Summary
Se describe aquí cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas, y proporcionar algunos consejos útiles. Esperamos que este documento ayudará a cada uno para evaluar el grado de acoplamiento celular debido a uniones gap funcionales. Todo lo descrito aquí podría ser, en principio, adaptado a otros colorantes fluorescentes con peso molecular inferior a 1.000 Daltons.
Introduction
Gap cruces son canales intercelulares que permiten la intercomunicación entre las células vecinas 1. Esta comunicación se conecta dos o más células vecinas, donde cada uno contribuye con una conexón o hemicanal para formar el canal intercelular. En células de mamíferos, la conexón está formado por seis conexinas, monómeros con cuatro dominios transmembrana y una C y N terminal dentro del citoplasma 2. Gap cruces no sólo permiten el flujo de iones, segundos mensajeros y pequeños metabolitos, sino que también contribuyen a muchas formas de comunicación celular en muchos procesos fisiológicos, tales como la transmisión sináptica, la contracción del corazón, el crecimiento y la diferenciación celular 3, 4, 5, 6, 7, 8. Además las uniones comunicantes se han asociado conmuchas enfermedades incluyendo el cáncer de 9, 10, atrofia muscular 11, algunas enfermedades genéticas y enfermedades desmielinizantes 12.
Este tipo de diafonía intercelular se puede evaluar mediante varios métodos 13, 14, 15, 16. En este artículo se muestra cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas. Se discute cómo preparar las células y la micropipeta, el uso de la micromanipulador y la inyección de un colorante amarillo Lucifer en una línea de células epiteliales del timo. Por lo general, este procedimiento experimental podría ser analizado por el promedio de células conectadas a la célula de carga con colorante. Además, este método podría ser utilizado con otros colorantes fluorescentes con peso molecular por debajo de la brechauniones de corte que es de aproximadamente 1.000 daltons.
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Protocol
1. Preparación de las células
- Mantener un cultivo de una línea celular epitelial del timo (IT76M1) o células a ensayar en una incubadora (37 ° C / 5% de CO 2).
- Se lavan las células con PBS 1x (repetir este artículo 3x).
- Añadir tripsina a las células durante 5 min.
- Añadir medio (dos veces del volumen de tripsina añadida en el punto 1.3) con 10% de FBS (suero bovino fetal) a las células con tripsina y se centrifuga (800 x g durante 5 min).
- Contar las células en un hemocitómetro.
- Ajuste la densidad de células de acuerdo con el tipo de célula como las células tienen que estar en estrecho contacto entre sí para permitir el acoplamiento. Nota: En nuestro caso, hemos utilizado 3 x 10 5 células por 35 mm placa de Petri.
2. Preparación Micropipeta
- Tirar de la micropipeta como se especifica a partir de una micropipeta capilar de vidrio (1,5 mm de diámetro) a una final 0,2 micras de diámetro a fin de alcanzar una resistencia final de aproximadamente 30 mOf "> 17, 18.
NOTA: Como alternativa, las pipetas de inyección se pueden comprar. La resistencia depende del tamaño de célula, por ejemplo, sería necesario que las células acinares pancreáticas un microelectrodo de mayor resistencia, por ejemplo (100-150 mO) 19. Un problema común que podría ocurrir es la precipitación de Lucifer Yellow solución que puede obstruir la micropipeta y puede requerir filtración o centrifugación antes. Antes de la inyección, la micropipeta debe ser analizado bajo el microscopio para detectar si hay una obstrucción o cualquier tipo de interrupción 13. La micropipeta puede ser probada mediante la inyección de LY con la punta de la micropipeta en el interior de una solución salina.
3. Prueba de la Micropipeta
- Preparar la solución de Amarillo Lucifer (5%) en 150 mmol / L LiCl y cargar la micropipeta utilizando una jeringa o por el relleno (poner en él LY Solution).
- Coloque el micropipeTTE sobre el 35 mm placa de Petri con las células IT76M1 en la estación de trabajo microinyección y sumergir la punta de la micropipeta de vidrio en el medio celular. Centrarse en la micropipeta y realizar una prueba de tinte fluye mediante la aplicación de un pulso.
4. Una sola célula Amarillo Lucifer Microinyección
- Enfocar el microscopio justo encima de la capa de células utilizando una alta fi cación Magni (40X), luego baje lentamente la pipeta a las células utilizando el micromanipulador.
- Perfore la célula diana cuando la punta está lo suficientemente cerca como para tocar la membrana celular, y aplicar un pequeño pulso de hiperpolarización para introducir el LY en la célula. El voltaje aplicado dependerá de la carga neta del colorante a inyectar. Alternativamente, algunos otros tintes podrían ser utilizados con esta técnica, como se muestra en la Tabla 1.
Nota: En principio cualquier colorante hidrófilo con MW inferior a 1 kDa podría ser utilizado. Sin embargo, la tasa de transferencia podría variar de acuerdo con el peso y de hidrofilicidad. Además, unspecific transferencia del colorante utilizado debe ser evaluado. - Capturar imágenes de células 3 min después de la inyección de tinte o hacer una pequeña película con microscopía de lapso de tiempo (30 fps).
NOTA: Un enfoque similar podría ser visto en Hitomi et al (2015) 20. Para evitar la comunicación por puentes intercelulares (mitosis incompleta), un co-inyección de dextrano rodamina (de 2 a 10 KDa), que no pasa a través de uniones sino que pasa a través de puentes intercelulares y ciertos tipos de nanotubos se recomienda como se muestra en la Figura 2 .
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Representative Results
Línea de células epiteliales del timo IT-76MI se utilizaron para evaluar tinte de acoplamiento por uniones comunicantes como se describen estas células para expresar uniones gap funcionales formados por conexinas 43 21. La Figura 1 muestra la inyección de Lucifer Yellow cuando se aplica en la célula debajo de la punta de la pipeta. Después de algunos minutos, las células se vuelven conectados fluorescente (asteriscos) que indica la difusión del colorante fluorescente a través de las uniones gap. El número de células y el tiempo a se hizo fluorescente se asocia directamente con el grado de la comunicación celular entre estas células. La figura 2 muestra la inyección de LY en las células epiteliales del timo y los insertos (inserto d) muestran la co-inyección de LY y rodamina dextrano (10 kDa). Como era de esperar la LY pasa a una célula vecina, aunque la rodamina dextrano hace no a causa de su alto peso molecular. Además, la presencia de un bloqueador de GJ (inserto f), octanol, blocked el paso del colorante a las células circundantes. Alternativamente, se puede evaluar el grado de acoplamiento de una célula específica o el efecto de un fármaco sobre la función de GJ. La Figura 3A muestra la inyección de LY en células TEC con o sin dexametasona. A continuación, se inyectaron 100 células, en presencia de dexametasona y el porcentaje de células de 1 o 2 que se comunican fue similar en relación con el control sin la droga. Sin embargo el número de 3 o 4 células se comunican fue mayor en comparación con el control. Cinco o 6 células y 7 u 8 células con comunicación GJ en presencia de dexametasona no se observó en el control, indicando así que la dexametasona aumentó el grado de acoplamiento en las células TEC.
Figura 1: Lucifer amarillo inyección en las células IT-76MI. (A) La micropipeta cerca de la membrana celular. (B (C) Un impulso de prueba fue generado para verificar si el electrodo está en realidad inyectando el colorante. (D) La pipeta tocó la membrana celular y se carga con colorante amarillo Lucifer. (E) La célula cargada permitió que el medio de contraste para pasar a través de uniones a por lo menos cinco células vecinas (indicado por las flechas), X20. F) Un zoom digital se hizo para permitir una mejor visualización. Los asteriscos señalan las células que se han cargado en la microscopía de contraste de fase (Figura 1A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Lucifer amarillo inyección en las células epiteliales del timo (TEC). contraste de fases y microscopía de fluorescencia. (A B) de células epiteliales del timo humano. (C y D) Enfermera del timo de la célula, (E y F) Una línea celular epitelial del timo de ratón, respectivamente. El inserto en (D) muestra la misma célula (flecha) después de una inyección de 10 kDa rodamina-dextrano (no permeable a través de uniones). Los insertos en (E) y (F) muestran la ausencia de la transferencia de colorantes en la línea de TEC pre-tratados con octanol 1 mM (un cruce bloqueador de brecha) durante 10 min. En todos los paneles asteriscos marcan las células inyectadas. (AF) X 200. Reproducido de Alves et al. , 1995 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Gap cruce Communication incrementado por la dexametasona en una línea de células epiteliales de la rata. TEC fueron tratados con dexametasona 1 M, y el grado de acoplamiento se evaluó mediante el ensayo de transferencia de colorante Amarillo Lucifer. Campos (A) Microscopía (contraste de fases y de fluorescencia, respectivamente, en los paneles izquierdo y derecho) que representan la célula inyectada y las que se acopla cuando se inyectó LY (320X aumentos). En todos los paneles asteriscos marcan las células inyectadas. (B) Histogramas que muestra el patrón de acoplamiento de control y células tratadas con dexametasona. El análisis consta de 100 microinyecciones por grupo. Reproducido de Alves et al., 2000 23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| COLORANTE | MW | Excitación / emisión |
| ácido carboxílico hidroxicumarina | 206 | 386/488 |
| azul calceína | 321 | 360/449 |
| 4 ', dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol | 279 | 358/461 |
| carboxifluoresceına | 376 | 492/517 |
| yoduro de etidio (bromuro) | 314 | 518/605 |
| Amarillo Lucifer CH | 443 | 428/536 |
| Alexa Fluor 488 | 570.5 | 495/519 |
| calceína | 622 | 494/517 |
| Yoduro de propidio | 414 | 535/617 |
Tabla 1: Los colorantes se utilizan actualmente para experimentos de microinyección. Aquí en,algunos utilizan colorantes con el peso molecular y la longitud de onda de excitación / emisión.
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Discussion
Con el fin de verificar la presencia de brecha de la salida intercelular funcional, el uso de trazadores, que son de la membrana impermeable, aunque permeable por canales intercelulares se requieren 16. Fluoresceína, el primer tinte fluorescente para observar célula a célula de acoplamiento 22, es permeable entre las membranas no de unión 3 y por lo tanto ha sido sustituido por Lucifer colorante amarillo 15. En la actualidad, para encontrar la mejor opción entre los muchos tipos diferentes de trazadores fluorescentes depende del alcance y condiciones del experimento. El procedimiento de carga de las células con tintes fluorescentes permite la evaluación de la morfología, la función de las células individuales y la tasa de cinética de transferencia entre las células. Además, la microinyección de colorante permite una mejor comprensión del papel fisiológico de las uniones comunicantes entre las células 21, 23, ya que el grado de ccomunicación ellular está relacionado con el número de células acopladas.
Varios factores clave son cruciales para el éxito la obtención de los datos de microinyección. la homeostasis celular normal y la integridad deben ser mantenidos, por tanto, un tiempo de inyección corto (<1 s) de tinte y experiencia técnica con microinyección se necesita. Los factores clave para conseguir una mejor resolución de las imágenes capturadas es tener una cámara CCD enfriado, los filtros de fluorescencia en el lugar y el uso de un alto objetivo NA 14. Además, algunos consejos podrían ser útiles como: 1) se recomiendan placas de cultivo celular con rejillas para visualizar una célula inyectada en particular, también vidrio platos de fondo deben ser utilizados para aplicaciones de microscopía de alta resolución; 2) se recomienda para hacer 10-20 agujas tirados antes de comenzar microinyecciones; 3) en función de la resistencia de la punta del electrodo puede ser muy útil, la carga de la micropipeta con el colorante mediante capilaridad al tocar la punta de la pipeta en la solución de colorante; 4) no es necesario para cargar todo el cuerpo de la pipeta, unos pocos microlitros para llenar la punta y de 2 a 3 mm por encima de la punta es suficiente; 5) iniciar el experimento con un objetivo menos magnificada y tratar de ver la sombra de las paredes de la pipeta. Después, mover la pipeta lo más cerca posible y antes de tocar la célula, cambiar al objetivo mayor aumento, tales como 40x o superior; 6) Algunos grupos utilizan un microinyector neumático. inyección neumática no es la mejor elección, ya que no es preciso y podría inyectar volúmenes desconocidos; con un pulso el protocolo podría ser estandarizado para inyectar un volumen conocido de colorante. Adicionalmente, se recomienda para inyectar en la membrana por encima del citosol por la profundidad; inyección en la membrana por encima del núcleo podría dañar y afectar a la fisiología celular. Por último, las células que no son demasiado planas son preferibles a las planas.
En resumen, este método es eficaz para estudiar la comunicación intercelular por uniones comunicantes sino necesidads experiencia / experiencia y buen material y equipos para obtener datos de alta calidad. Esperamos que este artículo y vídeo de ayuda principiantes a entender y llevar a cabo esta técnica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
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