Summary
私たちは、生きた細胞内のギャップジャンクションを介しセルラー通信を可視化し、いくつかの有用なヒントを提供するために、ルシファーイエローの単一細胞マイクロインジェクションを実行する方法をここで説明します。我々は、この論文は誰もが機能的ギャップ結合による細胞結合の程度を評価するために役立つことを期待しています。ここで説明するすべてのものは、原理的には、1,000ダルトン未満の分子量を有する他の蛍光色素に適合させることができます。
Introduction
ギャップ結合は、隣接セル1間の相互通信を可能にする細胞間チャネルです。この通信は、それぞれの間のチャネルを形成するコネクソンまたはヘミチャネルと寄与する二つ以上の隣接セルを接続します。哺乳動物細胞において、コネクソンは6コネキシンは、4つの膜貫通ドメイン及び細胞質2内のC及びN末端でのモノマーにより形成されます。ギャップ結合は、イオンのみ、第二メッセンジャーおよび小代謝産物の流れを許容するが、また、シナプス伝達、心臓の収縮、細胞の増殖および分化3、4、5、6のような多くの生理学的プロセスにおいて、セルラー通信の多くの形態、に寄与しません7,8。また、ギャップ結合が関連付けされています癌9、10、筋萎縮症11、いくつかの遺伝病や脱髄疾患12を含む多くの疾患。
細胞間のクロストークのこのタイプは、いくつかの方法13、14、15、16により評価することができます。本稿では、生きた細胞のギャップジャンクションを介しセルラー通信を可視化するためにルシファーイエローの単一細胞マイクロインジェクションを実行する方法を示しています。我々は、細胞およびマイクロピペット、マイクロマニピュレータの使用法および胸腺上皮細胞株でルシファーイエロー染料の注入を準備する方法について説明します。通常、この実験手順は、染料でロードセルに接続されたセルの平均値で分析することができました。また、この方法は、ギャップ未満の分子量を有する他の蛍光色素で使用することができます接合は、カットオフ約1,000ダルトンです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
細胞の調製
- 胸腺上皮細胞株（IT76M1）または細胞の培養物を維持インキュベーターにおいて試験される（37℃/ 5％CO 2）。
- PBS 1×（このアイテム3回繰り返す）で細胞を洗浄。
- 5分間細胞にトリプシンを追加します。
- トリプシンおよび遠心分離（5分間800×gで）を有する細胞に10％FBS（ウシ胎児血清）と（項目1.3で追加されたトリプシンの体積の2回）培地を追加します。
- 血球計で細胞をカウントします。
- 細胞は、結合を可能にするために、互いに密着している必要として、細胞型に応じて細胞の濃度を調整します。注意：私たちのケースでは、我々は35ミリメートルペトリ皿当たり3×10 5細胞を使用しました。
2.マイクロピペットの準備
- 直径の最終的な0.2μmのガラスキャピラリーマイクロピペット（直径1.5mm）から指定されるように約30MΩの最後の抵抗を達成するために、マイクロピペットを引き出しますF "> 17、18。
注：別の方法として、注入ピペットを購入することができます。抵抗は、セルサイズに依存し、例えば、高抵抗の微小電極は、例えば、（100〜150MΩ）19のために、膵臓の腺房細胞のために必要であろう。発生する可能性がある一般的な問題は、その後、マイクロピペットを妨害することができますし、前に濾過または遠心分離を必要とするかもしれないルシファーイエローソリューションの沈殿です。注射の前に、マイクロピペットは、障害物や中断13のいずれかのタイプがあるかどうかを検出するために、顕微鏡下で分析する必要があります。マイクロピペットは、生理食塩水の内部マイクロピペットの先端でLYを注入することによって試験することができます。
3.テストマイクロピペット
- 150ミリモル/ LのLiClでルシファーイエロー溶液（5％）を調製し、注射器を用いて、マイクロピペットをロードしたり、埋め戻しにより（それLYソリューションに入れます）。
- マイクロパイプを配置マイクロインジェクションのワークステーション上IT76M1細胞と35ミリメートルペトリ皿の上って、細胞培地にガラスマイクロピペットの先端を沈めます。マイクロピペットに焦点を当て、パルスを印加することにより、色素流れるテストを実行します。
4.シングルセルルシファーイエローマイクロインジェクション
- その後、ゆっくりとマイクロマニピュレーターを用いて細胞にピペットを下げ、右高いマグニFiのカチオン（40X）を使用して、細胞層の上に顕微鏡の焦点を合わせます。
- 先端が細胞膜に触れるのに十分近い場合、標的細胞を穿刺し、細胞内にLYを導入するための小さな過分極パルスを印加します。印加電圧は、注入される色素の正味の電荷に依存します。表1に示されるように代わりに、いくつかの他の色素は、この技術を用いて使用することができます。
注：1KDaを使用することができるよりも、原理的にMWを有する任意の親水性染料が少ないです。ただし、転送速度は、重量と親水性に応じて変化させることができます。また、U使用される染料のnspecific転送が評価されなければなりません。 - 細胞画像を色素注入後3分をキャプチャしたりタイムラプス顕微鏡（30 FPS）で小さな映画を作ります。
注：同様のアプローチは、ひとみら（2015）20に見ることができました。 図2に示すように、細胞間のブリッジによる通信（不完全な有糸分裂）、ギャップ結合を通過するが、推奨されている細胞間橋やナノチューブの特定の種類を通過しないローダミンデキストラン（2〜10キロダルトンまで）の同時注射を回避するために、 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
これらの細胞は、43 21をコネキシンによって形成された機能的なギャップ結合を発現することが記載されたように、胸腺上皮細胞株IT-76MIは、ギャップ結合により色素の結合を評価しました。ピペットの先端の下に一つのセルに適用すると、図1は、ルシファーイエローの注入を示しています。数分後、接続されたセルは、ギャップ結合を介して蛍光色素の拡散を示す蛍光（アスタリスク）となります。細胞と時間蛍光になったために数を直接これらの細胞間のセルラー通信の度に関連付けられています。 図2は、胸腺上皮細胞におけるLYの注射および挿入（インサートd）はLYとローダミンデキストラン（10kDaの）の同時注射を示して示しています。予想されるようにローダミンデキストランが、その高い分子量のものではないがLYは、隣接セルに渡します。また、GJブロッカーの存在（インサートf）は、オクタノール、BLO周囲の細胞への色素の通過をcked。あるいは、特定の細胞またはGJの機能に対する薬物の効果の結合の程度を評価することができます。図3Aは、またはデキサメタゾンなしTEC細胞におけるLYの注射を示しています。次いで、100細胞を、デキサメタゾンの存在下で、注射及び1又は2細胞の割合通信は、薬物を含まない対照に関して同様でした。コントロールと比較した場合しかし連3または4個の細胞の数が多かったです。デキサメタゾンの存在下でのGJ通信で5または6セルおよび7または8細胞は、コントロールでは観察されなかった、したがって、デキサメタゾンはTEC細胞に結合度を増加させたことを示しています。
図1：IT-76MI細胞におけるルシファーイエロー注入。 （A）細胞膜に近いマイクロピペット。 （B （C）試験パルスは、電極は、実際に染料を注入しているかどうかを確認するために生成されました。 （D）ピペットを細胞膜に触れ、それはルシファーイエロー染料を充填しました。 （E）細胞荷電染料は、少なくとも5つの隣接セル（矢印で示す）にギャップ結合を介してX20を通過させました。 F）デジタルズームをより良く視覚化を可能にするために行われました。アスタリスクは、コントラストの位相差顕微鏡（図1A）に仕込み、細胞を指摘しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：胸腺上皮細胞（TEC）でルシファーイエロー注入。位相コントラストおよび蛍光顕微鏡。 （ B）ヒト胸腺上皮細胞。それぞれ（C及びD）胸腺ナース細胞、（E及びF）Aマウス胸腺上皮細胞株。 （D）中の挿入は、ローダミン-デキストラン10kDaの（ギャップ結合を介して透過させない）の注入後に同じセル（矢印）を示しています。 （E）および（F）における挿入は、TEC線10分間オクタノール1ミリモル（ギャップジャンクション遮断剤）で前処理における色素転写が存在しないことを示しています。すべてのパネルではアスタリスクが注入された細胞をマーク。アウベスらからの再生（AF）X 200。 1995年5。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：ギャップジャンクションcommunicationはラット上皮細胞株でデキサメタゾン増加しました。 TECは、1μMのデキサメタゾンで処理し、結合度は、ルシファーイエロー染料転写アッセイによって評価しました。 （左と右のパネルで、それぞれの位相コントラストおよび蛍光、、）（A）顕微鏡フィールド注入した細胞とLYは、（倍率320X）を注入した際に連結されたものを描きました。すべてのパネルではアスタリスクが注入された細胞をマーク。 （B）ヒストグラムは、対照およびデキサメタゾン処理細胞の結合のパターンを示します。分析は、グループ当たり100マイクロインジェクションで構成されています。アウベスら、2000年23から再生。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 染料 | MW | 励起/発光 |
| ヒドロキシカルボン酸 | 206 | 488分の386 |
| カルセインブルー | 321 | 449分の360 |
| 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 | 279 | 461分の358 |
| カルボキシ | 376 | 517分の492 |
| エチジウムヨウ化物（臭化物） | 314 | 605分の518 |
| ルシファーイエローCH | 443 | 536分の428 |
| アレクサフルオロ488 | 570.5 | 519分の495 |
| カルセイン | 622 | 517分の494 |
| ヨウ化プロピジウム | 414 | 617分の535 |
表1：現在のマイクロインジェクション実験のために使用される染料。ここで、いくつかの分子量および励起/発光波長を有する色素を使用します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
細胞間のチャネルによって透過性が16を必要としているが、機能的な細胞間ギャップ結合の存在、膜不透過性トレーサーの使用を確認するために。フルオレセイン、第一の蛍光色素は、細胞から細胞へのカップリング22、非接合膜3との間に透過性であり、したがって、ルシファーイエロー染料15で置換されている観察します。現在、蛍光トレーサーの多くの異なる種類の中で最良の選択肢を見つけるためには、実験の範囲や条件によって異なります。蛍光色素を用いた細胞の負荷の手順は、形態、単一細胞の機能と細胞間の転送の運動率の評価を可能にします。また、染料マイクロインジェクションは、cの程度ので、セル21、23との間のギャップ結合の生理学的役割のよりよい理解を可能にしますellular通信が接続されたセルの数に関係しています。
いくつかの重要な要因は、正常マイクロインジェクションデータを得るために重要です。正常な細胞の恒常性と整合性は、マイクロインジェクションと染料と技術的専門知識の短い噴射時間（<1秒）が必要とされるため、維持されなければなりません。撮影した画像のより良好な分解能を得ることに主な要因は、冷却CCDカメラ、代わりに蛍光フィルタや高NA対物レンズ14の使用をしています。また、いくつかのヒントは、有用であり得る：1）グリッドを用いた細胞培養ディッシュは、特定の注入された細胞を可視化することが推奨され、また、ガラスボトムディッシュは、高解像度の顕微鏡アプリケーションに使用する必要があります。 2）微量注入を開始する前に、10月20日に引っ張ら針を作ることをお勧めします。 3）色素溶液にピペットチップをタッチすることで毛細管現象を用いた色素でマイクロピペットをロードし、非常に役立つことが電極先端の抵抗値に応じて、; 4）先端が十分である上に、チップと2〜3ミリメートルを埋めるために、数マイクロリットルピペットの全身をロードする必要はありません。 5）以下、拡大レンズで実験を開始し、ピペットの壁の影を参照してみてください。その後、できるだけ近いピペットを移動させ、細胞に触れる前に、このような40倍以上のような高倍率の対物レンズにシフトします。 6）いくつかのグループは、空気圧マイクロインジェクターを使用します。それは正確ではないと未知のボリュームを注入する可能性があるので、空気圧注入は最良の選択ではありません。パルスでのプロトコルは、染料の既知の体積を注入するために標準化することができました。さらに、ために深さの細胞質ゾル上記膜に注入することをお勧めします。核上記膜内注入は、それを傷つけるし、細胞生理学に影響を与える可能性があります。最後に、あまりにもフラットでない細胞が平らなものの上に好適です。
要約すると、この方法は、ギャップ結合によって細胞間コミュニケーションを研究するのに有効であるが、必要sの高品質なデータを取得するための専門知識/経験と優れた材料や機器。我々は、この記事やビデオのヘルプ初心者はこの技術を理解し、実行することを願っています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
