Summary
Denne artikel beskriver high-throughput assay, som er blevet etableret for at screene store biblioteker af små molekyler for deres potentielle evne til at manipulere cellulære niveauer af cyclisk di-GMP i Pseudomonas aeruginosa, hvilket giver en ny kraftfuldt værktøj til antibakteriel lægemiddelforskning og forbindelse testning.
Abstract
Bakteriel resistens over for traditionelle antibiotika har drevet forskning forsøg på at identificere nye lægemiddelkandidater i for nylig opdaget regulatoriske veje. Regulatoriske systemer, der udnytter intracellulær cyklisk di-GMP (c-di-GMP) som en anden messenger er en sådan klasse af målet. c-di-GMP er et signalmolekyle findes i næsten alle bakterier, der virker til at regulere en lang række processer, herunder antibiotisk resistens, biofilmdannelse og virulens. Forståelsen af, hvordan c-di-GMP signalering kontrol aspekter af antibiotikaresistente biofilm udvikling har foreslået fremgangsmåder, hvorved ændring af de cellulære koncentrationer af nukleotidet eller forstyrrelser af disse signalveje kan medføre reduceret biofilmdannelse eller øget følsomhed af biofilm til antibiotika. Vi beskriver en simpel high-throughput bioreporter protokol, baseret på grønt fluorescerende protein (GFP), hvis ekspression er under kontrol af c-di-GMP responsiv promotor CDRA, Hurtigt at screene for små molekyler med potentiale til at modulere c-di-GMP cellulære niveauer i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Denne enkle protokol kan screene op mod 3.500 forbindelser inden for 48 timer og har evnen til at blive tilpasset til flere mikroorganismer.
Introduction
Den hurtige udvikling af bakteriel resistens mod klinisk vigtige antibiotika er en af de største bekymringer i øjeblikket står over sundhedspersonale verden over. Dette svigt af traditionelle antibiotika har drevet nye søgninger på kemisk stof, der kan interferere med bakterielle processer involveret i virulens og sygdomsprogression 1. Et sådant reguleringssystem, der udnytter den intracellulære second messenger cykliske di-GMP (c-di-GMP) for nylig er blevet et mål med lovende gyldighed 2-4. Det er blevet fastslået, at denne globale second messenger signalmolekyle regulerer mange funktioner, herunder antibiotisk resistens, vedhæftning, biofilmdannelse og sygdom 2-4.
Det er nu klart, at det cellulære niveau af c-di-GMP i bakteriecellen styres af syntese og nedbrydning, hvorved to molekyler af GTP anvendes til at syntetisere c-di-GMP ved GGDEF domæne-holdige diguanylate cyclaser (DGCs) whereas c-di-GMP nedbrydning katalyseres af (PDE'er), som har enten en EAL eller en HD-GUF domæne (revideret i (3, 5)). Proteiner, der indeholder disse domæner indeholder ofte andre signalering domæner, hvilket tyder på, at deres aktivitet i c-di-GMP omsætning reguleres enten direkte eller indirekte af miljø- eller cellulære 3,5 stikord. Følgelig c-di-GMP signalering funktioner til at forbinde sensing af forskellige miljømæssige påvirkninger for ændringer i bakteriel fænotype. c-di-GMP udøver sin regulerende virkning i bakterier på niveauet for transkription, post-transkription og post-translation ved forskellige mekanismer 4.
En stor indflydelse af c-di-GMP i mange bakterieceller er i bestemmelsen af bakterielle 'livsstil «og navnlig i kontrollen af overgange mellem motile planktoniske celler og fastsiddende celler fastgjort til overflader eller afholdes i de flercellede strukturer af biofilm 3,5. Generelt høj cellulærniveauer af c-di-GMP er forbundet med biofilm dannelse og sessility, mens lave cellulære niveauer fremmer motilitet og virulensfaktor syntese i mange bakterielle patogener 3,5. Således kunne en mere detaljeret viden om arbejdet i c-di-GMP signalering råd strategier for hæmning af biofilm dannelse og virulens i bakterielle patogener. Dette er en skræmmende opgave, da de fleste bakterielle genomer indkode mange proteiner med GGDEF, EAL og / eller HD-GUF domæner (fx P. aeruginosa har over 40 proteiner) og flere effektorer 6,7.
Selv med denne kompleksitet, nye oplysninger tyder dog, at strategier manipulere c-di-GMP-signalering kan udvikles til enten at forhindre antibiotikaresistente infektioner udvikle eller gøre dem modtagelige for immunsystemet eller effektiv behandling ved co-administration af klassiske antibiotika 2. I tråd med dette, er det blevet eksperimentelt påvist, at kunstig faldaf intracellulær c-di-GMP i in vitro -grown P. aeruginosa fører til nedsat biofilm dannelse og øget følsomhed over for antimikrobielle stoffer, mens P. aeruginosa -developed biofilm på silikoneimplantater, som ligger i den peritoneale kavitet hos mus, kan dispergeres i en tilsvarende måde 8-11.
Her beskriver vi en high-throughput, fluorescens-baserede reporter assay til screening små molekyler, der potentielt kan modulere de cellulære c-di-GMP-niveauer i P. aeruginosa (figur 1). Bestemmelsen er baseret på måling af C-di-GMP cellulære niveauer ved hjælp af en tidligere udviklet GFP reporter, hvis ekspression transkriptionelt koblet til C-di-GMP-responsiv CDRA promotor 12. Denne protokol beskriver metoden til ekspression af reporter-konstruktionen i P. aeruginosa stamme af interesse, sammensatte plade forberedelse, kultur inokulering i 384-brønds plader, vækstbetingelser, som vill som oplysninger om indsamling, forvaltning og analyse (figur 1) data. Samlet set vil denne protokol hjælpe forskerne til potentielt identificere nye forbindelser målrettet c-di-GMP signalering i bakterier, og til brug i forskning, der sigter på at forstå biologi P. aeruginosa.
Protocol
Bemærk: Procedurer for kloning og transformation af det rensede c-di-GMP reporter plasmid diskuteres andetsteds 12.
1. Generering af GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain
- Inokulere 5 ml lysogeni bouillon (LB) medium med en enkelt koloni af P. aeruginosa og inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm.
- Transfer 2 ml af natten over kultur i 200 ml frisk LB-medium i en 1 liters kolbe og inkuberes ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm.
- Overvåg optisk densitet ved 600 nm (OD600) hver 30 min ved at tage en 1 ml prøve fra kolben og undersøge anvendelse af et spektrofotometer (som beskrevet tidligere 12).
- Når OD600 når mellem 0,3 - 0,5, placere 40 ml af kulturen i en 50 ml konisk centrifugerør.
- Pelletere cellerne ved centrifugering ved 8.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C, supernatanten fjernes, og re-suspendere cellerne i 40 ml iskold, steril, 300 mM sucrose opløsning.
- Pelletere cellerne en gang ved centrifugering som beskrevet i trin 1.5 og resuspender i 20 ml iskold, steril, 300 mM sucrose opløsning.
- Pelletere cellerne en sidste gang ved centrifugering som beskrevet i trin 1.5 og resuspender i 400 pi iskold, steril, 300 mM sucrose opløsning.
Bemærk: celledensitet på dette punkt bør være ca. 1 x 10 11 kolonidannende enheder pr milliliter (CFU / ml). - Chill cellerne på is i 30 minutter, hvorefter de er klar til elektroporering.
- Tilsæt 1 pi af en 0,2 pg / pl pCdrA :: GFP C plasmid 12 opløsning til 40 pi P. aeruginosa elektro-kompetente celler fremstillet ovenfor i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der er blevet præ-afkølet på is. Bland suspensionen og overføres til en forud kølet, 2 mm elektrodeafstand, elektroporation cuvette.
Bemærk: pCdrA :: GFP C: pUCP22Not-P CDRA -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r Gm r, som giver et fluorescerende udlæsning af det intracellulære niveau af c-di-GMP i P. aeruginosa stammer, blev udviklet og valideret af Rybtke et al. 12. - Fugt fjernes på ydersiden af kuvetten med silkepapir og placer kuvetten i prøvekammeret af elektroporator. Pulse med en spænding på 2,5 kV, kapacitans på 25 uF og modstand på 200 Ω.
- Tag kuvetten og tilsæt 1 ml LB medium. Overfør derefter cellerne til en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm.
- Spred 10 pi, 50 pi og 100 pi alikvoter af kulturen onto sterile LB-agarplader suppleret med ampicillin (ved en koncentration på 100 ug / ml), og inkuber pladerne ved 37 ° C natten over.
- Bekræft GFP udtryk (excitatipå ved 485 nm, emission ved 520 nm) ved at undersøge pladen under en fluorescens mikroskop med en standard GFP kanal og vælge en enkelt koloni til at pode 5 ml LB. Inkuber natten over som beskrevet i trin 1.1. Bland 0,5 ml af natten over kultur med 0,5 ml 50% glycerol i en 2 ml skruelåg rør og opbevares ved -80 ° C.
2. Fremstilling af starterkulturen til inokulering
- To dage før skærmen, plade P. aeruginosa stamme (indeholdende pCdrA :: GFP C plasmid) fra -80 ° C stock på en LB-agarplade (suppleret med ampicillin i en koncentration på 100 ug / ml) ved forsigtigt at sprede bakterierne over pladen under anvendelse af en steril inokulering loop. Inkubér pladen natten over ved 37 ° C.
- Aftenen før screening, pode en enkelt koloni af P. aeruginosa fra pladen i 10 ml LB-medium (suppleret med ampicillin i en koncentration på 100 ug / ml) i en tuvære og inkubere den præ-kultur natten over ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm.
- På dagen for skærmen, forberede en subkultur fra overnight pre-culture ved fortynding det først med frisk LB-medium til en OD600 på 1,0 og derefter yderligere fortynding med 5% LB til en OD600 på 0,04 (1:25) .
Bemærk: Det samlede rumfang af den podede medium afhænger af antallet af plader, der skal testes. 5% LB fremstilles ved at fortynde 100% LB med phosphatpufret saltvand (PBS) til den ønskede koncentration. Vigtigt er det, medierne (5% LB) tillader konstitutiv aktivering af pCdrA :: GFP C i P. aeruginosa. - Tilføj en steril magnetomrører bar i beholderen og rør kulturen på minimal hastighed på en magnetisk omrører i 30 minutter ved stuetemperatur, hvilket tillader bakterierne at akklimatisere til medierne, før de dispenseres i 384-brønds plader.
3. Inokulation og inkubation af 384-brønds plader indeholdendesmå molekyler
Bemærk: Sterilitet og gode aseptiske teknikker er altafgørende for de følgende trin.
- Til fremstilling af positive kontrol (100% inhibering), tilsættes 20 pi tobramycin sulfat (25 mg / ml) til 10 ml (passende for op til 12 plader) af subkultur fremstillet i trin 2.3 og blandes forsigtigt. Pipetter 40 pi den positive kontrol kultur i boringer A23 - P23 (figur 2).
- For at fremstille negative kontrol (0% inhibering), tilsættes 30 pi dimethylsulfoxid (DMSO) til 10 ml (passende for op til 12 plader) af subkultur fremstillet i trin 2.3 og blandes forsigtigt. Pipetter 40 pi den negative kontrolkultur i boringer A24 - P24 (figur 2).
- For hver af pladerne stemplet med små molekyler, pode et volumen på 40 pi af de fortyndede overnatskulturer (beskrevet i trin 2.3) i brøndene A1 - P22 (figur 2).
Bemærk: Dette kan opnås ved anvendelse af en væskehåndteringsudstyr røveot. På grund af de heterogene egenskaber af bakteriekulturer, er det vigtigt at opretholde en kontinuerlig og moderat omrøring for at holde bakterierne konsekvent fordelt i medierne, mens dispensering. For at gøre dette, holde omrøring akklimatiseret kultur fra trin 2.4 magnetisk under dispensering. - Forsegl pladerne med en luftgennemtrængelig dækselpakningen og inkuberes i 6 timer ved 37 ° C.
Bemærk: Luft-gennemtrængelige forsegling er afgørende for at opretholde uforanderlige forhold på tværs af alle 384 brønde og at omgå den potentielle udvikling af ilt gradienter hen over pladen.
4. Måling af vækst (OD 600) og Intracellulær c-di-GMP Level (GFP)
- Ca. 30 minutter før spektrofotometrisk måling, pre-opvarme pladelæseren til 37 ° C for at undgå kondensation.
- Fjern forsigtigt luftgennemtrængelige dæksel pakning, før du læser. Mål den optiske densitet ved en bølgelængde på 600 nm med en indstilling på 10 blink pr brønd ogen afvikling tid på 0,2 sek.
- Forud for måling af fluorescens, foretage en automatisk gain og fokal justering baseret på godt A24 (negativ kontrol) og indstille gain målværdi på 75% (figur 2).
- Fra pladelæser kontrol software, klik på start måling og klik på '' Focus og Gain Adjustment / Plate id'er "fanebladet '.
- Vælg '' Fokusindstilling '' og '' Kanal A '' til højre på vinduet.
- Vælg '' Gain justering '' og '' Udvalgte godt '', og skriv '' 75 '' som '' Målværdi ''. Endelig plukke godt A24 i pladen layout før du klikker på '' Start Justering ''. Når justeringen er udført, skal du klikke på '' Start måling ''.
- Mål fluorescens fra GFP reporter på en excitation / emission maxima af 485/520 nm med en indstilling på 10 blink pr brønd og en settling tid på 0,2 sek.
- Indsamle data fra alle plader undersøgt. Bemærk: dataaflæsninger gemmes automatisk som standard ved pladen læseren kontrol software.
- Vis aflæsninger ved at klikke på "Mars" ikonet i kontrol software til at åbne den statistiske analyse pakken.
- Hent data efter "dobbeltklikke" på pladen antallet af interesse at få adgang til data til analyse.
5. Data Analysis
- Vurdere ensartethed og reproducerbarhed af analysen ved hjælp af robust z 'analyse, som er den mest almindelige kvalitet målinger rapporteret for high-throughput skærme. Beregn robust z 'ved hjælp af formlen:
Hvor MAD (Median absolutte afvigelse) er et estimat af standardafvigelsen, s er den positive kontrol (100% inhibering), og n er den negative kontrol (0% inhibering) for både OD600 og GFP values. Bemærk: Et assay med en robust z 'værdi (beregnet for både OD600 og GFP rådata) større end eller lig med 0,5 betragtes som en fremragende assay. - Beregn% inhibering af vækst ved hjælp af formlen:
Hvor Xi OD600 er itereret OD600-værdien for hver prøvebrønd. % Inhibering OD600> 0, vækst-inhibitor; % Inhibering OD600 <0, vækstfremmer. - Vurdere% inhibering af det intracellulære niveau af c-di-GMP ved hjælp af formlen (ændringen i vilkårlig fluorescensintensitet enheder er korrigeret for ændringen i celletæthed):
Hvor Xi GFP er itereret GFP værdien af hver prøve godt. % Inhibering GFP> 0, c-di-GMP-inhibitor; % &# 160; Inhibering GFP <0, c-di-GMP-promotoren. - Sæt en tærskel for hit detektion ved 3 MAD fra medianen (median ± 3 MAD), beregnet ud fra prøven godt læse-outs af hver plade, under forudsætning af en normal fordeling af data-point. Bemærk: Imidlertid kan en ± 50% inhibering afskæring vælges til mere reproducerbare og nøjagtige dosis-respons-assays, hvis det kræves.
Representative Results
Den her beskrevne fremgangsmåde giver en enkelt forsker til effektivt og med succes screene et gennemsnit på 3.500 forbindelser inden for en 48-timers periode. En oversigt over high-throughput screening protokol er illustreret som et rutediagram i figur 1. På nuværende artikel, screenede vi en regel-of-fem kompatibel forbindelsesbibliotek for potentielle c-di-GMP modulerende forbindelser i en slutkoncentration på 600 uM . Men der er mange kommercielt tilgængelige lægemiddel-lignende og ikke-medicinsk lignende forbindelse sæt, der kan anvendes i assayet. Disse sæt kan være bakterier-fokuserede forbindelser eller tilfældige poolede forbindelser, men hvert bibliotek ville have forjættet fysisk-kemiske egenskaber og karakteristika er tildelt, såsom sættet screenet her, som havde polære funktionelle grupper og flere stereogene centre. I denne protokol, er bakterier inokuleret i pladen sammen med forbindelser, et antibiotikum positiv kontrol og en DMSO-vehikelkontrol, ifølge layoutet vist i figur 2. Figur 3 viser resultaterne af den primære screening eksemplificeret ved et enkelt bibliotek plade. Repræsentative OD600 og GFP rå data er vist i figur 3A og 3B henholdsvis. En farve gradient zonekort, med varmt (rød) til afkøling (grøn) farver indikerer lav til høj OD 600 / GFP-værdier, er blevet anvendt på de godt værdier. De varme kort blev genereret i et regneark ved at anvende en 3-farveskala betinget formatering spænder fra den laveste OD600 / GFP udlæsning op til den højeste OD 600 / GFP udlæsning. Lav OD 600 og GFP-værdier i forhold til DMSO negative kontrol svarer til en inhibering af væksten og c-di-GMP-niveauer henholdsvis mens høje værdier i forhold til DMSO negative kontrol svarer til en fremme af væksten og c-di-GMP-niveauer henholdsvis . Den robuste z 'værdier for OD 600 og GFP are beregnet efter formlen fastsat i protokollen (5.1). Da de begge er over 0,5 (0,694 og 0,761 henholdsvis), blev analysen kvalitet skønnes robust og data blev analyseret yderligere. Den% hæmning af vækst (OD 600) og intracellulære c-di-GMP-niveau (GFP) beregnes ved formlerne angivet i protokollen (5.2, 5.3). Repræsentative data er vist i figur 4A og 4B henholdsvis. En farve gradient zonekort, med varmt (rød) til afkøling (grøn) farver indikerer lav til høj% hæmning, er blevet anvendt på de godt værdier. En scatter plot af% hæmning (OD600 / GFP) fra enkelte brønde baseret på den primære skærm er afbildet i figur 5A og 5B for OD 600 og GFP data hhv. En ± 50% cut-off (angivet med stiplede linjer) er valgt for hit detektion. Potentielle hits baseret på dette cut-off er angivet med røde prikker. To typer af forbindelser af interesse kan discerned fra assayet. Hits identificeret i figur 5A er forbindelser, der inhiberer bakterievækst, mens hits identificeret i figur 5B er forbindelser, der potentielt har evnen til at modulere intracellulære niveauer af c-di-GMP. To forbindelser er blevet identificeret som repræsentative hits for denne analyse. Disse er forbindelse A, en potentiel vækst-inhibitor og forbindelse B, en potentiel c-di-GMP-inhibitor. Forbindelse A svarer til godt F8 i figur 3 og 4 og havde en 72,5% inhibering i vækst. Der var en forventet tilsvarende inhibering i cykliske di-GMP-niveauer. Forbindelse B svarer til godt K3 i figur 3 og 4 og havde en 61% inhibering i cykliske di-GMP-niveauer uden ændring i vækst. Vælg hit forbindelser blev yderligere testet ved en 10-punkts dosis-respons assay med en top koncentration på 2 mM og dobbelt fortyndingsserie. IC50 værdier er beregnet på baggrund af dosis-responskurver (figur 6A og B).
Figur 1. Oversigt: High-throughput Opsætning til Screening små molekyler for deres potentiale til at modulere cellulære niveauer af c-di-GMP i P. aeruginosa. Denne oversigt viser en trin-for-trin repræsentation af den anvendte protokol i denne analyse. En bakteriel koloni af P. aeruginosa dyrkes natten over i et LB starterkultur. Anvendelse af et reagens dispenser cellerne podet i 384-brønds plader indeholdende de udvalgte forbindelser. Pladerne inkuberes i 6 timer, hvorefter OD 600 og GFP-værdier måles. Ved hjælp af disse udlæsninger, forbindelser, som påvirker de cellulære niveauer af c-di-GMP kan identificeres. Klik her for etstørre version af denne figur.
. Figur 2. En 384-brønds plade Kort Anvendes til lille molekyle -screeninganalyse Forbindelserne fra biblioteket (lyseblå) opdeles i portioner i brønde A1 - P22. Den "positiv kontrol" (rød) bestående af en slutkoncentration på 50 ug sættes / ml tobramycin sulfat til brønde A23 - P23 og "negativ kontrol" (grøn) indeholdende en slutkoncentration på 1% tilsættes DMSO til brønde A24 - P24. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative resultater for One 384-godt Screening Plate. Representative rådata er for OD600 (A) og GFP (B). En farve gradient zonekort, med varmt (Rød: OD 600 = 0,65 eller GFP = 250.000) til afkøling (Green: OD 600 = 0,10 eller GFP = 40.000) farver indikerer lav til høje værdier, er blevet anvendt på de godt værdier. Brønde, der har lavere OD 600 / GFP værdierne i forhold til DMSO negative kontrol vil have en tendens til at være i rødt, mens boringer, der har højere OD 600 / GFP værdierne i forhold til DMSO-kontrol vil have en tendens til at være grønt. Klik her for at se et større version af denne figur.
Figur 4. Repræsentative resultater for procentvis inhibering beregnet for en 384-brønds plade. Det analyserede% inhibering data er repræsenteret for begge OD 600 (A) og GFP (B) udlæsninger. En farve gradient zonekort, med varmt (Rød: OD 600 = -150% eller GFP = -20%) til afkøling (Green: OD 600 = 100% eller GFP = 100%) farver indikerer lav til høj inhiberingsværdier, har været anvendes til brønden værdier. Små molekyler, som potentielt hæmmer vækst og intracellulære c-di-GMP vil have en tendens til at være i grønt mens små molekyler, som potentielt fremmer vækst og intracellulære c-di-GMP-niveauer vil have en tendens til at være i rødt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative Scatter Grunde til% hæmning (OD600 / GFP) opnået fra hver Testet lille molekyle. Hver lille molekyle er repræsenteret ved en prik, og% hæmning fordelingfor hver af OD600 (A) og GFP (B) read-outs vises. En ± 50% cut-off er valgt hit identifikation. Potentielle hits er fremhævet med rødt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Repræsentative resultater fra en dosis -. Reaktion Assay To forbindelser (potentielle vækst hæmmer A og potentiel c-di-GMP-hæmmer B) identificeret fra tidligere skærme er yderligere testet i et 10 point dosis-respons assay med en top koncentration på 2 mM og dobbelt fortyndingsserie. Montering af fire-parameter logistisk funktion til oplysninger fremkommet IC 50 værdier på 158 uM og 193 uM hhv. Please klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
For at forbedre behandlingen af bakterielle infektioner, er det klart, at en bedre forståelse af bakteriel adfærd på det molekylære reguleringsniveau er påkrævet. Den her beskrevne procedure vil være til gavn for mikrobiologer, biokemikere og klinikere, der ønsker at afdække små molekyler, der har potentiale til at manipulere eller forstyrre cellulære koncentrationer af c-di-GMP i bakterier. Fremgangsmåden anvender en nylig udviklet GFP bioreporter at overvåge cellulære niveauer af c-di-GMP i P. aeruginosa 12. Denne bioreporter er valideret og vist vigtigere ikke at påvirke væksten af stammen bruges, når de dyrkes i 5% LB i PBS. Anvendelsen af en hel-celle skærmen for at identificere små molekyler, som ændrer c-di-GMP-niveauer in vivo overvinder de største problemer i target-baserede lægemiddelforskning i form af molekyle penetration gennem de bakterielle membraner, især ved de af gramnegative bakterier . Vigtigere, than assay synes meget robust som en robust z 'værdi konsekvent over 0,5 blev observeret i alle skærmbilleder til dato. Screening ved hjælp af denne protokol vil afsløre en række af små molekyler, der hæmmer og / eller fremmer intracellulære c-di-GMP-niveauer i P. aeruginosa. Desuden dette assay har også potentiale til at identificere baktericide eller bakteriostatiske forbindelser resulterer i et fald i OD600 udlæsning.
Selv om det ikke diskuteres i protokollen sektion, der er flere vigtige overvejelser til fremstilling af eksperimentet. Det er vigtigt at huske på, at GFP bioreporter er baseret på et plasmid. Selv reporterplasmidet er kendt for at være meget stabil i P. aeruginosa, kan det være tabt efter kontinuerlig re-plating, hvorfor det er nødvendigt at bruge frisk forgyldt stammer fra en -80 ° C glycerol lager, og kontrollere fluorescens udtryk er kritisk. Det er også meget værdifuldt at bevare ensartede vækstbetingelser hele skærmenda eventuelle udsving i disse betingelser kunne have afsmittende virkninger på skærmen. Dette vil omfatte gøre sikkert, at medier og antibiotika er premade i batch og anvendes i hele forløbet af skærmen. Bakteriekulturer ikke vokser (baseret på OD600 udlæsninger) på en ensartet måde er et fælles problem for de fleste high-throughput skærme af denne art. Dette kan skyldes randeffekter eller afgivelse af en ikke-homogen bakteriekultur i pladerne. For den førstnævnte, og sørg en gas-gennemtrængelige segl der anvendes under inkubationen er afgørende. Mens for sidstnævnte, priming væskehåndteringsudstyret rør, med et volumen af kulturen mindst tre gange anbefales det døde volumen af selve slangen. Det er afgørende at holde magnetomrører ved minimal hastighed under dispensering. Mens overvågning og lagring af de 384-brønds plader til konsistent vækst i løbet af forsøgene er altafgørende, en situation at undgå, er stabling af plader under inkubation, da det kan forårsage unønskede ilt gradienter fører til en skævhed i vækstmønster. Det er også vigtigt at sikre, at DMSO-vehikel anvendes som en negativ kontrol ikke er negativ indvirkning vækst af stammen af interesse. Mange af disse problemer forbundet med vækst kan undgås ved at udføre en mock skærm med den bakterielle stamme af interesse forud for screening. Data fortolkning også fortjener overvejelse eftersom c-di-GMP hæmning resultater beregnes ved ændringen i arbitrære fluorescens intensitet enheder, der skal korrigeres for ændringen i celle tæthed. Med dette i tankerne forskellige matematiske formler til at vurdere data output fra disse eksperimenter bør også overvejes. For eksempel kan en forbindelse vist som en c-di-GMP-inhibitor, men faktisk være en vækst inhibitor eller omvendt, trænger forsigtig fortolkning af identificerede hits.
Der er flere ulemper og begrænsninger, der skal overvejes under udviklingen og opfyldelsen af dennehigh-throughput cellebaserede skærm. For eksempel bio-reporter funktioner på et indirekte mål for cellulære c-di-GMP-niveauer under anvendelse af en fluorescerende probe, hvis afsløring egenskaber kunne potentielt blive påvirket af små molekyler, der anvendes i en skærm. En tangentiel problem er, at det cellebaserede assay giver ingen oplysninger om mekanismen bag ændringer i niveauerne af intracellulær c-di-GMP. Derfor skal vigtige iagttagelser fra forsøg bekræftes ved anvendelse af et højtydende væskekromatografi-massespektrometri tilgang, som betragtes som den "guldstandard" metode til måling af intracellulære c-di-GMP udsving i bakterier. Endvidere kan vores procedure kun tilvejebringe oplysninger om opførslen af bakterier dyrket in vitro, som bakterieceller dyrkes i forbindelse med værten (in vivo) hurtigt ændre deres aktiviteter på grund af dette miljø. Endvidere processen med at bruge en GFP bioreporter betyder, skærmen ikke tagerhensyn til den fysiologiske status af bakteriecellerne. Imidlertid kunne den protokol tilpasses til mikroskopisk overvågning af individuelle brønde i løbet af skærmen.
Selv med disse overvejelser og begrænsninger, denne high-throughput assay er stadig et robust skærm for små molekyler, der kan interferere med intracellulære c-di-GMP-niveauer. Da mange mikrobielle arter, herunder mange bakterielle patogener er blevet undersøgt for at karakterisere modulation af intracellulære c-di-GMP-niveauer, kan vores protokol anvendes på forskellige bakteriearter og udvidet til studiet af mere komplekse flere arter bakterier modeller. Assayet kan let optimeres til andre bakteriearter ved at ændre de anvendte vækstbetingelser, eller kan være indrettet til at læse andre udgange ved hjælp af forskellige bioreporters. Forskellige inkubationstider kan anvendes afhængigt af vækstfasen af interesse. Men når opskalering eller øge gennemgående put, det er importan t at huske på, at bakterierne stadig vil være voksende under plade præparater og læse-målinger. Derfor anbefales det at screene maksimalt 15 plader ad gangen ved hjælp af denne protokol. Desuden bruger plader med mere end 384 brønde kan ikke tillade en ensartet vækst, kræver yderligere optimering. Når skalering ned på antallet af plader, kan det være mere hensigtsmæssigt at manuelt pode bruger en elektronisk pipette i stedet for en flydende håndtering robot. Det er klart, at denne protokol kan anvendes til at undersøge små molekyler som spreder biofilm, da anti-biofilm forbindelser forstyrrer c-di-GMP signalering. Protokollen kan også tilbygges at forstå forskellige aspekter af bakteriel fysiologi. Da c-di-GMP-signalering er udbredt i de fleste bakterier, ved at studere fysiologier af disse organismer ved hjælp af denne protokol vi kan identificere forskellige kemiske stimuli til at afgøre, hvorvidt deres arbejdsmetoder mekanismer kræver c-di-GMP-signalering.
_content "> Sammenfattende vil robusthed og alsidighed af den foreslåede fremgangsmåde i denne protokol hjælpe identifikationen af kemiske modulatorer af c-di-GMP signalering i mange biologiske systemer.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG | |
| Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG | |
| Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 | |
| Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML | |
| Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 | |
| 2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 | |
| BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 | |
| Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA | |
| 384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 | |
| VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 | |
| 100 ml sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 | |
| AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 | |
| Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |
References
- Lewis, K. Recover the lost art of drug discovery. Nature. 485, 439-440 (2012).
- Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation? Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).
- Hengge, R.
- Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria. Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).
- Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger. Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).
- Boyd, C. D., GA, O. 'T. oole Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems. Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).
- Ryan, R. P., et al. HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).
- Christensen, L. D., et al. Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria. Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Comm. 5, (2014).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation. Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development. Biofouling. 30, 17-28 (2014).
- Rybtke, M. T., et al. Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa. App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).
