Summary
Influenzavirus replikere deres RNA-genom i association med værts-celle kromatin. Her præsenterer vi en metode til at rense intakte virale ribonucleoprotein komplekser fra kromatin af inficerede celler. Oprenset virus komplekser kan analyseres ved både Western blot og primerforlængelse af protein og RNA-indhold, hhv.
Abstract
Som alle negativt-strengede RNA-vira er genomet af influenzavira emballeret i form af virale ribonukleoprotein komplekser (vRNP), hvor den enkeltstrengede genom er indkapslet af nukleoprotein (NP), og forbundet med det trimere polymerase kompleks bestående af PA, PB1 og PB2 underenheder. Men i modsætning til de fleste RNA-vira, udføre influenzavirus viral RNA-syntese i kerner af inficerede celler. Interessant viral mRNA-syntese anvender cellulære præ-mRNA'er som primere, og det er blevet foreslået, at denne proces finder sted kromatin 1. Vekselvirkninger mellem virale polymerase og værten RNA-polymerase II, samt mellem NP-og værtsceller nukleosomer er også blevet karakteriseret 1,2.
Nylig generering af rekombinante influenzavira koder for et One-Strep-Tag genetisk fusioneret til den C-terminale ende af PB2-underenheden af det virale polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) har væreen beskrevet. Disse rekombinante vira tillader oprensning af PB2-holdige komplekser, herunder vRNPs, fra inficerede celler. Til opnåelse af oprenset vRNPs er cellekulturer inficeret, og vRNPs er affinitetsoprenset fra lysater afledt fra disse celler. Imidlertid har lysis procedurer, der anvendes til dato været baseret på et trin detergent lysis, der på trods af tilstedeværelsen af en generel nuklease, ofte ekstrahere kromatin-bundet materiale kun ineffektivt.
Vores foreløbige arbejde foreslog, at en stor del af nukleare vRNPs ikke blev udvundet under den traditionelle cellelysis, og kunne derfor ikke være affinitet renset. For at øge denne udvinding effektivitet, og at adskille kromatin-bundet fra ikke-kromatin-bundne nukleare vRNPs, vi tilpasset en trinvis subcellulære udvinding protokol til influenza virus-inficerede celler. Kort fortalt denne procedure 1:e adskiller kerner fra cellen og derefter udtrækker opløselige kerneproteiner (her betegnet "nucleoplasmic" fraktion).Den resterende uopløselige nukleare materiale spaltes derefter med Benzonase, en uspecifik DNA / RNA-nuklease, efterfulgt af to saltekstraktion trin: først under anvendelse af 150 mM NaCl (betegnet "CH150"), derefter 500 mM NaCl ("ch500") (fig. 1 ). Disse salte ekstraktionstrin blev valgt baseret på vores observation, at 500 mM NaCI var tilstrækkelig til at opløseliggøre over 85% af nukleare vRNPs men stadig tillader binding af mærkede vRNPs til affinitetsmatricen.
Efter subcellulær fraktionering af inficerede celler, er det muligt at affinitetsoprense PB2-mærkede vRNPs fra hver enkelt fraktion og analysere deres protein-og RNA-komponenter ved hjælp af Western Blot, og primerforlængelse, hhv. For nylig har vi anvendt denne metode til at opdage, at vRNP udførsel komplekser form under sene efter infektion på kromatin fraktion blev ekstraheret med 500 mM NaCl (ch500) 3.
Protocol
En skematisk rutediagram af protokollen er vist i fig. 1 og en tabel af reagenser er anført nedenfor.
1. Infektion (16 - 24 h)
- Frøet ud HeLa-celler i 5 150 mm plast celle dyrkningsskåle i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM)-højglucose medium, således at de vil nå cirka 80% konfluens den følgende dag (ca. 5 x 10 8 celler). Det er vigtigt, at cellerne ikke når 100% sammenflydning.
- Den næste dag, Strep-mærket influenzavirus lager fortyndes i phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,3% bovint serumalbumin (BSA) til en multiplicitet af infektion af 3.
- Fjerne vækstmediet fra cellerne vaskes en gang med PBS, og der tilsættes 10 ml PBS indeholdende virus i cellerne. Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Erstatte infektion medium med DMEM høj glucose, og fortsætte inkubation ved 37 ° C.
2. Subcellulær fraktionering (3 h)
- Vask cellerne én gang med kold PBS og derefter suspendere cellerne i koldt PBS med en gummiskraber og overføres til en 50 ml konisk rør.
- Udpelleter cellerne i en table-top centrifuge i 5 minutter ved 1000 rpm og derefter opsuges PBS.
- Resuspender cellepellet i 10 ml kold sucrose-puffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCI, 2 mM Mg-acetat (MgOAc), 3 mM CaCl2, 340 mM saccharose, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1% protease-inhibitor-blanding) . Efter suspensionen passerer cellerne gennem en 200 ul pipettespids fastgjort til en 10 ml plastik serum pipette til at afbryde celleklumper.
- Inkuber 10 minutter på is. Vend forsigtigt jævne mellemrum for at resuspendere celler.
- Tilsættes Nonidet P-40 (NP-40) til en slutkoncentration på 0,5% og vortexes ved høj hastighed i 15 sek. Umiddelbart centrifugeres i 10 minutter ved 3500 x g ved 4 ° C i en table-top centrifuge.
- Fjerne supernatanten og opbevares ved 4 ° C. Dette er den cytoplasmiske fraktion. Pelleten bør være mindre og hvidere end den oprindelige cellepelleten. Alle fraktioner kan opbevares i mindst 4 timer ved 4 ° C.
- Vask centrifugebundfaldet i 5 ml kold saccharose buffer, re-centrifuge som i trin 2.5 og kassér supernatanten.
- Resuspender pellet (indeholdende kerner) i 1,5 ml kold nucleoplasmic ekstraktionsbuffer (50 mM HEPES pH 7,9, 150 mM KOAc, 1,5 mM MgCl2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% protease-inhibitor-blanding).
- Overførsel til en afkølet, al-glas 4 ml Dounce homogenisator med en tætsiddende pistil og homogeniseres kerner med 20 slag.
Undgå skumning under homogenisering. Modstanden skal øges efter ca 10 slag. Effektiv homogenisering kan bekræftes under et fasekontrastmikroskop. - Overfører den homogeniserede kerner til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og inkuber 20 minutter på et roterende hjul ved 4 °C.
- Centrifugeres ved 16.000 x g i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 10 minutter.
- Fjerne supernatanten og opbevares ved 4 ° C. Dette er den nucleoplasmic fraktion.
- Resuspender pellet i 1,5 ml fordøjelse buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 10 mM NaCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% protease-inhibitor mix, 100 U / ml Benzonase (for RNA-analyse, erstatning med 20 U / ml RNase -fri DNase I)) præ-opvarmet til 37 ° C, og inkuberes 10 minutter ved 37 ° C.
- Tilsættes 42 ul 5 M NaCl (for slutkoncentration på 150 mM NaCl) og inkuber 20 minutter yderligere ved 4 ° C.
- Centrifugeres ved 16.000 x g i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 10 minutter.
- Fjerne supernatanten og opbevares ved 4 ° C. Dette er den CH150 fraktion.
- Resuspender pellet i 1,5 ml kold højsalt-buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 500 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% protease-inhibitor-blanding) og inkuber 20 minutter på is.
- Centrifugeres ved 16.000 x g </ Em> i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 10 minutter.
- Fjerne supernatanten og opbevares ved 4 ° C. Dette er den ch500 fraktion.
3. Strep-tag Oprensning (2 h)
- Tilsæt 300 pi af 5 M NaCI til den cytoplasmatiske fraktion (for slutkoncentration på 150 mM NaCI).
- Aliquot 100 ul pakkede Strep-Tactin sepharoseperler pr fraktion i en 15 ml konisk rør.
- Tilsættes 10 volumener Strep vaskepuffer (20 mM HEPES pH 7,9, 150 mM NaCl (500 mM NaCI i ch500 prøver), 1 mM EDTA) til perler, vendes røret at blande og centrifugeres i 5 minutter ved 1000 x g i en bordplade centrifugeres.
- Supernatanten fjernes, gentag trin 3,3 gange og derefter resuspenderes kuglepelleten i et lige volumen af Strep vaskepuffer.
- Tilsæt 200 pi vasket Strep-Tactin perle opslæmningen til hver fraktion (i 1,5 ml mikrocentrifugerør i nuceloplasmic og CH150 og ch500 fraktioner og en 15 ml konisk rør for cytoplasmatisk fraktion).
- Drejrør 1 time ved 4 ° C på et roterende hjul.
- Centrifugerør 1 minut ved 1000 x g ved 4 ° C. Bortkast supernatanten.
- Tilsæt 1 ml kold Strep vaskebuffer til hvert rør. Overførsel beads fra 15 ml rør (cytoplasmatisk fraktion) til 1,5 ml rør. Vask alle rørene 1 minut ved 4 ° C, centrifugering efter som i trin 3.7. Gentage dette vasketrin to gange.
- Efter den sidste vasketrin fjerner alle spor af vaskepuffer ved hjælp af en flad pipettespids. Tilsæt 100 pi elueringsbuffer (Strep vaskepuffer indeholdende 2,5 mM desthiobiotin) og forsigtigt blandes.
- Inkuber 15 minutter på is. Bland forsigtigt perler lejlighedsvis ved at trykke på bunden af rørene.
- Centrifugerør 1 min ved 1000 x g ved 4 ° C i mikrocentrifuge. Indsamle supernatant indeholdende eluerede Strep-mærkede vRNPs.
4. Repræsentative resultater
Virkningsgraden af fraktioneringen bedst bedømt ved Western blot-analyse af de fraktionerede lysaterne med Antibodies specifikke for subcellulære markører (fig. 2). Specifikt bør en vellykket subnuclear fraktionering viser ringe eller ingen cellulær RNA-polymerase II (Pol II) i nucleoplasmic eller opløselige kernefraktionen 4, og mest skal ekstraheres med 150 mM NaCI 5. En nedbrydning af Pol II er også reproducerbart observeret i influenza virus-inficerede celler sammenlignet med ikke-inficerede celler, i overensstemmelse med litteraturen 6.
Oprensning af vRNPs bedst bedømt ved sølvfarvet eller Coomassie-farvning, som vist for et cytoplasmisk eluat i fig. 3. Det er vores erfaring, er mest Strep-PB2 renset ind som en del af en fuldt formet vRNP, fanget dvs lidt opløselige polymerase. Dette afspejles i det store NP: PA/PB1/PB2 forhold observeret ved sølv eller Coomassie-farvning. En lavere forhold tyder buffer kontaminering med RNaser, som adskillige allestedsnærværende RNaser (såsom RNase A) er kendt for at spalte viralt RNA på en sådan måde, at dissocispiste polymerasen fra NP multimerer 7. Interessant behandling med Benzonase alene, mens tilstrækkelig til at fordøje viralt RNA, synes at have nogen virkning på de støkiometriske forhold mellem vRNP proteiner. Selvom vi ikke kan forklare dette fænomen, vi har observeret forstyrrelser i vRNPs efter fordøjelse med andre RNaser (data ikke vist), hvilket tyder på, at Benzonase kan efterlade visse strukturelt vigtige RNA regioner intakt. Efter oprensning af vRNPs fra cytoplasmaet og nucleoplasm (foretages uden nukleasefordøjelse), kan 8 svage men adskilte bånd ved høje molekylvægte iagttages ved sølvfarvning, som svarer til de forudsagte molekylvægte af de 8 influenza genomsegmenterne (se ref. 3 ).
De relative mængder af vRNPs oprenset fra hver fraktion på 9 timer efter infektion er vist i fig. 4. Fordelingen af vRNPs varierer i løbet af infektion med stærkest akkumulering i CH150 fraktion på tidlige tidspunkter, ogforøget akkumulering i nucleoplasm og cytoplasma på sene tidspunkter.
Figur 1. Rutediagram af subcellulær fraktionering. Tilpasset fra ref. 3.
Figur 2. Western blot-analyse af subcellulære fraktioner fra influenza virus-inficerede celler. 10 9 HeLa-celler blev inficeret med influenzavirus stamme WSN i 9 timer før subcellulær fraktionering. Lige mængder af totalt protein blev påsat i hver bane, og analyseret ved de viste antistoffer. RNA-polymerase II (Pol II) blev påvist under anvendelse af klon 8WG16, som genkender alle former for det C-terminale domæne (den hypophosphorylerede båndet er mest fremtrædende). Tilpasset fra ref. 3.
Figur 3.Sølvfarvning analyse af oprenset vRNPs. HeLa-celler blev inficeret med rWSN (som en negativ kontrol) eller rWSN-PB2-Strep i 9 timer, efterfulgt af Strep oprensning fra den cytoplasmatiske fraktion. Asterisk angiver bånd, som ikke er synlige efter RNase-fordøjelse. Tilpasset fra ref. 3.
Figur 4. Sølvfarvning analyse af vRNPs oprenset fra forskellige cellulære fraktioner. 10 9 HeLa-celler blev inficeret med rWSN-PB2-Strep og rWSN i 9 timer, efterfulgt af subcellulær fraktionering og Strep oprensning. Lige mængder af eluatet fra hver fraktion blev fyldt. Tilpasset fra ref. 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens mange undersøgelser for nylig identificeret individuelle proteiner eller cellulære net, der er involveret i influenzavirusinfektion 8, den funktionelle betydning af de fleste af disse interaktioner er stadig uklar. Betragtning absolut afhængighed af kromatin-baserede funktioner for influenzavirus RNA-syntese, og komplekset biofysiske og biokemiske beskaffenhed af kernen 9, vil nye teknikker skulle belyse disse funktioner. Den subnuclear fraktionering vi præsenterer her, kombineret med affinitetsrensning af vRNPs, tillader karakterisering af afgørende virale RNA-fabrikker, der tidligere var utilgængelige.
Mange subcellulær fraktionering protokoller er blevet beskrevet tidligere i litteraturen. Vi observerede, at de fleste af disse traditionelle metoder føre til for tidlig udsivning af vRNPs fra kernen, et fænomen også beskrevet i Pol II 10. Ved hjælp af en kort inkubation af præ-ekspanderet celler med et lavt concentration af en svag detergent NP-40, effektivt plasmamembranen lysis forekom uden væsentlig nuklear lækage. Interessant udførelse vores subcellulær fraktionering under anvendelse af A549 og HEK293T celler snarere end HeLa-celler førte til stærk nuklear lækage af vRNPs i begge cellelinier. Sænke NP-40 koncentration på ca 0,2% reduceret dette problem, men på grund af nogle variationer af disse cellelinjer, bør de optimale betingelser bestemmes empirisk. En anden mulig altermative er anvendelsen af ikke-human, influenzavirus-modtagelige cellelinier, såsom MDCK-eller Vero-celler.
Vores saltudvinding protokol adskiller sig fra traditionelle kromatin ekstraktionsmetoder, der ofte benytter lavere saltkoncentrationer og / eller høje EDTA koncentrationer. Vores protokol adskiller kromatin i to specifikke fraktioner, en Pol II-high/histone-low fraktion og dens reciprokke. Imidlertid kan andre chromatin ekstraktionsmetoder også være forenelig med affinitetsoprensning af køretøjetsPs. Da de fleste chromatin ekstraktionsmetoder har fokuseret på DNA-protein-interaktioner i forhold til protein-protein interaktioner, er nye teknikker, der kræves for at udtrække tæt chromatin-bundne multi-proteinkomplekser 11.
I almindelighed bør længden af infektion bestemmes empirisk på grund af variationer mellem virusstammer og cellelinier. Ved hjælp af rWSN-PB2-Strep stamme ved en MOI på 3, har vi udført subcellulær fraktionering på tidspunkter varierende fra 3 til 10 timer efter infektion. I vores erfaring, giver mindre end 3 timer for infektion for få oprensede vRNPs for nyttige Western blot-analyse, medens infektion mere end 3 h resulterer i stærk cytopatisk virkning og efterfølgende blanding af fraktioner.
Evnen til at isolere intakte, stramt chromatin-bundne virale komplekser åbner flere muligheder. Mens vi anvendt en rekombinant virus, der udtrykker et Strep-mærket PB2, kan andre affinitetsmærker også anvendes, såvel som tradtab i et immunopræcipitation målretning andre virale proteiner. Endvidere, mens vores analyse af vRNPs var begrænset til karakterisering af deres protein-og RNA-komponenter, kan de rensede komplekser også anvendes til at udføre funktionelle in vitro-syntese assays. Endelig kan adskillelsen af vRNPs i grove funktionelle arter gennem subnuclear fraktionering også tillade nærmere studium af flere for nyligt beskrevne post-translationelle modifikationer af virale proteiner nødvendige for effektiv viral RNA-syntese 12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Nada Naffakh og Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) for rWSN-PB2-Strep virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | SERVA Electrophoresis | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type "B" pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
