Summary
Vi beskriver her, hvordan du udfører en enkelt-celle mikroinjektion af Lucifer Yellow at visualisere cellulær kommunikation via gap-junctions i levende celler, og give nogle nyttige tips. Vi forventer, at dette dokument vil hjælpe alle til at vurdere graden af cellulære kobling skyldes funktionelle gap junctions. Alt her beskrevne kunne være principielt tilpasses til andre fluorescerende farvestoffer med molekylvægt under 1.000 Dalton.
Introduction
Gap junctions er intercellulære kanaler, der tillader indbyrdes kommunikation blandt naboceller 1. Denne meddelelse forbinder to eller flere tilstødende celler, hvor hver bidrager med en connexon eller hemichannel at danne den intercellulære kanal. I mammale celler, er det connexon dannet af seks connexiner, monomerer med fire transmembrane domæner og et C og N-terminal i cytoplasmaet 2. Gap junctions ikke kun tillader strømmen af ioner, sekundære budbringere og små metabolitter, men også bidrage til mange former for cellulær kommunikation i mange fysiologiske processer, såsom synaptisk transmission, hjerte sammentrækning, cellevækst og differentiering 3, 4, 5, 6, 7, 8. Desuden gap junctions er blevet forbundet medmange sygdomme, herunder cancer 9, 10, muskelsvind 11, nogle genetiske sygdomme og demyelinisationssygdomme 12.
Denne type af intercellulær krydstale kan evalueres ved adskillige fremgangsmåder 13, 14, 15, 16. I dette papir, viser vi, hvordan du udfører en enkelt-celle mikroinjektion af Lucifer Yellow at visualisere cellulær kommunikation via gap-junctions i levende celler. Vi diskuterer, hvordan man forbereder cellerne og mikropipetten, brugen af mikromanipulator og injektion af Lucifer gult farvestof i en thymus epitelial cellelinje. Normalt kan denne eksperimentelle procedure analyseres ved gennemsnittet af forbundne celler til cellen fyldt med farvestof. Desuden kunne denne fremgangsmåde anvendes med andre fluorescerende farvestoffer med molekylvægt under mellemrummetvejkryds cut-off, som er cirka 1000 dalton.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse Celler
- Oprethold en kultur af en thymisk epitelcellelinie (IT76M1) eller celle, der skal testes i en inkubator (37 ° C / 5% CO2).
- Vask cellerne med PBS 1x (gentag dette element 3x).
- Tilføj Trypsin til cellerne i 5 minutter.
- Tilføj medium (to gange af mængden af trypsin tilsat i punkt 1.3) med 10% FBS (føtalt bovint serum) til cellerne med trypsin og centrifugeres (800 xg i 5 min).
- Tæl cellerne i et hæmocytometer.
- Justere tætheden af celler i overensstemmelse med celletypen, når cellerne skal være i tæt kontakt med hinanden for at tillade kobling. Bemærk: I vores tilfælde anvendte vi 3 x 10 5 celler pr 35 mm petriskål.
2. Mikropipette Forberedelse
- Træk mikropipette som angivet fra en glaskapillar mikropipette (1,5 mm diameter) til en endelig 0,2 um diameter så man opnår en endelig modstand på ca. 30 MOhmf "> 17, 18.
BEMÆRK: Alternativt kan injektion pipetter købes. Modstanden afhænger af cellestørrelsen, for eksempel en højere modstand mikroelektrode ville være nødvendig for pancreatiske acinære celler, for eksempel (100-150 MOhm) 19. Et fælles problem, der kunne opstå, er udfældningen af Lucifer Yellow opløsning, som derefter kan hindre mikropipetten og kan kræve forudgående filtrering eller centrifugering. Før injektion skal mikropipette analyseres under mikroskop for at opdage, hvis der er en forhindring eller en hvilken som helst form for forstyrrelse 13. Mikropipetten kan testes ved at injicere LY med mikropipettespidsen inde i en saltvandsopløsning.
3. Test af Mikropipette
- Forbered Lucifer Yellow (5%) i 150 mmol / l LiCI og indlæse mikropipette ved hjælp af en sprøjte eller ved opfyldning (lagt i det LY Solution).
- Placer micropipette over 35 mm petriskål med IT76M1 celler på mikroinjektion arbejdsstation og nedsænke spidsen af glasmikropipette i cellemediet. Fokus på mikropipetten og udfører et farvestof strømmende ved at påføre en puls.
4. Single-celle Lucifer Yellow Mikroinjektion
- Fokus mikroskopet lige over cellelaget ved hjælp af en høj Magni fi kation (40X), derefter langsomt sænke pipetten til cellerne ved hjælp af mikromanipulator.
- Punktere målcellen når spidsen er tæt nok til at røre cellemembranen, og anvende en lille hyperpolarisering puls at indføre LY ind i cellen. Den påtrykte spænding vil afhænge af nettoladningen af farvestof, der skal injiceres. Alternativt kunne nogle andre farvestoffer anvendes med denne teknik som vist i tabel 1.
Bemærk: I princippet enhver hydrofil farvestof med MW mindre end 1 kDa kunne anvendes. hastigheden af overførslen, kan imidlertid variere alt efter vægt og hydrofile. Derudover unspecific overførsel af farvestoffet anvendes, skal evalueres. - Capture celle billeder 3 min efter farvestof injektion eller lave en lille film med tidsforskydningen mikroskopi (30 fps).
BEMÆRK: En lignende tilgang kunne ses i Hitomi et al (2015) 20. At undgå kommunikation ved intercellulære broer (ufuldstændig mitose), en co-injektion af rhodamin dextran (fra 2 til 10 kDa), som ikke passerer gennem gap junctions men passerer gennem intercellulære broer og visse typer nanotubules anbefales som vist i figur 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thymisk epitelcellelinie IT-76MI blev anvendt til at evaluere farvestof kobling ved gap junctions som disse celler blev beskrevet at udtrykke funktionelle gap junctions dannet ved connexin 43 21. Figur 1 viser indsprøjtningen af Lucifer Yellow, når den anvendes i en celle under spidsen af pipetten. Efter nogle få minutter, forbundne celler bliver fluorescerende (asterisker), der angiver diffusionen af det fluorescerende farvestof gennem gap junctions. Antallet af celler og tid at blev fluorescerende er direkte forbundet med graden af cellulær kommunikation mellem disse celler. Figur 2 viser injektionen af LY i thymiske epitelceller og indsatsene (indsæt d) viser co-injektion af LY og Rhodamin Dextran (10 kDa). Som forventet LY passerer til en nabocelle, selv om rhodamin Dextran ikke på grund af den høje molekylvægt. Desuden er tilstedeværelsen af en GJ blokker (indsæt f), octanol, blocked passage af farvestoffet til de omgivende celler. Alternativt kan man vurdere graden af kobling af en bestemt celle eller virkningen af et lægemiddel på funktionen af GJ. Figur 3A viser indsprøjtningen af LY i TEC-celler med eller uden dexamethason. Derefter 100 celler blev injiceret i nærvær af dexamethason, og procentdelen af 1 eller 2 celler kommunikerer var ens i forhold til kontrollen uden lægemidlet. antallet af 3 eller 4 celler kommunikerer var dog højere sammenlignet med kontrolpatienter. Fem eller 6 celler og 7 eller 8 celler med GJ kommunikation i nærvær af dexamethason blev ikke observeret i kontrolgruppen, hvilket viser, at dexamethason steg graden af kobling i TEC-celler.
Figur 1: Lucifer Yellow injektion i IT-76MI celler. (A) Mikropipetten tæt på cellemembranen. (B (C) En test puls blev genereret at undersøge, om elektroden faktisk indsprøjtning af farvestof. (D) Pipetten rørte cellemembranen og det blev anklaget Lucifer gult farvestof. (E) Cellen opladet tillod farvestoffet at passere gennem gap junctions til mindst fem naboceller (angivet med pilene), X20. F) En digital zoom blev gjort for at muliggøre bedre visualisering. Stjerner påpege de celler, der blev opkrævet i kontrast fase mikroskopi (figur 1A). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Lucifer Yellow injektion i thymiske epitelceller (TEC). Fasekontrast og fluorescensmikroskopi. (A B) Humant thymusepitelmonolag celle. (C og D) tymisk Nurse Cell, (E og F) En mus thymusepitelmonolag cellelinie hhv. Insertet i (D) viser den samme celle (pil) efter en injektion af rhodamin-dextran 10 kDa (ikke permeabel gennem gap junctions). Indsatsene i (E) og (F) viser fraværet af farveafsmitning i TEC linje forbehandlet med octanol 1 mM (a gap junction-blokker) i 10 min. I alle paneler stjernerne markerer de injicerede celler. (AF) X 200. Gengivet fra Alves et al. , 1995 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Gap junction communication steg med dexamethason i en rotte epitelcellelinie. TEC blev behandlet med 1 pM dexamethason og kobling grad blev vurderet ved Lucifer Yellow farveoverføringsinhiberende assay. (A) Mikroskopi felter (fasekontrast og fluorescens i henholdsvis venstre og højre paneler) afbilder den injicerede celle og dem, der blev koblet, da LY blev injiceret (forstørrelse 320X). I alle paneler stjernerne markerer de injicerede celler. (B) Histogrammer der viser mønstret af kobling af kontrol og dexamethason-behandlede celler. Analysen består af 100 mikroinjektioner per gruppe. Gengivet fra Alves et al., 2000 23. Klik her for at se en større version af dette tal.
| FARVESTOF | MW | Excitation / Emission |
| hydroxycoumarin carboxylsyre | 206 | 386/488 |
| calcein blå | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid | 279 | 358/461 |
| carboxyfluorescein | 376 | 492/517 |
| ethidium iodid (bromid) | 314 | 518/605 |
| Lucifer Yellow CH | 443 | 428/536 |
| Alexa Fluor 488 | 570,5 | 495/519 |
| calcein | 622 | 494/517 |
| propidiumiodid | 414 | 535/617 |
Tabel 1: Farvestoffer øjeblikket anvendes til mikroinjektion eksperimenter. Her i,nogle brugte farvestoffer med molekylvægten og excitation / emission bølgelængden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at kontrollere tilstedeværelsen af funktionelle intercellulære gap junction, brug af sporstoffer, som er membran uigennemtrængelige, selvom gennemtrængelig af intercellulære kanaler kræves 16. Fluorescein, den første fluorescerende farvestof til at observere celle til celle kobling 22, er gennemtrængelig mellem ikke forbindelsesepitoper membraner 3 og er derfor blevet substitueret med Lucifer gult farvestof 15. I øjeblikket, for at finde det bedste valg blandt de mange forskellige typer af fluorescerende sporstoffer afhænger af omfanget og betingelserne for eksperimentet. Fremgangsmåden fra celle lastning med fluorescerende farvestoffer tillader evaluering af morfologi, funktion af enkeltceller og den kinetiske overførselshastighed mellem celler. Endvidere farvestof mikroinjektion tillader en bedre forståelse af den fysiologiske rolle af gap junctions mellem celler 21, 23, eftersom graden af cellular kommunikation er relateret til antallet af koblede celler.
Flere vigtige faktorer er afgørende for en vellykket opnå mikroinjektion data. Normal cellehomeostase og integritet skal opretholdes, således en kort injektion tid (<1 s) af farvestof og teknisk ekspertise med mikroinjektion er nødvendig. Vigtige faktorer i at få en bedre opløsning af de optagne billeder er at have en kølet CCD-kamera, fluorescens filtre på plads og brugen af en høj NA mål 14. Desuden kunne nogle tips være nyttige som: 1) cellekultur retter med gitre anbefales at visualisere en bestemt indsprøjtet celle også glas-bottom retter bør anvendes til høj opløsning mikroskopi applikationer; 2) anbefales det at gøre 10-20 trukket nåle før du starter mikroinjektioner; 3) afhængig af modstanden af elektroden spids kan være meget nyttigt, lastning mikropipetten med farvestoffet ved hjælp kapillaritet ved at trykke pipettespidsen i farveopløsningen; 4) det er ikke nødvendigt at indlæse hele kroppen af pipetten, et par mikroliter at fylde spidsen og 2 til 3 mm over spidsen er tilstrækkelig; 5) starte eksperimentet med en mindre forstørret linse og forsøge at se skyggen af pipetten vægge. Bagefter flytter pipetten så tæt som muligt og før du rører cellen, skift til den større forstørrelse mål, såsom 40x eller mere; 6) Nogle grupper bruger en pneumatisk mikroinjektor. Pneumatisk injektion er ikke det bedste valg, da det ikke er præcis og kunne injicere ukendte mængder; med en puls protokollen kunne standardiseres til at indsprøjte en kendt mængde farvestof. Derudover anbefales det at tilføre membranen over cytosolen grund af dybden; injektion i membranen over kernen kunne skade det og påvirke celle fysiologi. Endelig celler, der ikke for flad er foretrække over flad dem.
Sammenfattende denne metode er effektiv til at studere intercellulær kommunikation via gap junctions men behovekspertise / erfaring og godt materiale og udstyr til at opnå data af høj kvalitet. Vi håber, at denne artikel og video hjælpe begyndere til at forstå og udføre denne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
