Summary
यह लेख उच्च throughput परख गया है कि सफलतापूर्वक अपनी क्षमता Pseudomonas aeruginosa में चक्रीय di-जीएमपी के सेलुलर स्तर में हेरफेर करने की क्षमता के लिए छोटे अणुओं के बड़े पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए स्थापित किया गया, एंटीबायोटिक दवाओं की खोज और परिसर के परीक्षण के लिए एक नया शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने का वर्णन है।
Abstract
पारंपरिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध बैक्टीरियल हाल ही में पता चला नियामक रास्ते में नई दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए अनुसंधान प्रयासों को प्रेरित किया है। नियामक प्रणाली है कि एक दूसरे के दूत के रूप में intracellular चक्रीय di-जीएमपी (सी-di-जीएमपी) का उपयोग लक्ष्य के एक ऐसे वर्ग के हैं। सी-di-जीएमपी एक संकेत अणु में पाया लगभग सभी बैक्टीरिया एंटीबायोटिक प्रतिरोध, biofilm गठन और डाह सहित प्रक्रियाओं की एक व्यापक रेंज को विनियमित करने के लिए कार्य करता है। कैसे सी-di-जीएमपी एंटीबायोटिक प्रतिरोधी biofilm विकास के नियंत्रण पहलुओं संकेत की समझ दृष्टिकोण जिससे न्यूक्लियोटाइड या इन संकेत दे रास्ते के विघटन के सेलुलर सांद्रता के परिवर्तन को कम biofilm गठन या एंटीबायोटिक दवाओं के लिए biofilms की वृद्धि की संवेदनशीलता को जन्म दे सकती सुझाव दिया है। हम एक सरल उच्च throughput bioreporter प्रोटोकॉल का वर्णन, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), जिनकी अभिव्यक्ति सी-di-जीएमपी उत्तरदायी प्रमोटर cdrA के नियंत्रण में है पर आधारित, तेजी से संभावित Pseudomonas aeruginosa (पी aeruginosa) में सी-di-जीएमपी सेलुलर स्तर मिलाना के साथ छोटे अणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए। यह सरल प्रोटोकॉल 48 घंटे के भीतर 3,500 यौगिकों के ऊपर की तरफ स्क्रीन और क्षमता कई सूक्ष्मजीवों के लिए अनुकूलित किया जाना है सकते हैं।
Introduction
चिकित्सकीय महत्वपूर्ण एंटीबायोटिक दवाओं के खिलाफ बैक्टीरियल प्रतिरोध का तेजी से विकास वर्तमान में स्वास्थ्य पेशेवरों का सामना करना पड़ दुनिया भर में प्रमुख चिंताओं में से एक है। पारंपरिक एंटीबायोटिक दवाओं की इस विफलता रासायनिक बात है कि बैक्टीरियल विषैलापन और रोग प्रगति 1 में शामिल प्रक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के लिए नई खोजों को प्रेरित किया है। ऐसा ही एक नियामक प्रणाली है कि इस्तेमाल intracellular दूसरा दूत चक्रीय di-जीएमपी (सी-डी-जीएमपी) ने हाल ही होनहार वैधता 2-4 के साथ एक लक्ष्य बन गया है। यह स्थापित किया है कि इस वैश्विक दूसरा दूत संकेत अणु एंटीबायोटिक प्रतिरोध, आसंजन, biofilm गठन और रोग 2-4 सहित कई कार्यों को नियंत्रित करता है।
अब यह समझा जाता है कि बैक्टीरिया कोशिका में सी-di-जीएमपी के सेलुलर स्तर संश्लेषण और गिरावट जिससे जीटीपी के दो अणुओं से GGDEF डोमेन युक्त diguanylate cyclases (DGCs) क सी-di-जीएमपी के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं द्वारा नियंत्रित किया जाता हैereas सी-di-जीएमपी गिरावट phosphodiesterases (PDEs) है कि या तो एक EAL या एक HD-ढकोसला डोमेन द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है ((3 में समीक्षा, 5))। इन डोमेन युक्त प्रोटीन अक्सर अन्य संकेत डोमेन होते हैं, सुझाव है कि सी-di-जीएमपी कारोबार में अपनी गतिविधि या तो सीधे या परोक्ष रूप से पर्यावरण या सेलुलर संकेतों 3,5 द्वारा विनियमित है। नतीजतन, सी-di-जीएमपी कार्यों संकेत बैक्टीरियल phenotype में संशोधन करने के लिए विविध पर्यावरण cues के संवेदन से जोड़ने के लिए। सी-di-जीएमपी विभिन्न तंत्रों 4 से प्रतिलेखन, बाद प्रतिलेखन और बाद के अनुवाद के स्तर पर बैक्टीरिया में अपनी विनियामक प्रभाव डाल रही है।
कई बैक्टीरियल कोशिकाओं में सी-di-जीएमपी का एक प्रमुख प्रभाव, विशेष रूप से जीवाणु 'जीवन शैली' और, के निर्धारण में है गतिशील planktonic कोशिकाओं और बिना डंठल कोशिकाओं सतहों से जुड़ी या biofilms के बहुकोशिकीय संरचनाओं में आयोजित बीच संक्रमण के नियंत्रण में 3,5। सामान्य में, उच्च सेलुलरसी-di-जीएमपी के स्तर, biofilm गठन और sessility साथ जुड़े रहे हैं कम सेलुलर स्तर को प्रोत्साहित करते हुए कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों 3,5 में गतिशीलता और डाह कारक संश्लेषण। इस प्रकार, सी-di-जीएमपी सिगनल के कामकाज की एक अधिक विस्तृत ज्ञान biofilm गठन और बैक्टीरियल रोगज़नक़ों में डाह के निषेध के लिए रणनीति खरीद सकता है। यह देखते हुए एक चुनौतीपूर्ण काम है कि ज्यादातर बैक्टीरिया का जीनोम GGDEF, EAL और / या HD-ढकोसला डोमेन (उदाहरण के लिए पी aeruginosa 40 से अधिक प्रोटीन है) और कई प्रभावोत्पादक 6.7 के साथ कई प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना है।
हालांकि, यहां तक कि इस जटिलता के साथ, हाल के सबूत से पता चलता है कि रणनीतियों सी-di-जीएमपी सिगनल जोड़ तोड़ सकते हैं या तो रोकने एंटीबायोटिक प्रतिरोधी संक्रमण के विकास या उन्हें क्लासिक एंटीबायोटिक दवाओं 2 के सह-प्रशासन द्वारा प्रतिरक्षा प्रणाली या कुशल उपचार के लिए अतिसंवेदनशील बनाने के लिए विकसित किया जा सकता है। इस के साथ लाइन में, यह प्रयोगात्मक कृत्रिम कमी है कि प्रदर्शन किया गया हैइन विट्रो -grown पी में intracellular सी-di-जीएमपी की aeruginosa biofilm गठन की कमी हुई और antimicrobials के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है, जबकि पी ले जाता है सिलिकॉन प्रत्यारोपण पर aeruginosa विकसित किया biofilms, चूहों की पेरिटोनियल गुहा में स्थित है, इसी तरह फैशन 8-11 में फैलाया जा सकता है।
यहाँ, हम छोटे अणुओं है कि संभावित पी में सेलुलर सी-di-जीएमपी स्तरों मिलाना कर सकते हैं स्क्रीन करने के लिए एक उच्च throughput, प्रतिदीप्ति आधारित संवाददाता परख का वर्णन aeruginosa (चित्रा 1)। परख एक पहले से विकसित GFP संवाददाता जिनकी अभिव्यक्ति transcriptionally सी-di-जीएमपी उत्तरदायी cdrA प्रमोटर 12 से जुड़ा हुआ है का उपयोग कर सेलुलर स्तर को मापने के सी-di-जीएमपी पर आधारित है। इस प्रोटोकॉल पी में संवाददाता का निर्माण की अभिव्यक्ति के लिए कार्यप्रणाली का वर्णन ब्याज की aeruginosa तनाव, यौगिक प्लेट तैयारी, 384 अच्छी तरह प्लेटें, विकास की स्थिति, हम के रूप में संस्कृति टीकाडेटा संग्रह, प्रबंधन और विश्लेषण (चित्रा 1) के बारे में जानकारी के रूप में करूँगा। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल उपन्यास यौगिकों बैक्टीरिया में संकेत सी-di-जीएमपी को निशाना बनाने की पहचान संभावित करने के लिए शोधकर्ताओं सहायता करेगा, और अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोग के लिए पी के जीव विज्ञान को समझने में लक्ष्य aeruginosa।
Protocol
नोट: क्लोनिंग और शुद्ध सी-di-जीएमपी संवाददाता प्लाज्मिड के परिवर्तन के लिए प्रक्रिया कहीं और 12 चर्चा कर रहे हैं।
1. GFP की पीढ़ी टैग की गईं सी-di-जीएमपी रिपोर्टर पी aeruginosa तनाव
- पी का एक भी कॉलोनी के साथ Lysogeny शोरबा के 5 मिलीलीटर (पौंड) मध्यम टीका लगाना aeruginosa और 200 rpm पर झटकों के साथ रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं।
- स्थानांतरण एक 1 एल कुप्पी में ताजा लेग माध्यम के 200 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति के 2 मिलीलीटर और 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- 600 एनएम (600 आयुध डिपो) कुप्पी से एक 1 मिलीलीटर नमूना ले रही है और (के रूप में वर्णित पहले 12) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग जांच से हर 30 मिनट पर ऑप्टिकल घनत्व मॉनिटर।
- आयुध डिपो के 600 0.3 के बीच तक पहुँच जाता है - 0.5, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में संस्कृति की 40 मिलीलीटर की जगह है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8000 rpm पर centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला और आर त्यागनेठंडा, बाँझ 300 मिमी sucrose के समाधान के 40 एमएल में कोशिकाओं को ई-रोक देते हैं।
- 1.5 चरण में वर्णित है और ठंडा, बाँझ 300 मिमी sucrose के समाधान के 20 मिलीलीटर में फिर से निलंबित रूप centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं को दूसरी बार।
- 1.5 चरण में वर्णित है और ठंडा, बाँझ 300 मिमी sucrose के समाधान के 400 μl में फिर से निलंबित रूप centrifuging द्वारा कोशिकाओं को एक अंतिम समय गोली।
नोट: इस बिंदु पर सेल घनत्व मिली लीटर प्रति लगभग 1 एक्स 10 11 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU / एमएल) होना चाहिए। - 30 मिनट, जिसके बाद वे electroporation के लिए तैयार कर रहे हैं के लिए बर्फ पर कोशिकाओं टेंशन मत लो।
- पी के 40 μl करने के लिए एक 0.2 माइक्रोग्राम / μl pCdrA :: GFP सी प्लाज्मिड 12 समाधान के 1 μl जोड़े aeruginosa विद्युत सक्षम कोशिकाओं एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कि बर्फ पर पूर्व ठंडा किया गया है में से ऊपर तैयार किया। निलंबन मिलाएं और एक पूर्व ठंडा, 2 मिमी इलेक्ट्रोड की खाई, electroporation क्युवेट में स्थानांतरित।
नोट: pCdrA :: GFP सी: pUCP22Not-पी cdrA -RBSII- GFP (Mut3) टी 0 टी 1, एम्प r ग्राम आर, जो पी में सी-di-जीएमपी के intracellular स्तर के एक फ्लोरोसेंट readout देता है aeruginosa में तनाव, विकसित और Rybtke एट अल। 12 द्वारा मान्य किया गया था। - टिशू पेपर के साथ क्युवेट के बाहर पर नमी निकालें और electroporator का नमूना कक्ष में क्युवेट जगह है। 2.5 केवी, 25 μF की समाई और 200 Ω के प्रतिरोध का एक वोल्टेज के साथ पल्स।
- क्युवेट निकालें और लेग माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें। फिर, एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण और 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
- 10 μl, 50 μl और (100 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में) एम्पीसिलीन के साथ पूरक बाँझ लेग अगर प्लेट पर संस्कृति के 100 μl aliquots बिखरा हुआ है, और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
- GFP अभिव्यक्ति (पुष्टि excitatiपर 485 एनएम, 520 एनएम पर उत्सर्जन) एक मानक GFP चैनल के साथ एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे प्लेट की जांच और एक भी कॉलोनी लेने से कम 5 मिलीलीटर लेग टीका लगाना 1.1 चरण में वर्णित के रूप में रातोंरात सेते हैं। एक 2 मिलीलीटर में 0.5 मिलीलीटर 50% ग्लिसरॉल के साथ रातोंरात संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर मिक्स -80 डिग्री सेल्सियस पर शीर्ष ट्यूब और दुकान पेंच।
टीका के लिए स्टार्टर संस्कृति की 2. तैयारी
- दो दिन स्क्रीन से पहले, पी थाली aeruginosa तनाव से (pCdrA :: GFP सी प्लाज्मिड युक्त) -80 सी शेयर एक लेग अगर प्लेट पर ° धीरे एक बाँझ टीका का उपयोग कर प्लेट पर बैक्टीरिया के प्रसार से (100 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में एम्पीसिलीन के साथ पूरक) पाश। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली सेते हैं।
- शाम स्क्रीनिंग से पहले, पी का एक भी कॉलोनी टीका लगाना लेग माध्यम के 10 मिलीलीटर में थाली से aeruginosa एक टू में (100 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में एम्पीसिलीन के साथ पूरक)हो सकता है और 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व संस्कृति रातोंरात सेते हैं।
- स्क्रीन के दिन, एक आयुध डिपो के 600 1.0 और फिर आगे एक आयुध डिपो के लिए 5% पौंड के साथ गिराए करने के लिए पहली बार इसे गिराए ताजा लेग माध्यम के साथ रात भर पूर्व संस्कृति से एक उपसंस्कृति तैयार 0.04 (1:25 के अनुपात) के 600 ।
नोट: टीका माध्यम की कुल मात्रा प्लेटों की संख्या पर निर्भर करता है परीक्षण किया जाना है। 5% पौंड आवश्यक एकाग्रता के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ 100% पौंड गिराए द्वारा किया जाता है। महत्वपूर्ण बात है, मीडिया (5% पौंड) pCdrA के विधान सक्रियण :: पी सी में GFP की अनुमति देता है aeruginosa। - एक बाँझ चुंबकीय उत्तेजक बार कंटेनर में संस्कृति न्यूनतम गति से एक चुंबकीय दोषी पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बैक्टीरिया मीडिया को जलवायु के अनुकूल बनाना करने से पहले वे 384 अच्छी तरह से प्लेटों में तिरस्कृत कर रहे हैं अनुमति देता है जोड़ें और हलचल।
3. टीका और 384 अच्छी तरह प्लेटें युक्त की ऊष्मायनछोटे अणुओं
नोट: बाँझपन और अच्छा सड़न रोकनेवाला तकनीक निम्नलिखित कदम के लिए सर्वोपरि हैं।
- सकारात्मक नियंत्रण (100% निषेध) तैयार करने के लिए, 2.3 कदम में तैयार उपसंस्कृति के 10 मिलीलीटर (12 प्लेटों के लिए पर्याप्त) के लिए 20 μl tobramycin सल्फेट (25 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने और धीरे मिश्रण। पिपेट में कुओं A23 सकारात्मक नियंत्रण संस्कृति के 40 μl - p23 (चित्रा 2)।
- नकारात्मक नियंत्रण (0% निषेध) तैयार करने के लिए, 2.3 कदम में तैयार उपसंस्कृति के 10 मिलीलीटर (12 प्लेटों के लिए पर्याप्त) के लिए 30 μl डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) जोड़ने और धीरे मिश्रण। पिपेट में कुओं A24 नकारात्मक नियंत्रण संस्कृति के 40 μl - P24 (चित्रा 2)।
- P22 (चित्रा 2) - प्लेटों छोटे अणुओं के साथ टिकट लगा के प्रत्येक के लिए, पतला रात भर संस्कृतियों (2.3 कदम में वर्णित) के 40 μl की एक मात्रा कुओं A1 में टीका लगाना।
नोट: यह एक तरल हैंडलर लूटने का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकताओटी। बैक्टीरियल संस्कृतियों की विषम गुण के कारण, यह एक सतत और मध्यम आंदोलन बैक्टीरिया लगातार मीडिया में वितरित करते हुए वितरण रखने के लिए बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। ऐसा करने के लिए, चुंबकीय वितरण के दौरान 2.4 कदम से acclimatized संस्कृति चलाते रहें। - एक हवा पारगम्य कवर मुहर के साथ प्लेटों को सील करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए सेते हैं।
नोट: हवा पारगम्य मुहर सभी 384 कुओं भर में अपरिवर्तनीय की स्थिति बनाए रखने के लिए और थाली भर में ऑक्सीजन ढ़ाल के संभावित विकास को नाकाम करने के लिए महत्वपूर्ण है।
4. विकास (आयुध डिपो 600) और intracellular सी-di-जीएमपी स्तर की माप (GFP)
- spectrophotometric माप से पहले लगभग 30 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए थाली पाठक पूर्व गर्म संक्षेपण से बचने के लिए।
- धीरे पढ़ने से पहले हवा पारगम्य कवर सील हटा दें। अच्छी तरह से प्रति 10 चमक की स्थापना के साथ मापने 600 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व और0.2 सेकंड का एक व्यवस्थित समय।
- प्रतिदीप्ति मापने के लिए पहले, अच्छी तरह से A24 (नकारात्मक नियंत्रण) के आधार पर एक स्वत: प्राप्त और फोकल समायोजन बनाने के लिए और 75% (चित्रा 2) में लाभ लक्ष्य मूल्य निर्धारित किया है।
- प्लेट पाठक नियंत्रण सॉफ्टवेयर से, शुरुआत के माप पर क्लिक करें और 'पर क्लिक करें' फोकस और लाभ समायोजन / प्लेट आईडी '' टैब।
- खिड़की पर सही पर 'ध्यान समायोजन' 'और' 'चैनल ए' 'का चयन करें।
- चुनें '' लाभ समायोजन '' और '' अच्छी तरह से चयनित ', और' लक्ष्य 'मूल्य' के रूप में '75' में टाइप करें। अंत में, अच्छी तरह से '' शुरू समायोजन 'पर क्लिक' से पहले प्लेट लेआउट में A24 उठाओ। एक बार समायोजन किया जाता है, '' शुरू माप 'पर क्लिक करें।
- अच्छी तरह से और एक settli प्रति 10 चमक की स्थापना के साथ 485/520 एनएम के एक उत्तेजना / उत्सर्जन Maxima पर GFP संवाददाता से प्रतिदीप्ति उपाय0.2 सेकंड का समय एनजी।
- जांच की सभी प्लेटों से डेटा एकत्र। नोट: डेटा रीडिंग स्वत: प्लेट पाठक नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा डिफ़ॉल्ट के रूप में सहेज कर रहे हैं।
- सांख्यिकीय विश्लेषण पैकेज को खोलने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर के भीतर "मंगल" आइकन पर क्लिक करके रीडिंग देखें।
- विश्लेषण के लिए डेटा का उपयोग करने के लिए ब्याज की प्लेट नंबर पर "डबल क्लिक 'से डेटा निकालते हैं।
5. डेटा विश्लेषण
- एकरूपता और मजबूत जेड 'विश्लेषण है, जो सबसे आम गुणवत्ता उच्च throughput स्क्रीन के लिए सूचना दी मेट्रिक्स है का उपयोग परख के reproducibility का मूल्यांकन। मजबूत जेड 'सूत्र का उपयोग कर की गणना:
कहाँ Mad (माध्य निरपेक्ष विचलन) मानक विचलन के एक अनुमान है, पी सकारात्मक नियंत्रण (100% निषेध) है और एन नकारात्मक नियंत्रण दोनों आयुध डिपो 600 और GFP V के लिए (0% निषेध) हैalues। ध्यान दें: एक मजबूत जेड 'मूल्य से अधिक या 0.5 के बराबर (दोनों 600 आयुध डिपो और GFP कच्चे डेटा के लिए गणना) के साथ एक परख एक उत्कृष्ट परख के रूप में माना जाता है। - सूत्र का उपयोग कर विकास की% निषेध की गणना:
कहाँ शी OD600 प्रत्येक नमूने की दोहराया 600 आयुध डिपो मूल्य में भी है। % निषेध OD600> 0, विकास अवरोध; % निषेध OD600 <0, विकास के प्रमोटर। - सूत्र का उपयोग कर ग-di-जीएमपी के intracellular स्तर का% निषेध का आकलन (मनमाना प्रतिदीप्ति तीव्रता इकाइयों में परिवर्तन सेल घनत्व में बदलाव के लिए सही कर रहे हैं):
कहाँ शी GFP प्रत्येक नमूने की दोहराया GFP मूल्य में भी है। % निषेध GFP> 0, सी-di-जीएमपी अवरोध; % और# 160; निषेध GFP <0, सी-di-जीएमपी प्रमोटर। - मंझला (मंझला ± 3 पागल), गणना नमूना से से 3 पागल पर हिट का पता लगाने के लिए एक सीमा निर्धारित अच्छी तरह से, पढ़ने के बहिष्कार प्रत्येक थाली के डेटा-अंक की एक सामान्य वितरण संभालने। ध्यान दें: हालांकि, एक ± 50% निषेध कट ऑफ अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक खुराक प्रतिक्रिया assays के लिए चुना जा सकता है, यदि आवश्यक।
Representative Results
यहाँ वर्णित दृष्टिकोण कुशलता और सफलतापूर्वक एक 48 घंटे की अवधि के भीतर 3,500 यौगिकों के एक औसत स्क्रीन के लिए एक एकल शोधकर्ता अनुमति देता है। उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में एक फ़्लोचार्ट के रूप में सचित्र है। वर्तमान लेख के लिए, हम 600 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में संभावित सी-di-जीएमपी नियमन यौगिकों के लिए एक नियम-पांच अनुरूप परिसर पुस्तकालय की जांच की । हालांकि, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दवा की तरह है और यौगिक सेट है कि परख में इस्तेमाल किया जा सकता है जैसे गैर दवा कर रहे हैं। ये सेट बैक्टीरिया केंद्रित यौगिकों या यादृच्छिक जमा यौगिकों हो सकता है लेकिन प्रत्येक पुस्तकालय भौतिक गुणों और विशेषताओं जो ध्रुवीय कार्य समूहों और कई stereogenic केन्द्रों था यहां जांच सेट, के रूप में इस तरह सौंपा predicated किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल में, बैक्टीरिया के साथ यौगिकों के साथ थाली, एक एंटीबायोटिक सकारात्मक नियंत्रण और एक DMSO वाहन में inoculated हैंनियंत्रण, चित्रा 2 में दिखाया लेआउट के अनुसार। चित्रा 3 दर्शाया गया है एक पुस्तकालय की थाली द्वारा उदाहरण प्राथमिक जांच का परिणाम है। प्रतिनिधि आयुध डिपो 600 और GFP कच्चे डेटा क्रमश: चित्रा 3 ए और 3 बी में दिखाया जाता है। एक रंग ढाल गर्मी के नक्शे, गर्म (लाल) के साथ शांत करने के लिए (हरा) उच्च आयुध डिपो 600 / GFP मूल्यों के लिए कम का संकेत रंग, अच्छी तरह से मूल्यों के लिए लागू किया गया है। गर्मी नक्शे एक 3-रंग पैमाने सशर्त स्वरूपण सबसे कम आयुध डिपो से फैले लगाने से एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में उत्पन्न किया गया 600 / GFP पढ़ने के लिए बाहर उच्चतम आयुध डिपो 600 / GFP पढ़ने के लिए बाहर करने के लिए। कम 600 आयुध डिपो और GFP मूल्यों DMSO नकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष क्रमश: विकास और सी-di-जीएमपी के स्तर में एक अवरोध के अनुरूप जबकि DMSO नकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष उच्च मूल्यों के साथ क्रमश: विकास और सी-di-जीएमपी के स्तर में पदोन्नति के अनुरूप । आयुध डिपो के 600 और GFP की गिरफ्तारी के लिए मजबूत जेड 'मूल्योंई प्रोटोकॉल (5.1) में प्रदान सूत्र के अनुसार गणना की। वे ऊपर 0.5 (0.694 और 0.761 क्रमशः) दोनों कर रहे हैं के रूप में, परख गुणवत्ता मजबूत समझा था और डेटा आगे विश्लेषण किया गया था। विकास (आयुध डिपो 600) और intracellular सी-di-जीएमपी स्तर (GFP) के% निषेध प्रोटोकॉल (5.2, 5.3) में प्रदान सूत्रों द्वारा गणना कर रहे हैं। प्रतिनिधि डेटा क्रमशः चित्रा -4 ए और 4 बी में दिखाया जाता है। एक रंग ढाल गर्मी के नक्शे, गर्म (लाल) के साथ शांत करने के लिए (हरा) उच्च% निषेध करने के लिए कम का संकेत रंग, अच्छी तरह से मूल्यों के लिए लागू किया गया है। % निषेध (OD600 / GFP) प्राथमिक स्क्रीन के आधार पर अलग-अलग कुओं से की एक तितर बितर साजिश चित्रा 5 ए में प्लॉट और क्रमश: 600 आयुध डिपो और GFP डेटा के लिए 5 ब है। एक ± 50% कट-ऑफ (बिंदीदार लाइनों के साथ संकेत दिया) हिट का पता लगाने के लिए चुना जाता है। संभावित इस कट ऑफ के आधार पर हिट लाल डॉट्स के साथ संकेत कर रहे हैं। ब्याज की यौगिकों के दो प्रकार घ जा सकती हैपरख से iscerned। जबकि चित्रा 5 ब में पहचान हिट यौगिकों कि संभावित सी-di-जीएमपी के intracellular स्तर मिलाना करने की क्षमता के अधिकारी हैं चित्रा 5 ए में पहचान हिट, यौगिकों कि बैक्टीरिया विकास को बाधित कर रहे हैं। दो यौगिकों इस परख के लिए प्रतिनिधि हिट के रूप में पहचान की गई है। ये यौगिक ए, एक संभावित वृद्धि अवरोध और यौगिक बी, एक संभावित सी-di-जीएमपी अवरोध कर रहे हैं। परिसर में एक 3 आंकड़े में अच्छी तरह से F8 से मेल खाती है और 4 और विकास में 72.5% निषेध था। चक्रीय di-जीएमपी के स्तर में एक आशा की इसी निषेध था। यौगिक बी 3 आंकड़े में अच्छी तरह से K3 से मेल खाती है और 4 और विकास में कोई परिवर्तन के साथ चक्रीय di-जीएमपी के स्तर में 61% निषेध था। हिट यौगिकों का चयन करें और 2 मिमी और दो गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला के एक शीर्ष एकाग्रता के साथ एक 10 सूत्री खुराक प्रतिक्रिया परख द्वारा परीक्षण किया गया। आईसी 50 मूल्यों खुराक-प्रतिक्रिया के आधार पर गणना कर रहे हैंघटता (चित्रा 6A और बी)।
चित्रा 1. अवलोकन: उनके संभावित पी में सी-di-जीएमपी के सेलुलर स्तर मिलाना के लिए छोटे अणुओं स्क्रीनिंग के लिए उच्च throughput सेटअप aeruginosa। यह अवलोकन इस परख में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का एक कदम-दर-कदम प्रतिनिधित्व दिखाता है। पी के एक जीवाणु कॉलोनी aeruginosa एक पौंड स्टार्टर संस्कृति में रात भर उगाया जाता है। एक अभिकर्मक की मशीन का प्रयोग, कोशिकाओं से चयनित यौगिकों से युक्त 384 अच्छी तरह से प्लेटों में inoculated हैं। प्लेटों 6 घंटे, जिसके बाद 600 आयुध डिपो और GFP मूल्यों मापा जाता है के लिए incubated हैं। इन पढ़ा बहिष्कार, यौगिकों कि सी-di-जीएमपी के सेलुलर स्तर को प्रभावित पहचाना जा सकता है का उपयोग करना। एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।
। चित्रा 2. एक 384 अच्छी तरह से थाली मानचित्र छोटे अणु परख स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल पुस्तकालय (हल्का नीला) से यौगिकों कुओं A1 में aliquoted कर रहे हैं - P22। "सकारात्मक नियंत्रण" (लाल) 50 माइक्रोग्राम / एमएल tobramycin सल्फेट कुओं A23 में जोड़ा जाता है के अंतिम एकाग्रता से मिलकर - p23 और "नकारात्मक नियंत्रण" (हरे) 1% DMSO कुओं A24 में जोड़ा जाता है के अंतिम एकाग्रता युक्त - P24। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. एक 384 अच्छी तरह से स्क्रीनिंग थाली के लिए प्रतिनिधि परिणाम है। आरepresentative कच्चे डेटा आयुध डिपो 600 (ए) और GFP (बी) के लिए है। एक रंग ढाल गर्मी के नक्शे, गर्म के साथ (लाल: आयुध डिपो के 600 = 0.65 या GFP = 250000) शांत करने के लिए (ग्रीन: आयुध डिपो के 600 = 0.10 या GFP = 40000) उच्च मूल्यों के लिए कम का संकेत रंग, अच्छी तरह से मूल्यों के लिए लागू किया गया है। वेल्स है कि DMSO नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए कम 600 आयुध डिपो / GFP रीडिंग रिश्तेदार जबकि कुओं उच्च आयुध डिपो 600 / GFP रीडिंग DMSO के नियंत्रण के सापेक्ष है कि हरे रंग में हो जाते हैं जाएगा लाल रंग में हो जाते हैं जाएगा। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।
चित्रा 4 प्रतिशत निषेध एक 384 अच्छी तरह से थाली के लिए गणना के लिए प्रतिनिधि परिणाम है। विश्लेषण किया% निषेध डेटा आयुध डिपो 60 दोनों के लिए प्रतिनिधित्व किया है0 (ए) और GFP (बी) को पढ़ने के बहिष्कार। एक रंग ढाल गर्मी के नक्शे, गर्म के साथ (लाल: आयुध डिपो के 600 = -150% या GFP = -20%) (ग्रीन: आयुध डिपो के 600 = 100% या GFP = 100%) शांत करने के लिए रंग उच्च निषेध मूल्यों को कम संकेत किया गया है अच्छी तरह से मूल्यों के लिए आवेदन किया। छोटे अणुओं, जो संभावित विकास और intracellular बाधित सी-di-जीएमपी हरे रंग में होना करने के लिए, जबकि छोटे अणुओं जो संभावित विकास और intracellular सी-di-जीएमपी के स्तर को बढ़ावा देने के लिए लाल रंग में हो जाते हैं जाएगा करते हैं जाएगा। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।
चित्रा 5.% निषेध (OD600 / GFP) प्रत्येक परीक्षण छोटे अणु। प्रत्येक छोटे अणु से प्राप्त की प्रतिनिधि तितर बितर भूखंडों एक बिंदी और% निषेध वितरण का प्रतिनिधित्व करती हैआयुध डिपो के 600 (ए) और GFP (बी) में से प्रत्येक के लिए पढ़ने के बहिष्कार दिखाया गया है। एक ± 50% कट ऑफ हिट पहचान के लिए चयन किया जाता है। संभावित हिट लाल रंग में डाला जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6. एक खुराक से प्रतिनिधि परिणाम -। रिस्पांस परख दो यौगिकों (संभावित वृद्धि अवरोध करनेवाला एक और संभावित सी-di-जीएमपी अवरोध बी) पिछले स्क्रीन से पहचान और 2 के एक शीर्ष एकाग्रता के साथ एक 10 बिंदु खुराक प्रतिक्रिया परख में परीक्षण कर रहे हैं मिमी और दो गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला। क्रमशः डेटा के लिए एक चार पैरामीटर रसद समारोह फिटिंग झुकेंगे 158 सुक्ष्ममापी और 193 सुक्ष्ममापी के आईसी 50 मूल्यों। मिसालएएसई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
जीवाणु संक्रमण के उपचार में सुधार करने के लिए, यह स्पष्ट है कि आणविक विनियामक स्तर पर बैक्टीरियल व्यवहार का एक बेहतर समझ की आवश्यकता है। प्रक्रिया यहाँ वर्णित सूक्ष्म जीव विज्ञानियों, जीव रसायन और चिकित्सकों जो छोटे अणुओं संभावित हेरफेर या बैक्टीरिया में सी-di-जीएमपी के सेलुलर सांद्रता के साथ हस्तक्षेप करने के लिए है कि उजागर करने के लिए चाहते हैं के लिए फायदेमंद होगा। विधि पी में सी-di-जीएमपी के सेलुलर स्तर पर नजर रखने के लिए एक हाल ही में विकसित GFP bioreporter का इस्तेमाल aeruginosa 12। इस bioreporter मान्य किया गया है और दिखाया महत्वपूर्ण बात जब सुसंस्कृत पीबीएस में 5% पौंड में इस्तेमाल किया तनाव के विकास को प्रभावित करने के लिए नहीं। कि इन विवो में सी-di-जीएमपी के स्तर को बदल छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए एक पूरे सेल स्क्रीन का उपयोग बैक्टीरियल झिल्ली के माध्यम से अणु प्रवेश के मामले में लक्ष्य के आधार पर दवाओं की खोज की बड़ी कठिनाइयों पर काबू पा, विशेष रूप से ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के उन लोगों के माध्यम से । महत्वपूर्ण बात है, टीवह परख एक मजबूत जेड 'मूल्य लगातार ऊपर 0.5 तिथि करने के लिए सभी स्क्रीन में मनाया गया था के रूप में बहुत मजबूत दिखाई देता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग छोटे अणुओं है कि रोकना और / या पी में intracellular सी-di-जीएमपी के स्तर को बढ़ावा देने के एक नंबर खोलेगा स्क्रीनिंग aeruginosa। इसके अलावा, इस परख भी जीवाणुनाशक या बैक्टीरियोस्टेटिक 600 आयुध डिपो पढ़ने के लिए बाहर में कमी के परिणामस्वरूप यौगिकों की पहचान करने की क्षमता है।
हालांकि प्रोटोकॉल खंड में चर्चा नहीं, वहाँ प्रयोग की तैयारी के लिए कई महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं। यह ध्यान रखें कि GFP bioreporter एक प्लाज्मिड पर आधारित है में सहन करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि संवाददाता प्लाज्मिड पी में बहुत ही स्थिर हो जाता है aeruginosa, यह डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से एक -80 हौसले चढ़ाया उपभेदों उपयोग करने की आवश्यकता निरंतर फिर से चढ़ाना के बाद खो जा सकता है, इसलिए, और प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति की जाँच के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी स्क्रीन भर में एक समान विकास की स्थिति बनाए रखने के लिए बहुत मूल्यवान हैके बाद से इन शर्तों में किसी भी उतार-चढ़ाव तोड़े पर स्क्रीन पर प्रभाव पड़ सकता है। यह निश्चित है कि मीडिया और एंटीबायोटिक दवाओं के बैच में premade और स्क्रीन के पाठ्यक्रम में इस्तेमाल कर रहे हैं को शामिल किया जाएगा। बैक्टीरियल संस्कृतियों नहीं बढ़ रहा एक समान फैशन में (600 आयुध डिपो को पढ़ने के बहिष्कार के आधार पर) इस प्रकृति के सबसे उच्च throughput स्क्रीन के लिए एक आम समस्या है। यह प्रभाव या प्लेटों में एक गैर सजातीय जीवाणु संस्कृति वितरण बढ़त की वजह से हो सकता है। पूर्व के लिए, सुनिश्चित बनाने के लिए एक गैस पारगम्य मुहर ऊष्मायन के दौरान प्रयोग किया जाता है महत्वपूर्ण है। जबकि बाद के लिए, संस्कृति का एक मात्रा के साथ तरल हैंडलर ट्यूबिंग भड़काना कम से कम तीन बार ट्यूबिंग के ही मृत मात्रा की सिफारिश की है। यह वितरण के दौरान कम से कम गति पर चुंबकीय उत्तेजक रखने के लिए महत्वपूर्ण है। निगरानी और प्रयोगों के पाठ्यक्रम पर लगातार विकास के लिए 384 अच्छी तरह से प्लेटों के भंडारण के लिए सर्वोपरि है, वहीं एक ऐसी स्थिति से बचने के लिए ऊष्मायन के दौरान प्लेटों की स्टैकिंग के रूप में यह संयुक्त राष्ट्र का कारण बन सकता हैऑक्सीजन विकास पैटर्न में एक तिरछा करने के लिए अग्रणी ढ़ाल चाहता था। यह भी सुनिश्चित करना है कि एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया DMSO वाहन नकारात्मक ब्याज के तनाव के विकास को प्रभावित नहीं है महत्वपूर्ण है। विकास के साथ जुड़े इन मुद्दों के कई ब्याज स्क्रीनिंग से पहले की बैक्टीरियल तनाव के साथ एक नकली स्क्रीन प्रदर्शन से बचा जा सकता है। डेटा व्याख्या भी गुण ध्यान दिया है कि सी-di-जीएमपी निषेध परिणाम मनमाना प्रतिदीप्ति तीव्रता इकाइयों में परिवर्तन है कि सेल घनत्व में बदलाव के लिए सही किया जाना चाहिए द्वारा गणना कर रहे हैं। इसे ध्यान में रखते अलग गणितीय सूत्र इन प्रयोगों से डेटा उत्पादन भी विचार किया जाना चाहिए आकलन करने के लिए। उदाहरण के लिए, एक यौगिक एक सी-di-जीएमपी अवरोध के रूप में प्रकट हो सकते हैं, लेकिन वास्तव में, एक विकास अवरोध या ठीक इसके विपरीत हो पहचान हिट की विवेकपूर्ण व्याख्या की आवश्यकता होती है।
वहाँ कई कमियां और सीमाओं कि विकास और इस के प्रदर्शन के दौरान विचार किया जाना चाहिएउच्च throughput सेल आधारित स्क्रीन। उदाहरण के लिए, एक फ्लोरोसेंट जांच जिसका पता लगाने के गुण संभावित छोटी एक स्क्रीन में इस्तेमाल अणुओं से प्रभावित हो सकता का उपयोग कर सेलुलर सी-di-जीएमपी स्तरों के एक अप्रत्यक्ष उपाय पर जैव रिपोर्टर कार्य करता है। एक स्पर्शरेखा मुद्दा यह है कि सेल आधारित परख intracellular सी-di-जीएमपी के स्तर में परिवर्तन के पीछे तंत्र के बारे में कोई जानकारी नहीं देता है। इसलिए, प्रयोगों से महत्वपूर्ण टिप्पणियों में एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण है, जो बैक्टीरिया में intracellular सी-di-जीएमपी के उतार चढ़ाव को मापने के लिए 'सोने के मानक "तरीका माना जाता है का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए। इसके अलावा, हमारी प्रक्रिया ही है, इन विट्रो में उगाया बैक्टीरिया के व्यवहार के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं के रूप में बैक्टीरियल कोशिकाओं मेजबान के संदर्भ में उगाया (विवो में) जल्दी से इस माहौल के कारण उनकी गतिविधियों को संशोधित। इसके अलावा, एक GFP bioreporter उपयोग करने की प्रक्रिया का मतलब स्क्रीन नहीं ले करता हैखाते में बैक्टीरियल कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति। हालांकि, प्रोटोकॉल स्क्रीन के दौरान अलग-अलग कुओं की सूक्ष्म निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
यहां तक कि इन विचारों और सीमाओं के साथ, इस उच्च throughput परख अभी भी छोटे intracellular सी-di-जीएमपी के स्तर के साथ हस्तक्षेप करने में सक्षम अणुओं के लिए एक मजबूत स्क्रीन है। के बाद से कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों सहित कई सूक्ष्म जीवाणु प्रजातियों आदेश intracellular सी-di-जीएमपी स्तरों के मॉडुलन को चिह्नित करने में अध्ययन किया गया है, हमारे प्रोटोकॉल विविध प्रजातियों के जीवाणु के लिए आवेदन किया है और अधिक जटिल multispecies बैक्टीरिया मॉडल का अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। परख आसानी से बदल रहा है विकास की स्थिति का इस्तेमाल किया, या अलग bioreporters का उपयोग करके अन्य outputs पढ़ने के लिए अनुकूलित किया जा सकता द्वारा अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता। विभिन्न ऊष्मायन बार ब्याज के विकास के चरण के आधार पर लागू किया जा सकता है। हालांकि, जब तक स्केलिंग या माध्यम से रखा बढ़ रही है, यह importan है टी ध्यान रखें कि बैक्टीरिया अभी भी प्लेट की तैयारियाँ और पढ़ने के लिए बाहर माप के दौरान बढ़ जाएगा में रखने के लिए। इसलिए यह एक समय इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने पर 15 प्लेटों की एक अधिकतम स्क्रीन करने के लिए सिफारिश की है। इसके अलावा, अधिक से अधिक 384 कुओं के साथ प्लेट का उपयोग कर आगे अनुकूलन की आवश्यकता के समान विकास की अनुमति नहीं हो सकता है। जब प्लेटों की संख्या नीचे स्केलिंग, यह स्वयं के बजाय एक इलेक्ट्रॉनिक पिपेट एक तरल से निपटने रोबोट का उपयोग करने के लिए टीका लगाना अधिक उपयुक्त हो सकता है। यह स्पष्ट है कि इस प्रोटोकॉल, यह देखते हुए कि विरोधी biofilm यौगिकों सी-di-जीएमपी संकेतन के साथ हस्तक्षेप छोटे अणुओं है कि biofilms फैलाने जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल भी जीवाणु शरीर क्रिया विज्ञान के विभिन्न पहलुओं को समझने के लिए पुनर्विकसित किया जा सकता है। यह देखते हुए कि सी-di-जीएमपी संकेतन इस प्रोटोकॉल का उपयोग हम निर्धारित किया जाए या नहीं उनके काम तंत्र सी-di-जीएमपी सिगनल की आवश्यकता होती है विभिन्न रासायनिक उत्तेजनाओं की पहचान कर सकते हैं इन जीवों की physiologies का अध्ययन करके, सबसे बैक्टीरिया में प्रचलित है।
_content "> सारांश में, मजबूती और दृष्टिकोण की चंचलता इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सी-di-जीएमपी कई जैविक प्रणालियों में संकेत के रासायनिक modulators की पहचान सहायता करेगा।Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG | |
| Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG | |
| Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 | |
| Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML | |
| Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 | |
| 2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 | |
| BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 | |
| Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA | |
| 384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 | |
| VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 | |
| 100 ml sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 | |
| AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 | |
| Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |
References
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