haciendo que la penetración mucho mejor. En segundo lugar, debido a la penetración mejorado mucho, todo el proceso de tinción se puede reducir desde 1 día hasta sólo unas horas varios. Hemos logrado reducir el tiempo de incubación de 1 hora y 30 minutos para algunos anticuerpos como actinina, Integin ligada quinasa (calaña), y β-catenina de anticuerpos específicos. En tercer lugar, imágenes de alta resolución puede ser obtenido de forma consistente el corazón intactopara revelar información celular / subcelular. Debido a la localización del corazón dentro del saco pericárdico, que está al lado de la yema, el aumento de lentes del objetivo de aumento no puede ser utilizado para los embriones de la imagen intacta. Por lo tanto, el corazón tendrá que ser diseccionado si las imágenes de un corazón intacto se necesitan. Sin embargo, los detergentes como Triton X-100 que se utilizan para mejorar la penetración en el procedimiento de montaje de toda mancha debilitar los embriones. Como consecuencia, los corazones se rompen fácilmente durante el proceso de disección. Por el contrario, un corazón vivo es mucho más fuerte, que puede ser fácilmente separada de los tejidos vecinos. Por lo tanto, la morfología intacta son más fáciles de mantener con el método propuesto. Aunque la disección de un corazón del pez cebra puede parecer un reto pequeño, la mayoría de la gente puede realizar este procedimiento después de varias prácticas.
Hemos utilizado este método para teñir el corazón de edades comprendidas entre 2 a 6 fdd fdd. Debido a su ubicación física, el corazón incluso de condeIER organizó embriones son difíciles de diseccionar. Queda por determinar si este método se puede ajustar para las larvas o los corazones de adultos. Vale la pena señalar que el daño local en el corazón podría resultar durante el proceso de disección, que consiste en la fuerza física. Esta complicación puede ser superada mediante la evaluación de varios corazones, y luego seleccionar las imágenes con resultados consistentes y la mejor morfología mantenido.
Debido a una resolución mucho mejor, este método puede ser utilizado para revelar las estructuras celulares y subcelulares de un corazón del pez cebra en desarrollo. Por ejemplo, ya se ha aplicado este método para contar el número total de cardiomiocitos, para cuantificar el tamaño del cardiomiocito individual, para evaluar la proliferación y la apoptosis, y para revelar el proceso de montaje 6,12 sarcómero. Junto con las herramientas exclusivas de genética en el pez cebra, el presente método facilitará el estudio de la biología cardiovascular en este modelo in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Beninio Jomok por su ayuda en la cría de pez cebra. Este trabajo está financiado por el NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E.
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A.
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
