Summary
En este artículo se describe el ensayo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para examinar grandes bibliotecas de moléculas pequeñas por su potencial capacidad para manipular los niveles celulares de cíclico di-GMP en Pseudomonas aeruginosa, que proporciona una nueva y poderosa herramienta para el descubrimiento de fármacos antibacterianos y ensayar los compuestos.
Abstract
La resistencia bacteriana a los antibióticos tradicionales ha impulsado los intentos de investigación para identificar nuevas dianas farmacológicas en las vías de regulación recientemente descubiertos. Los sistemas de regulación que utilizan intracelular di-GMP cíclico (c-di-GMP) como un segundo mensajero son una de esas clase de objetivo. c-di-GMP es una molécula de señalización se encuentra en casi todas las bacterias que actúa para regular una amplia gama de procesos incluyendo resistencia a los antibióticos, la formación de biopelículas y la virulencia. La comprensión de cómo c-di-GMP de señalización controla los aspectos del desarrollo de biopelículas resistentes a los antibióticos ha sugerido enfoques con lo que la alteración de las concentraciones celulares de los nucleótidos o la interrupción de estas vías de señalización puede conducir a la formación de biopelículas reducida o aumento de la susceptibilidad de los biofilms a los antibióticos. Se describe un protocolo simple de alto rendimiento bioinformador, basado en la proteína verde fluorescente (GFP), cuya expresión está bajo el control del promotor sensible a c-di-GMP cdra, Para cribar rápidamente para pequeñas moléculas con el potencial para modular los niveles celulares de c-di-GMP en Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Este sencillo protocolo puede detectar más de 3.500 compuestos dentro de las 48 horas y tiene la capacidad de adaptarse a múltiples microorganismos.
Introduction
El rápido desarrollo de la resistencia bacteriana a los antibióticos clínicamente importantes es uno de los principales problemas que enfrenta actualmente profesionales de la salud en todo el mundo. Este fracaso de los antibióticos tradicionales ha llevado a nuevas búsquedas de materia química que puede interferir con los procesos bacterianos implicados en la virulencia y la progresión de la enfermedad 1. Un sistema de este tipo de regulación que utiliza el intracelular segundo mensajero cíclico di-GMP (c-di-GMP) se ha convertido recientemente un objetivo con validez prometedor 2-4. Se ha establecido que esta segunda molécula de señal mensajero mundial regula muchas funciones incluyendo resistencia a los antibióticos, la adhesión, la formación de biopelículas y la enfermedad 2-4.
Ahora se entiende que el nivel celular de c-di-GMP en la célula bacteriana es controlado por la síntesis y la degradación por el que se utilizan dos moléculas de GTP para sintetizar c-di-GMP por ciclasas diguanylate que contienen el dominio wh GGDEF (PED)ereas degradación c-di-GMP está catalizada por las fosfodiesterasas (PDE) que tienen ya sea un EAL o un dominio de HD-GYP (revisado en (3, 5)). Las proteínas que contienen estos dominios a menudo contienen otros dominios de señalización, lo que sugiere que su actividad en la facturación c-di-GMP se regula directa o indirectamente por señales ambientales o celulares 3,5. En consecuencia, c-di-GMP señalización funciones de vincular la detección de diversas señales ambientales a las modificaciones en el fenotipo bacteriano. c-di-GMP ejerce su efecto regulador en las bacterias a nivel de la transcripción, post-transcripción y post-traducción por diversos mecanismos 4.
Una importante influencia de c-di-GMP en muchas células bacterianas es en la determinación de bacterias "estilo de vida" y, en particular, en el control de las transiciones entre las células planctónicas móviles y células sésiles unidos a superficies u organizados en las estructuras multicelulares de biofilms 3,5. En general, alta celularlos niveles de c-di-GMP se asocian con la formación de biopelículas y sessility, mientras que bajos niveles celulares estimulan la motilidad y la síntesis de factor de virulencia en muchos patógenos bacterianos 3,5. Por lo tanto, un conocimiento más detallado del funcionamiento de la señalización de c-di-GMP podía permitirse estrategias para la inhibición de la formación de biopelículas y la virulencia de patógenos bacterianos. Esta es una tarea de enormes proporciones dada que la mayoría de los genomas de bacterias codifican proteínas con numerosos GGDEF, EAL y / o dominios HD-GYP (por ejemplo, P. aeruginosa tiene más de 40 proteínas) y múltiples efectores 6,7.
Sin embargo, incluso con esta complejidad, la evidencia reciente sugiere que las estrategias de la manipulación de la señalización de c-di-GMP se pueden desarrollar ya sea para prevenir las infecciones resistentes a los antibióticos en desarrollo o los hacen susceptibles al sistema inmune o tratamiento eficaz por la co-administración de antibióticos clásicos 2. En línea con esto, se ha demostrado experimentalmente que la disminución artificialintracelular de c-di-GMP en in vitro -grown P. aeruginosa produce una disminución de la formación de biopelículas y el aumento de la susceptibilidad a los antibióticos, mientras que P. biofilms aeruginosa -desarrollado en los implantes de silicona, que se encuentra en la cavidad peritoneal de los ratones, se pueden dispersar en una manera similar 8-11.
A continuación, describimos un alto rendimiento, reportero de ensayo basado en la fluorescencia para detectar pequeñas moléculas que potencialmente pueden modular los niveles de c-di-GMP celulares en P. aeruginosa (Figura 1). El ensayo se basa en la medición de c-di-GMP niveles celulares utilizando un reportero GFP previamente desarrollado cuya expresión está transcripcionalmente unido al promotor cdra c-di-GMP-sensible 12. Este protocolo describe la metodología para la expresión del constructo indicador en el P. aeruginosa cepa de interés, preparación de placa de compuesto, la inoculación de cultivo en placas de 384 pocillos, las condiciones de crecimiento, como hemosll como detalles con respecto a la recopilación de datos, la gestión y el análisis (Figura 1). En general, este protocolo ayudará a los investigadores a identificar potencialmente nuevos compuestos de orientación c-di-GMP de señalización en las bacterias, y para su uso en investigación dirigidas a la comprensión de la biología de P. aeruginosa.
Protocol
Nota: Los procedimientos para la clonación y la transformación del plásmido reportero de c-di-GMP purificada se discuten en otra parte 12.
1. Generación de GFP Etiquetado c-di-GMP Reportero P. La cepa aeruginosa
- Inocular 5 ml de caldo de lysogeny (LB) con una única colonia de P. aeruginosa e incubar durante la noche a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
- Transferencia de 2 ml de cultivo de una noche en 200 ml de medio LB fresco en un matraz de 1 L y se incuba a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
- Monitor de densidad óptica a 600 nm (OD 600) cada 30 min tomando una muestra de 1 ml del matraz y examinar utilizando un espectrofotómetro (como se describió anteriormente 12).
- Cuando el OD 600 alcanza entre 0,3 a 0,5, coloque 40 ml del cultivo en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml.
- Sedimentar las células por centrifugación a 8000 rpm durante 10 min a 4 ° C, descartar el sobrenadante y re-suspender las células en 40 ml de solución enfriada con hielo, estéril, 300 mM de sacarosa.
- Sedimentar las células una segunda vez mediante centrifugación tal como se describe en el paso 1.5 y volver a suspender en 20 ml de solución enfriada con hielo, estéril, 300 mM de sacarosa.
- Sedimentar las células una última vez por centrifugación como se describe en el paso 1.5 y volver a suspender en 400 l de solución enfriada con hielo, estéril, 300 mM de sacarosa.
Nota: La densidad de las células en este punto debe ser unidades formadoras de aproximadamente 1 x 10 11 colonias por mililitro (CFU / ml). - Chill las células en hielo durante 30 min, después de lo cual están listos para la electroporación.
- Añadir 1 l de una solución plásmido pCdrA :: GFP C / l 0,2 mg de 12 a 40 l de P. células electro-competentes aeruginosa preparado anteriormente en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que ha sido pre-enfriado en hielo. Mezclar la suspensión y transferir en un pre-refrigerado, 2 mm la distancia entre electrodos, cubeta de electroporación.
Nota: pCdrA :: GFP C: GFP pUCP22Not-P cdra -RBSII- (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r Gm r, lo que da una lectura fluorescente del nivel intracelular de c-di-GMP en P. aeruginosa cepas, fue desarrollado y validado por Rybtke et al. 12. - Eliminar la humedad en el exterior de la cubeta con papel de seda y colocar la cubeta en la cámara de muestra del electroporador. De impulsos con un voltaje de 2,5 kV, la capacitancia de 25 mF y la resistencia de 200 Ω.
- Retire la cubeta y añada 1 ml de medio LB. A continuación, transferir las células a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y se incuba durante 2 horas a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
- Spread 10 l, 50 l y 100 ml de alícuotas del cultivo en placas LB-agar estéril suplementado con ampicilina (a una concentración de 100 mg / ml), y se incuban las placas a 37 ° C durante la noche.
- Confirmar la expresión de GFP (excitatien a 485 nm, emisión a 520 nm) mediante el examen de la placa bajo un microscopio de fluorescencia con un canal de GFP estándar y recoger una sola colonia para inocular 5 ml LB. Incubar toda la noche como se describe en el paso 1.1. Mezclar 0,5 ml del cultivo de una noche con 0,5 ml de glicerol al 50% en unos 2 ml tornillo tubo superior y se almacena a -80 ° C.
2. Preparación del cultivo iniciador para la inoculación
- Dos días antes de la pantalla, la placa de la P. cepa aeruginosa (que contiene el plásmido pCdrA :: gfp C) a partir de la -80 ° C de stock en una placa de LB-agar (suplementado con ampicilina a una concentración de 100 mg / ml) mediante la difusión de las bacterias suavemente sobre la placa utilizando una inoculación estéril lazo. Se incuba la placa durante la noche a 37 ° C.
- La noche antes de la proyección, inocula una sola colonia de P. aeruginosa de la placa en 10 ml de medio LB (suplementado con ampicilina a una concentración de 100 mg / ml) en un tuser y se incuba durante la noche el precultivo a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
- En el día de la pantalla, preparar un subcultivo de la pre-cultivo de una noche diluyéndola primero con medio LB fresco hasta una DO 600 de 1,0 y luego diluir adicionalmente con 5% LB hasta una DO 600 de (relación 01:25) 0,04 .
Nota: El volumen total del medio inoculado depende del número de placas a ensayar. 5% LB se hace mediante la dilución de 100% LB con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración requerida. Es importante destacar que, los medios de comunicación (5% LB) permite la activación constitutiva de pCdrA :: gfp C en P. aeruginosa. - Añadir una barra de agitación magnética estéril en el recipiente y se agita la cultura a la velocidad mínima en un agitador magnético durante 30 min a temperatura ambiente, permitiendo que las bacterias se aclimate a los medios de comunicación antes de que se dispensan en placas de 384 pocillos.
3. Inoculación e incubación de las placas de 384 pocillos que contienenpequeñas moléculas
Nota: Esterilidad y buenas técnicas asépticas son de suma importancia para los siguientes pasos.
- Para preparar el control positivo (100% de inhibición), añadir 20 l de tobramicina sulfato (25 mg / ml) a 10 ml (adecuado para un máximo de 12 placas) del subcultivo preparado en el Paso 2.3 y mezclar suavemente. Pipeta de 40 l de la cultura de control positivo en los pocillos A23 - P23 (Figura 2).
- Para preparar el control negativo (0% de inhibición), añadir 30 l de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 ml (adecuado para un máximo de 12 placas) de la subcultura preparado en el Paso 2.3 y mezclar suavemente. Pipeta de 40 l de la cultura de control negativo en los pocillos A24 - P24 (Figura 2).
- Para cada una de las placas estampadas con las pequeñas moléculas, inocular un volumen de 40 l de los cultivos de una noche diluidas (descritos en la etapa 2.3) en los pocillos A1 - P22 (Figura 2).
Nota: Esto se puede lograr usando un manipulador de líquidos robAntiguo Testamento. Debido a las propiedades heterogéneas de cultivos de bacterias, es importante para mantener una agitación continua y de moderada a mantener las bacterias distribuidos sistemáticamente en los medios de comunicación, mientras que la dispensación. Para ello, sin dejar de remover la cultura aclimatadas desde el paso 2.4 magnéticamente durante la dispensación. - Sellar las placas con un sello de la cubierta permeable al aire y se incuba durante 6 horas a 37 ° C.
Nota: El sello permeable al aire es crítica para mantener las condiciones invariables a través de los 384 pozos y para evitar el posible desarrollo de gradientes de oxígeno a través de la placa.
4. Medición de crecimiento (OD 600) e intracelular Nivel GMP c-di-(GFP)
- Aproximadamente 30 minutos antes de la medición espectrofotométrica, pre-calentar el lector de placas a 37 ° C para evitar la condensación.
- Retire con cuidado el sello de la cubierta permeable al aire antes de la lectura. Se mide la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm con un calado de 10 parpadeos por bien yun tiempo de estabilización de 0,2 seg.
- Antes de medir la fluorescencia, hacer una ganancia automático y el ajuste focal basado en bien A24 (control negativo) y establecer el valor objetivo de ganancia en un 75% (Figura 2).
- Desde el software de control de lector de placas, haga clic en la medición de inicio y haga clic en el '' Focus y los ID / placa de ajuste de ganancia 'ficha'.
- Seleccionar '' Ajuste de foco '' y '' Canal A '' a la derecha de la ventana.
- Seleccionar '' Ajuste de ganancia '' y '' Selected así '', y el tipo de '' 75 '' como '' Valor objetivo ''. Por último, elegir bien A24 en el diseño de la placa antes de hacer clic en '' iniciar el ajuste ''. Una vez que el ajuste se lleva a cabo, haga clic en '' para iniciar la medición ''.
- Medir la fluorescencia de la GFP reportero en una máximos de excitación / emisión de 485/520 nm con un calado de 10 parpadeos por pozo y una settlitiempo ng de 0,2 seg.
- Recopilar datos de todas las placas examinadas. Nota: Las lecturas de datos se guardan automáticamente como predeterminado por el software de control de lector de placas.
- Ver lecturas haciendo clic en el icono de "Marte" dentro del software de control para abrir el paquete de análisis estadístico.
- Recuperar datos de "doble clic" en el número de placa de interés para acceder a los datos para el análisis.
Análisis 5. Datos
- Evaluar la uniformidad y reproducibilidad del ensayo utilizando un análisis sólido z ', que es la métrica de calidad más comunes reportados para pantallas de alto rendimiento. Calcular z robusta 'utilizando la fórmula:
Cuando MAD (Median absoluto de desviación) es una estimación de la desviación estándar, p es el control positivo (100% de inhibición) y n es el control negativo (0% de inhibición) para los dos OD 600 y GFP valores. Nota: Un ensayo con un "valor z robusta (calculado para tanto OD 600 y GFP de datos en bruto) mayor que o igual a 0,5 se considera como un excelente ensayo. - Calcular el% de inhibición del crecimiento utilizando la fórmula:
Donde Xi es la DO600 iterada valor de DO 600 de cada pocillo de muestra. % De inhibición OD600> 0, inhibidor del crecimiento; % De inhibición OD600 <0, promotor de crecimiento. - Evaluar el% de inhibición del nivel intracelular de c-di-GMP mediante la fórmula (el cambio en unidades de intensidad de fluorescencia arbitraria se corrigen para el cambio en la densidad celular):
Donde Xi es el valor de GFP GFP iterativa de cada pocillo de muestra. % De inhibición GFP> 0, inhibidor de c-di-GMP; % y# 160; Inhibición GFP <0, el promotor c-di-GMP. - Establecer un umbral para la detección de colisiones a las 3 MAD de la mediana (mediana ± 3 MAD), calculado a partir de la muestra así leer-outs de cada placa, asumiendo una distribución normal de los puntos de datos. Nota: Sin embargo, un ± 50% de inhibición de corte puede ser seleccionado para los ensayos de respuesta a la dosis más reproducibles y precisos si es necesario.
Representative Results
El método descrito aquí permite que un solo investigador para detectar de manera eficiente y con éxito un promedio de 3.500 compuestos dentro de un período de 48 horas. Una visión general del protocolo de cribado de alto rendimiento se ilustra como un diagrama de flujo en la Figura 1. Para el artículo actual, que exhibió una colección de compuestos que cumplen la regla de cinco juegos de potenciales compuestos moduladores de c-di-GMP a una concentración final de 600 mM . Sin embargo, hay muchos disponibles comercialmente con las drogas como y no droga como conjuntos de compuestos que podrían ser utilizados en el ensayo. Estos conjuntos pueden ser compuestos de bacterias se centraron o compuestos agrupados al azar, pero cada biblioteca habrían predicado propiedades físico-químicas y características asignadas, tales como el conjunto proyectado aquí, que tenía grupos funcionales polares y múltiples centros estereogénicos. En este protocolo, las bacterias se inoculan en la placa junto con compuestos, un control positivo antibiótico y un vehículo DMSOcontrol, de acuerdo con la disposición mostrada en la Figura 2. La Figura 3 representa los resultados de la criba primaria ejemplificado por una sola placa de biblioteca. OD Representante 600 y los datos en bruto GFP se muestran en la Figura 3A y 3B, respectivamente. Un mapa de calor degradado de color, con agua caliente (rojo) se enfríe (verde) colores que indican menor a mayor OD 600 valores / GFP, se ha aplicado a los valores así. Los mapas de calor se generaron en una hoja de cálculo mediante la aplicación de una escala de 3 colores formato condicional que abarca desde el más bajo OD 600 / GFP lectura de hasta el más alto OD 600 / GFP de lectura. Low OD 600 y GFP valores relativos al control negativo DMSO corresponden a una inhibición en el crecimiento y los niveles de c-di-GMP, respectivamente, mientras que los valores altos en relación con el control negativo DMSO corresponden a una promoción en el crecimiento y los niveles de c-di-GMP, respectivamente . La robusta valores z 'para OD 600 y ar GFPe calculado de acuerdo con la fórmula proporcionada en el protocolo (5.1). Como los dos son por encima de 0,5 (0,694 y 0,761, respectivamente), la calidad del ensayo se consideró robusto y se analizó adicionalmente los datos. El% de inhibición del crecimiento (OD 600) y el nivel de c-di-GMP intracelular (GFP) se calculan mediante las fórmulas previstas en el protocolo (5.2, 5.3). Los datos representativos se muestran en la Figura 4A y 4B, respectivamente. Un mapa de calor degradado de color, con agua caliente (rojo) se enfríe (verde) colores que indican baja a la inhibición alto%, se ha aplicado a los valores así. Un diagrama de dispersión del% de inhibición (DO 600 / GFP) de los pozos individuales basados en la pantalla principal se representa en la figura 5A y 5B para OD 600 y los datos de GFP, respectivamente. Un corte de ± 50% (indicado con líneas de puntos) se selecciona para la detección de colisiones. éxitos potenciales con base en esta línea de corte se indican con puntos rojos. Dos tipos de compuestos de interés pueden ser Discerned del ensayo. Golpea identificados en la Figura 5A son compuestos que inhiben el crecimiento bacteriano, mientras que los accesos identificados en la Figura 5B son compuestos que potencialmente poseen la capacidad de modular los niveles intracelulares de c-di-GMP. Dos compuestos han sido identificados como éxitos representativos de este ensayo. Estos son el compuesto A, un potencial inhibidor del crecimiento y el compuesto B, un potencial inhibidor de c-di-GMP. El compuesto A corresponde a F8 bien en las figuras 3 y 4 y tenía una inhibición 72,5% en el crecimiento. Hubo una inhibición correspondiente esperado en los niveles de di-GMP cíclico. Compuesto B corresponde a K3 bien en las figuras 3 y 4 y tenía una inhibición del 61% en los niveles de di-GMP cíclico sin cambio en el crecimiento. Los compuestos seleccionados de golpe se ensayaron adicionalmente mediante un ensayo de dosis-respuesta de 10 puntos con una concentración superior de 2 mM y series de dilución doble. Los valores de IC50 se calculan en función de la dosis-respuestacurvas (Figura 6A y B).
Figura 1. Introducción: Configuración de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas por su potencial para modular los niveles celulares de c-di-GMP en P. aeruginosa. Esta visión general muestra una representación paso a paso del protocolo utilizado en este ensayo. Una colonia bacteriana de P. aeruginosa se desarrolló durante la noche en un cultivo iniciador LB. El uso de un dispensador de reactivos, las células se inoculan en placas de 384 pocillos que contienen los compuestos seleccionados. Las placas se incuban durante 6 horas, después de lo cual se miden los valores de OD 600 y GFP. El uso de estos-outs leído, compuestos que afectan a los niveles celulares de c-di-GMP se pueden identificar. Haga clic aquí para ver unaversión más grande de esta figura.
. Figura 2. Un mapa de la placa de 384 pocillos usados para la detección de moléculas pequeñas Ensayo Los compuestos de la biblioteca (azul claro) se dividió en alícuotas en pocillos A1 - P22. El "control positivo" (rojo) que consiste en una concentración final de 50 g se añade / sulfato de tobramicina ml a los pocillos A23 - P23 y el "control negativo" (verde) que contiene una concentración final de se añade DMSO a los pocillos A24 1% - P24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los resultados representativos para una placa de 384 pocillos de cribado. Rdatos en bruto representativa es para OD 600 (A) y GFP (B). Un mapa de calor degradado de color, con agua caliente (rojo: DO 600 = 0,65 o GFP = 250.000) se enfríe (verde: DO 600 = 0,10 o GFP = 40.000) colores que indican valores bajos a altos, se ha aplicado a los valores así. Los pozos que tienen menor OD 600 / GFP lecturas en relación con el control negativo de DMSO tenderán a ser de color rojo mientras que los pozos que tienen lecturas de DO 600 / GFP más altos en relación con el control de DMSO tenderán a ser de color verde. Haga clic aquí para ver una más grande versión de esta figura.
Figura 4. Los resultados representativos para la inhibición porcentaje calculado para una placa de 384 pocillos. Los datos analizados% de inhibición se representa por tanto de las DO 600 (A) y GFP (B) leer-outs. Un mapa de degradado de color de calor, con agua caliente (rojo: DO 600 = -150% o GFP = -20%) se enfríe (verde: DO 600 = 100% o 100% = GFP) colores que indica valores bajos a altos de inhibición, ha sido aplicada a los valores así. Pequeñas moléculas, que potencialmente inhiben el crecimiento y la intracelular de c-di-GMP tenderán a ser de color verde, mientras que las pequeñas moléculas que potencialmente promueven el crecimiento y los niveles de c-di-GMP intracelulares tenderán a ser de color rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 5. Diagramas de dispersión representativos para el% de inhibición (DO 600 / GFP) obtenidos de cada molécula pequeña. Cada molécula pequeña Probado está representado por un punto y la distribución% de inhibiciónpara cada uno de la OD 600 (A) y GFP (B) se muestra outs lectura. Un ± 50% de corte se selecciona para la identificación exitosa. Éxitos potenciales están resaltados en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Los resultados representativos partir de una dosis. - Ensayo de respuesta de dos compuestos (potencial inhibidor del crecimiento de A y potencial c-di-GMP inhibidor B) identificados a partir de las pantallas anteriores se ensayaron adicionalmente en un ensayo de dosis-respuesta de 10 puntos con una concentración superior de 2 mM y series de dilución doble. El montaje de una función logística de cuatro parámetros a los datos resultantes de los valores de IC50 de 158 M y 193 M, respectivamente. Please clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Con el fin de mejorar el tratamiento de infecciones bacterianas, es evidente que se requiere una mejor comprensión del comportamiento bacteriana en el nivel de regulación molecular. El procedimiento descrito aquí será beneficioso para los microbiólogos, bioquímicos y clínicos que quieren descubrir moléculas pequeñas que tienen el potencial para manipular o interferir con concentraciones celulares de c-di-GMP en bacterias. El método utiliza un bioinformador GFP recientemente desarrollado para controlar los niveles celulares de c-di-GMP en P. 12 aeruginosa. Este bioinformador ha sido validado y se muestra importante para no afectar el crecimiento de la cepa utilizada cuando se cultivan en 5% LB en PBS. El uso de una pantalla de célula entera para identificar moléculas pequeñas que altera los niveles de c-di-GMP in vivo supera las principales dificultades de descubrimiento de fármacos a base de objetivo en términos de penetración de molécula a través de las membranas bacterianas, en particular a través de las de las bacterias Gram-negativas . Es importante destacar que, tque el ensayo parece muy robusto como un robusto "valor z constantemente por encima de 0,5 se observó en todas las pantallas hasta la fecha. Cribado utilizando este protocolo revelará una serie de pequeñas moléculas que inhiben y / o promueven los niveles intracelulares de c-di-GMP en P. aeruginosa. Por otra parte, este ensayo también tiene el potencial de identificar bactericidas o bacteriostáticos compuestos resultantes en una disminución de la OD 600 de lectura.
Aunque no se discutió en la sección de protocolo, hay varias consideraciones importantes para la preparación del experimento. Es de vital importancia tener en cuenta que la bioinformador GFP se basa en un plásmido. Aunque el plásmido reportero se sabe que es muy estable en P. aeruginosa, se puede perder después de continua re-enchapado, de ahí la necesidad de utilizar cepas recién chapadas de un -80 ° C en glicerol, y el control de la expresión de fluorescencia es crítica. También es muy valiosa para mantener condiciones de crecimiento uniformes en toda la pantallaya que las fluctuaciones en estas condiciones podrían tener efectos reacción en cadena de la pantalla. Esto incluiría asegurándose de que los medios y los antibióticos son prefabricados en lotes y se usa a lo largo de la pantalla. Los cultivos bacterianos no crece (basado en 600 OD leer-outs) de una manera uniforme es un problema común para la mayoría de las pantallas de alto rendimiento de esta naturaleza. Esto puede ser debido a los efectos de borde o la distribución de un cultivo bacteriano no homogénea en las placas. En el primer caso, asegurándose de que un sello de gas permeable se utiliza durante la incubación es de vital importancia. Mientras que para este último, el cebado del tubo manipulador de líquidos con un volumen del cultivo al menos tres veces se recomienda el volumen muerto de la propia tubería. Es crucial para mantener el agitador magnético a velocidad mínima durante la dispensación. Mientras que el monitoreo y almacenamiento de las placas de 384 pocillos para un crecimiento constante en el transcurso de los experimentos es lo más importante, una situación a evitar es el apilamiento de placas durante la incubación, ya que puede causar la ONUquerido gradientes de oxígeno que conducen a una asimetría en el patrón de crecimiento. También es importante asegurarse de que el vehículo DMSO usado como control negativo no está afectando negativamente el crecimiento de la cepa de interés. Muchos de estos problemas asociados con el crecimiento puede ser evitado mediante la realización de un simulacro de pantalla con la cepa bacteriana de interés antes de la selección. Interpretación de los datos también merece consideración teniendo en cuenta que los resultados de inhibición de c-di-GMP se calculan por el cambio en unidades de intensidad de fluorescencia arbitrarias que debe ser corregido por la variación de la densidad celular. Con esto en mente diferentes fórmulas matemáticas para evaluar la salida de datos de estos experimentos también debe ser considerado. Por ejemplo, un compuesto podría aparecer como un inhibidor de c-di-GMP, pero en realidad ser un inhibidor del crecimiento o viceversa, que requieren interpretación prudente de los accesos identificados.
Hay varios inconvenientes y limitaciones que deben tenerse en cuenta durante el desarrollo y ejecución del presentebasado en células de alto rendimiento pantalla. Por ejemplo, las funciones de bio-reportero en una medida indirecta de los niveles de c-di-GMP celulares utilizando una sonda fluorescente cuyas propiedades de detección podría ser potencialmente afectada por pequeñas moléculas utilizadas en una pantalla. Una cuestión tangencial es el hecho de que el ensayo basado en células no da ninguna información sobre el mecanismo detrás de los cambios en los niveles intracelulares de c-di-GMP. Por lo tanto, las observaciones importantes de los experimentos deben ser confirmadas mediante un enfoque de alto rendimiento espectrometría de cromatografía líquida-masa, que se considera el método "estándar de oro" para medir las fluctuaciones intracelulares de c-di-GMP en bacterias. Además, nuestro procedimiento sólo puede proporcionar información sobre el comportamiento de las bacterias cultivadas in vitro, como células bacterianas cultivadas en el contexto de la huésped (in vivo) modificar rápidamente sus actividades debido a este entorno. Además, el proceso de utilizar un bioinformador GFP significa que la pantalla no tomaen cuenta el estado fisiológico de las células bacterianas. Sin embargo, el protocolo se podría adaptar a la supervisión microscópica de pocillos individuales durante el curso de la pantalla.
Incluso con estas consideraciones y limitaciones, este ensayo de alto rendimiento es todavía una pantalla robusta para pequeñas moléculas capaces de interferir con los niveles de c-di-GMP intracelulares. Dado que muchas especies microbianas que incluyen muchos patógenos bacterianos se han estudiado con el fin de caracterizar la modulación de los niveles de c-di-GMP intracelulares, nuestro protocolo se podría aplicar a diversas especies bacterianas y ampliado para el estudio de modelos bacterias multiespecíficas más complejos. El ensayo se puede optimizar fácilmente para otras especies bacterianas cambiando las condiciones de crecimiento utilizadas, o se pueden adaptar para leer otros productos mediante el uso de diferentes bioreporters. Diferentes tiempos de incubación se pueden aplicar dependiendo de la fase de crecimiento de interés. Sin embargo, cuando se escala hacia arriba o el aumento de rendimiento de procesamiento, es importan t a tener en cuenta que las bacterias se seguirán creciendo durante los preparativos de la placa y las mediciones de lectura. Por lo tanto se recomienda para detectar un máximo de 15 platos a la vez usando este protocolo. Por otra parte, el uso de placas con más de 384 pozos puede no permitir un crecimiento uniforme, lo que requiere una mayor optimización. Al escalar hacia abajo el número de placas, puede ser más apropiado para inocular manualmente utilizando una pipeta electrónica en lugar de un robot de manejo de líquidos. Está claro que este protocolo podría utilizarse para investigar moléculas pequeñas que se dispersan las biopelículas, ya que los compuestos anti-biopelícula interfieren con la señalización de c-di-GMP. El protocolo también podría ser reciclarse para comprender los diversos aspectos de la fisiología bacteriana. Teniendo en cuenta que la señalización de c-di-GMP es frecuente en la mayoría de las bacterias, mediante el estudio de las fisiologías de estos organismos utilizando este protocolo podemos identificar diferentes estímulos químicos para determinar si o no sus mecanismos de trabajo requieren la señalización de c-di-GMP.
_content "> En resumen, la robustez y la versatilidad del enfoque presentado en este protocolo ayudará a la identificación de moduladores químicos de c-di-GMP señalización en muchos sistemas biológicos.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG | |
| Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG | |
| Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 | |
| Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML | |
| Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 | |
| 2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 | |
| BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 | |
| Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA | |
| 384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 | |
| VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 | |
| 100 ml sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 | |
| AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 | |
| Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |
References
- Lewis, K. Recover the lost art of drug discovery. Nature. 485, 439-440 (2012).
- Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation? Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).
- Hengge, R.
- Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria. Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).
- Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger. Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).
- Boyd, C. D., GA, O. 'T. oole Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems. Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).
- Ryan, R. P., et al. HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).
- Christensen, L. D., et al. Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria. Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Comm. 5, (2014).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation. Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development. Biofouling. 30, 17-28 (2014).
- Rybtke, M. T., et al. Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa. App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).
