皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

Summary

動的な縦イメージングレポータートランスジェニックマウスにおける神経終末の選択的レーザ病変のためのプロトコルが提供される。

Abstract

皮膚の神経終末、例えば神経因性疼痛²のような^1を感知するように、ならびに病理学的過程における生理学的プロセスに関与している。彼らの近くに対地位置決めが無傷動物の生体における皮膚の神経終末の顕微鏡イメージングを容易にします。多光子顕微鏡を使用して、皮膚組織の強い光散乱の問題を克服精細な画像を得ることができる。 （末梢感覚ニューロンを含む）ニューロンでのThy-1プロモーターの制御下にEYFPを発現するレポータートランスジェニックマウスは、数ヶ月、あるいは生涯までの長期間にわたって個別の神経終末の縦断研究に適しています。さらに、イメージングと同じフェムト秒レーザーを用い、それは神経線維の再構築の研究のために神経線維の高度に選択的な病変を生成することが可能である。ここでは、in vivoイメージング縦多するための簡単で信頼性の高いプロトコルを提示しマウス皮膚の神経終末上のレーザーベースのマイクロサージェリー。

Introduction

皮膚の神経終末は、異なる病態生理学的状態の下での動的な変化を受ける。神経線維は末梢神経障害²またはモートン神経腫³のような疾患の過程で変性および再生や再編のプロセスを経ることができます。外傷後に、皮膚の神経終末ダイナミクスの重要な部分は、損傷を受けた領域の再神経支配である。しかし、神経終末の調査のための一般的なアプローチは、進行中の処理⁴に関するリアルタイム情報を欠いてex vivoでの組織学的の切片である。遺伝的にコードされた蛍光マーカーを用いて、このように構造変化リッチと有意に関連する情報を取得し、生きている動物の皮膚における神経終末を追跡することが可能である。皮膚の神経終末の調査は、従来の蛍光顕微鏡法を使用して可能であるが、皮膚組織の強い光散乱が強く品質を損なうデータの^5を取得した。多光子顕微鏡は、対物レンズの焦点位置からの蛍光の発光をもたらす励起光の光子のエネルギーの非線形和に起因する強散乱組織において高解像度画像の取得を可能にする。この効果は、皮膚組織⁶の測定のためのロバストな侵入深さの増加および信号対雑音比の向上につながる。イメージングの場合と同じレーザを用いて、神経線維⁷の選択的な切開を作製することが可能である。以下のプロトコールでは、市販の多光子顕微鏡システムを用いて選択的レーザー病変と組み合わさレポータートランスジェニックマウスにおけるin vivoでの皮膚神経終末の長手方向のイメージングの方法を示す。

Protocol

動物を対象とする手順は、国立動物実験委員会、フィンランドによって承認されている。

イメージングのための1。動物の準備

1. intraperitionalケタミン（IP）注射（体​​重あたり0.08 mg）およびキシラジン（体重あたり0.01 mg）を、マウスを麻酔。リアつま先ピンチ反射麻酔をチェックしてください。
2. 脱水から目を保護するために目薬（Viscotears）に動物の目を浸し。
3. 低体温症を防ぐために、37℃で加熱パッド（SUPERTECH）上にマウスを置きます。
4. 70％エタノールで画像化のために指定されたフットパッドを清掃してください。
5. 皮膚とカバーガラスの間に液浸カップリングのためのフットパッドの皮膚上の水滴を追加します。
6. カバークラスで金属リングの下に位置している後足の下にプラスチック包装材を入れてください。
7. 皮膚を平らにするプラスチック包装材料の厚さを調整する。
8. カバーGLASに一滴の水を入れてカバーガラスと客観の間に液浸用の。

2メタル固定器リングの準備

1. 皮膚の安定化のために金属固定器を利用する。私たちは、金属リング（Neurotar社、フィンランドの礼儀）とまちづくりで保護された二羽の固定器を使用しています。 、瞬間接着剤で注射器を埋めるリング上の針を介して瞬間接着剤の小滴を入れて、静かにリング表面の均一なカバレッジを接着剤を広げた。接着剤の過剰量が視野を低減し、その後の画像化を妨害することができるので、唯一の均一な被覆のために必要とされる接着剤の最小量を置くことが重要である。
   注：または（下から）金属棒および（カバーのような）標準的な顕微鏡用スライドガラスの組み合わせは、皮膚を平らにし、アセンブリ¹⁴の適切な光結合を確実にするために使用することができる。二つのペーパークリップがガラスと金属棒表面との間の足を固定するために使用することができた（ 図4
2. 顕微鏡カバースライド（直径5 mm、電子顕微鏡学）と共に環を覆います。
3. 電動顕微鏡ステージ上montagedされ、剛性金属棒にリング固定器にねじ込みます。

3イメージング手順

1. THY1-YFP-Hマウスを用いる場合には、神経線維を可視化する蛍光ランプスペクトルの青色部分を選択する。落射蛍光モードでの関心の神経を見つけて、それに関心を持っている。
2. 縦イメージングのためのスポットの座標を書き留めます。基準点として手根パッドを使用してください。以下の画像化セッションの間、第手根パッドを検出し、同じアップストリーム大きな神経線維を見つけ、保存された座標を使用して戻ります。なお、基準の同じシステムを維持するために金属棒に垂直な同じ方向にフットパッドを配置することが不可欠である。
3. 二光子モードをオンにします。 THY1-YFP-Hマウスの場合は、レーザ放射の950 nmの波長を使用するのに適している神経線維を可視化した。
4. （YFP蛍光や髪の自家蛍光を検出するためにYFP標識された神経のイメージングのために580から630 nmの520から550nmの第2高調波発生検出のために450〜480nmの）レーザー波長と発光チャンネルを選択し、で始まる光損傷と漂白を防止するために、低レーザパワー（3-5％）。光電子増倍管での典型的な電圧は、イメージングのこの種の600〜700 Vです。
5. 所望の解像度（512×512または高速イベントの測定のための640×640、800×800または1,024×1024形態学的画像化のために）、軸方向のステップ（1-3ミクロン）、試料の厚さと時間間隔（1〜10を設定してください分）。露光時間は、一画素当たり1ミリ秒のオーダーである。
6. まずソフトウェアにおける撮像ボリュームの上下の境界をマークします。
7. 病変前の基準のための参照画像スタックを取得します。必要なときに、それは数分の間にベースラインを記録することができる。
8. ティッシュできれいなパッドを撮像した後、それが完全に目を覚ましになるまで36℃での回収箱にマウスを入れた。
   注記：通常、レーザ誘起病変と組み合わさつの撮像セッションの期間（以下を参照）1時間を超えない。私たちは、動物が深く10〜15分毎に麻酔をかけていることを検証することをお勧めします。これは、画像自体を妨害してはならないが、実験手順が計画されている間考慮されるべきである。シングルケタミン/ xylazyne投与量の効果の持続時間は、このように私たちは25〜30分後に投与量を1/2¼追加適用することを推奨し、約30〜40分程度である。
   注：実験は個別の動物用のイメージングセッションの周波数再の悪影響を避けるために、2日ごとに1セッションを超えてはならないことを計画しているときにも同様に考慮されるべきである競争麻酔。

4。レーザー病変

1. 参照画像スタックを取得した後、マイクロ病変を作るために漂白プロトコルを使用。
2. 100％にレーザーパワーを大きくしてください。
3. 関心領域ごとに100〜1,000ミリ秒（標準撮像の場合より100-1,000x以上）に露光時間を増やします。
4. 病変のための領域を概説。
5. 漂白に切り替えることにより、病変を行います。
6. 定期的な撮像モードに切り替えとタイムラプス録画を続行します。

5。データ処理と解析

1. ImageJの^8（ヨアヒムウォルター、スペクトルアンミキシングプラグインを使用してアンミキシングを続行http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ）。
2. 画像スタックを開いて、チャンネルを分割します。
3. バックグラウンド測定のための神経や髪の空き領域を検索します。領域Oを入れてその領域でのF関心。
4. 慎重に神経から明確に区別され、髪の一部を概説しています。
5. それは髪から分離している画像の一部の神経概要。
6. 行列をアンミキシング保存します。
7. スタック全体のために測定された分離行列を適用します。
8. * tifファイル形式の新しい処理された画像スタックを保存します。

Representative Results

記載された技術を使用して、病変後に同じファイバを追跡し、損傷した神経末端（ 図1）の分解を研究することが可能である。 120〜150ミクロンの厚さのスタックの取得は、視野内の全繊維を維持するために数日の間に繰り返しの画像化のための通常適切である。

プラスチック包装材料は、皮膚を平らにするように調整されている場合、病変は、典型的には、簡潔に製造することができるので、コラーゲン層が画像上に均一な強度（ 図2）に表示される。コラーゲン層以上の神経終末は、正確な病変を生成するのに最適である。

皮膚が平坦化されていない場合、画像がぼやけされる（ 図3）を生じ得る。この状況における強度は、依然として形態素神経線維の調査が、レーザー傷害手順に適切であり得るだろう妨げられる。

最大投影画像として提示神経線維上のレーザー損傷の影響の図1。タイムトラック上部の画像を前にして直接病巣後の繊維を示し、下のパネルは30分であり、10日後に同じファイバを示している（左、右パネル、それに応じて）。 10日病変後に表示される非神経自然の一部YFPを発現する構造があります。これらの構造は、外傷性の条件下で一過性にはThy1遺伝子を発現することが知られているケラチノサイトである可能性が高い。神経線維のYFP蛍光は黄色で示されている。矢印は病変の領域をマークします。スケールバーは30μm。

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平坦化された皮膚領域における神経終末のために図2の最大投影像は。神経線維のYFP蛍光は黄色で表示され、コラーゲンの第二高調波発生は青色で示されている。スケールバーは50μm。

図3複数の光学セクションの最大Z投影のようにして得られた皮膚の湾曲した領域内の神経終末。神経線維や髪の自家蛍光のYFP蛍光が黄色で表示され、コラーゲンの第二高調波発生を示している青。スケールバーは50μm。

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カバーとしての顕微鏡用スライドガラスを使用して足固定手順。図。スライドは、標準的なペーパークリップを使用して、金属棒に取り付けられている。

Discussion

このビデオプロトコルでは、単一の神経終末の非侵襲的な縦二光子イメージングのための方法を実証する。

皮膚神経支配の力学は、乾癬及び末梢神経障害^2、のような疾患および外傷⁹に影響されます。二光子イメージングは​​、コラーゲンマトリックス中の神経線維構造の詳細な分析を可能にする。トランスジェニックレポーターマウスの使用は、神経線維の染色に関する問題を回避するのに役立つ。はThy1-mitoCFPマウスは神経線維¹¹ミトコンドリアダイナミクスの機能研究の機会を提供し得るはThy1-YFP-H株は、形態学的データ分析¹⁰のために十分に堅牢であるように思われる。 YFP-16 / ICRラインは、マイスナー小体¹²を観察するために使用することができる。別のアプローチは、特定のニューロン集団の選択的な追跡のための後根神経節へのウイルスの注射かもしれ13。

これは、コラーゲンマトリックス中で選択的病変の産生が強く、皮膚の上層に比べて阻害されることが注目に値する。イメージングのための蛍光強度が10〜20％の範囲に異なりつつ神経線維の解剖用時には露出時間が倍ほどに異なることが理由である。一定の浸漬結合が維持されなければならない画像の良好な品質を維持する。

画像の解像度は、通常、買収の望ましい速度に依存します。一つは、高速な変化を検出または微細形態学的特徴の研究のための解像度を増加させるために画像形成された領域の解像度または厚さを減少させることができるので、解像度800×800ピクセル、30フレーム - スタックを製造するための典型的な時間は、1分である。

フットパッドの固定は、画像のドリフトを許可しないように十分タイトであるべきであるが、同時にそれは、T内の血液循環に影響を及ぼすべきではない彼は皮膚。手順の最適化のために、血管トレーサーの注射は、血流を監視する介してプラスチック包装材料の圧力を調整するために1つを可能にすることが可能である（ 例えば 、テキサスレッドは、70kDaのデキストランが標識される）。心拍及び呼吸の動きを直接足に伝達されないため、動物に深く麻酔されるので、このプロトコルに記載の調製におけるモーションアーチファクトがにくい、足自体がしっかりと固定組立体に取り付けられ、以下同様である。しかしながら、わずかな動きが、高倍率撮影が行われる場合は特に可能である。このケースでは、モーションアーチファクトを補償するように設計ImageJのプラグインを使用してお勧めすることができます。

同じ領域の反復イメージングは、手根パッド^14、または注射のスポットがランドマーク⁶として機能することができる足蹠におけるいくつかの物質の注入の場合のような基準点を使用することによって達成することができる。他の可能性は、皮膚の入れ墨です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782