Summary
Questo articolo descrive il saggio ad alta prestazione che è stato stabilito con successo per lo screening grandi librerie di piccole molecole per il loro potenziale capacità di manipolare i livelli cellulari di ciclico di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, che fornisce un nuovo potente strumento per la scoperta di nuovi farmaci antibatterici e test composto.
Abstract
La resistenza batterica agli antibiotici tradizionali ha spinto i tentativi di ricerca per identificare nuovi bersagli farmacologici nelle vie di regolazione recentemente scoperti. I sistemi di regolamentazione che utilizzano intracellulare ciclica di-GMP (c-di-GMP) come secondo messaggero sono un tale classe di destinazione. c-di-GMP è una molecola di segnalazione si trovano in quasi tutti i batteri che agisce per regolare una vasta gamma di processi tra cui la resistenza agli antibiotici, la formazione di biofilm e virulenza. La comprensione di come c-di-GMP segnalazione controlli gli aspetti dello sviluppo di biofilm resistente agli antibiotici ha suggerito approcci per cui l'alterazione delle concentrazioni cellulari del nucleotide o di interruzione di queste vie di segnalazione può portare alla formazione di biofilm ridotta o aumentata suscettibilità dei biofilm agli antibiotici. Descriviamo un semplice protocollo high-throughput marcatura già, sulla base di proteina fluorescente verde (GFP), la cui espressione è sotto il controllo del promotore reattivo c-di-GMP Cdra, Per lo screening rapido per le piccole molecole con la possibilità di modulare i livelli cellulari c-di-GMP in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Questo semplice protocollo può schermo verso l'alto di 3.500 composti entro 48 ore e ha la capacità di essere adattato a diversi microrganismi.
Introduction
Il rapido sviluppo di resistenza batterica agli antibiotici clinicamente importanti è una delle maggiori preoccupazioni che deve affrontare gli operatori sanitari in tutto il mondo. Questo fallimento degli antibiotici tradizionali ha spinto nuove ricerche per la materia chimico che può interferire con i processi batterici coinvolti nella virulenza e progressione della malattia 1. Un tale sistema di regolamentazione che utilizza il secondo messaggero intracellulare ciclico di-GMP (c-di-GMP) è recentemente diventato un bersaglio con validità promettente 2-4. E 'stato stabilito che questa seconda molecola segnale messaggero globale regola molte funzioni tra cui la resistenza agli antibiotici, l'adesione, la formazione di biofilm e la malattia 2-4.
Ora è inteso che il livello cellulare di c-di-GMP nella cellula batterica è controllato da sintesi e degradazione in cui due molecole di GTP sono usati per sintetizzare c-di-GMP by GGDEF dominio contenenti ciclasi diguanylate (DGCS) whereas degradazione c-di-GMP è catalizzata dalla fosfodiesterasi (PDE) che hanno sia un EAL o un dominio HD-GYP (recensione in (3, 5)). Le proteine contenenti questi domini contengono spesso altri domini di segnalazione, suggerendo che la loro attività in fatturato c-di-GMP è regolata direttamente o indirettamente da stimoli ambientali o cellulari 3,5. Di conseguenza, c-di-GMP funzioni di segnalazione per collegare il rilevamento di diversi stimoli ambientali modifiche nel fenotipo batterica. c-di-GMP esercita il suo effetto normativo batteri a livello della trascrizione, post-trascrizione e post-traduzione da vari meccanismi 4.
Una grande influenza di c-di-GMP in molte cellule batteriche è nella determinazione di batteri 'stile di vita' e, in particolare, nel controllo delle transizioni tra cellule planctoniche motilità e cellule sessili attaccate alle superfici o organizzati in strutture multicellulari di biofilm 3,5. In generale, alta cellularlivelli di c-di-GMP sono associati con la formazione di biofilm e sessility, mentre bassi livelli cellulari favorire la motilità e la sintesi fattore di virulenza in molti batteri patogeni 3,5. Così, una conoscenza più dettagliata del funzionamento della segnalazione c-di-GMP poteva permettersi strategie per l'inibizione della formazione di biofilm e virulenza in batteri patogeni. Questo è un compito arduo, dato che la maggior parte dei genomi batterici codificano numerose proteine con GGDEF, EAL e / o domini HD-GYP (ad esempio P. aeruginosa ha oltre 40 proteine) e molteplici effettori 6,7.
Tuttavia, anche con questa complessità, studi recenti dimostrano che le strategie di manipolazione di segnalazione c-di-GMP possono essere sviluppate a uno prevenire le infezioni resistenti agli antibiotici in via di sviluppo o li rendono suscettibili al sistema immunitario o un trattamento efficace per la co-somministrazione di antibiotici classici 2. In linea con questo, è stato sperimentalmente dimostrato che diminuzione artificialedi intracellulare c-di-GMP in vitro grown P. aeruginosa porta alla diminuita formazione di biofilm e una maggiore suscettibilità agli antimicrobici, mentre P. aeruginosa -developed biofilm su impianti di silicone, che si trova nella cavità peritoneale di topi, possono essere disperse in modo simile 8-11.
Qui, descriviamo un high-throughput, saggio giornalista basato sulla fluorescenza per lo screening di piccole molecole che possono potenzialmente modulare i livelli cellulari c-di-GMP in P. aeruginosa (Figura 1). Il test si basa sulla misurazione c-di-GMP livelli cellulari utilizzando un reporter GFP precedentemente sviluppato la cui espressione è trascrizionalmente legata al c-di-GMP-reattiva CDRA promotore 12. Questo protocollo descrive la metodologia di espressione del costrutto reporter P. aeruginosa ceppo di interesse, piastra preparazione composto, cultura inoculazione in piastre da 384 pozzetti, condizioni di crescita, come noill i dettagli riguardanti la raccolta di dati, la gestione e l'analisi (Figura 1). Nel complesso, questo protocollo sarà di aiuto ai ricercatori di identificare nuovi composti potenzialmente mira c-di-GMP di segnalazione nei batteri, e per scopi di ricerca che mira a comprendere la biologia di P. aeruginosa.
Protocol
Nota: Le procedure per la clonazione e la trasformazione del purificato c-di-GMP giornalista plasmide sono discussi altrove 12.
1. Generazione di GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain
- Seminare medio 5 ml di brodo lisogenia (LB) con una singola colonia di P. aeruginosa e incubare durante la notte a 37 ° C con agitazione a 200 rpm.
- Trasferimento 2 ml di coltura durante la notte in 200 ml di terreno LB fresco in un pallone da 1 L e incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm.
- Monitorare densità ottica a 600 nm (OD 600) ogni 30 min prelevando un campione 1 ml dalla muffola ed esaminare utilizzando uno spettrofotometro (come descritto in precedenza 12).
- Quando la OD 600 raggiunge tra 0,3 - 0,5 porre 40 ml di coltura in un tubo da 50 ml conica per centrifuga.
- Agglomerare le cellule per centrifugazione a 8.000 rpm per 10 min a 4 ° C, scartare il surnatante e re-sospensione le cellule in 40 ml di soluzione 300 mM di saccarosio ghiacciata, sterile.
- Agglomerare le cellule una seconda volta mediante centrifugazione come descritto al punto 1.5 e risospendere in 20 ml di soluzione da 300 mm di saccarosio ghiacciata, sterile.
- Agglomerare le cellule per l'ultima volta per centrifugazione come descritto al punto 1.5 e risospendere in 400 ml di soluzione da 300 mm di saccarosio ghiacciata, sterile.
Nota: La densità delle cellule, a questo punto dovrebbe essere di circa 1 x 10 11 unità formanti colonia per millilitro (CFU / ml). - Raffreddare le cellule in ghiaccio per 30 min, dopo di che sono pronti per l'elettroporazione.
- Aggiungere 1 ml di una / ml pCdrA :: GFP C plasmide 12 soluzione 0,2 mg a 40 ml di P. cellule elettro-competente aeruginosa preparati sopra in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga che è stato pre-raffreddata in ghiaccio. Mescolare la sospensione e trasferire in un pre-raffreddata, 2 millimetri distanza tra gli elettrodi, elettroporazione provetta.
Nota: pCdrA :: GFP C: pUCP22Not-P CDRA -RBSII- GFP (MUT3) -T 0 -T 1, Amp r Gm R, che dà una lettura a fluorescenza del livello intracellulare di c-di-GMP in P. ceppi aeruginosa, è stato sviluppato e validato da Rybtke et al. 12. - Rimuovere l'umidità all'esterno della cuvetta con carta velina e posizionare la cuvetta nella camera del campione del electroporator. Pulse con una tensione di 2,5 kV, capacità di 25 uF e resistenza di 200 Ω.
- Rimuovere la cuvetta e aggiungere 1 ml di terreno LB. Quindi, trasferire le cellule ad una sterile 1,5 ml provetta e incubare per 2 ore a 37 ° C con agitazione a 200 rpm.
- Distribuire 10 ml, 50 ml e aliquote di 100 microlitri della coltura su piastre LB-agar addizionato con ampicillina sterili (ad una concentrazione di 100 ug / ml), e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
- Confermare l'espressione GFP (excitatisu a 485 nm, emissione a 520 nm), esaminando la lastra sotto un microscopio a fluorescenza con un canale GFP normale e scegliere una singola colonia per inoculare 5 ml LB. Incubare per una notte come descritto al punto 1.1. Mescolare 0,5 ml della coltura durante la notte con 0,5 ml di glicerolo al 50% in 2 ml vite tubo orizzontale e conservare a -80 ° C.
2. Preparazione della coltura starter per l'inoculazione
- Due giorni prima che lo schermo, il piatto del P. ceppo aeruginosa (contenente la pCdrA :: GFP C plasmide) da -80 ° C archivio su una piastra di LB-agar (integrato con ampicillina ad una concentrazione di 100 ug / ml), diffondendo delicatamente i batteri sopra la piastra utilizzando un inoculo sterile ciclo continuo. Incubare la piastra per una notte a 37 ° C.
- La sera prima della proiezione, inoculare una singola colonia di P. aeruginosa dalla piastra in 10 ml di terreno LB (integrato con ampicillina ad una concentrazione di 100 ug / ml) in una TUessere e incubare durante la notte pre-coltura a 37 ° C con agitazione a 200 rpm.
- Il giorno della schermata, preparare una subcoltura dal overnight precoltura diluendo prima con terreno LB fresco ad una OD 600 di 1,0 e poi ulteriormente diluito con 5% LB ad un OD 600 di 0,04 (rapporto 1,25) .
Nota: Il volume totale del mezzo inoculato dipende dal numero di piastre da testare. 5% LB è fatta diluendo 100% LB con tampone fosfato (PBS) alla concentrazione desiderata. È importante sottolineare che i media (5% LB) consente l'attivazione costitutiva della pCdrA :: GFP C in P. aeruginosa. - Aggiungere sterile ancoretta magnetica nel contenitore e mescolare la coltura a velocità minima su un agitatore magnetico per 30 minuti a temperatura ambiente, permettendo ai batteri di raggiungere la media prima di essere consegnato in piastre a 384 pozzetti.
3. Inoculazione e incubazione delle piastre da 384 pozzetti contenentipiccole molecole
Nota: La sterilità e le buone tecniche asettiche sono di primaria importanza per le seguenti operazioni.
- Per preparare il controllo positivo (100% di inibizione), aggiungere 20 ml tobramicina solfato (25 mg / ml) a 10 ml (sufficienti per un massimo di 12 lastre) della sottocultura preparata nella fase 2.3 e mescolare delicatamente. Pipettare 40 ml di cultura del controllo positivo nei pozzetti A23 - P23 (Figura 2).
- Per preparare il controllo negativo (0% di inibizione), aggiungere 30 ml dimetilsolfossido (DMSO) a 10 ml (sufficienti per un massimo di 12 lastre) della sottocultura preparata nella fase 2.3 e mescolare delicatamente. Pipettare 40 ml di cultura del controllo negativo nei pozzetti A24 - P24 (Figura 2).
- Per ciascuna delle piastre stampate con le piccole molecole, inoculare un volume di 40 ml di colture overnight diluite (riportati nel passo 2.3) nei pozzetti A1 - P22 (Figura 2).
Nota: Ciò può essere ottenuto utilizzando un gestore di liquido robot. A causa delle proprietà eterogenee di colture batteriche, è importante mantenere una agitazione continua e moderata per mantenere i batteri costantemente distribuiti nei media durante la distribuzione. Per fare questo, continuate a mescolare la cultura acclimatati dal punto 2.4 magneticamente durante l'erogazione. - Sigillare le piastre con un sigillo copertura permeabile all'aria e incubare per 6 ore a 37 ° C.
Nota: La tenuta permeabile all'aria è fondamentale per mantenere le condizioni immutabili attraverso tutti i 384 pozzi e per aggirare il potenziale di sviluppo dei gradienti di ossigeno attraverso la piastra.
4. misurazione della crescita (OD 600) e intracellulare c-di-GMP Livello (GFP)
- Circa 30 minuti prima misurazione spettrofotometrica, pre-riscaldare il lettore di piastre a 37 ° C per evitare la condensazione.
- Rimuovere delicatamente la guarnizione del coperchio permeabile all'aria prima di leggere. Misurare la densità ottica alla lunghezza d'onda di 600 nm con un ambiente di 10 lampi al bene eun tempo di assestamento di 0,2 sec.
- Prima di misurare la fluorescenza, fare un guadagno automatico e la regolazione focale sulla base di ben A24 (controllo negativo) e impostare il valore target di guadagno al 75% (Figura 2).
- Dal software di controllo lettore di piastre, cliccare sulla misurazione di inizio e cliccare su '' Focus e Regolazione guadagno IDS / Plate 'scheda'.
- Seleziona '' Messa a fuoco '' e '' canale A '' a destra sulla finestra.
- Seleziona '' di regolazione del guadagno '' e '' Selected bene '', e digitare '' 75 '' il '' valore obiettivo ''. Infine, scegliere bene A24 nel layout piatto prima di fare clic su '' avviare la regolazione ''. Una volta che la regolazione viene effettuata, cliccare su '' Avviare la misurazione ''.
- Misurare la fluorescenza del reporter di GFP ad un massimi di eccitazione / emissione di 485/520 nm con una cornice di 10 flash al bene e un settlitempo ng di 0,2 sec.
- Raccogliere i dati provenienti da tutte le piastre esaminati. Nota: letture dati vengono salvati automaticamente come predefinita dal software di controllo lettore di piastre.
- Visualizzazione delle letture facendo clic sull'icona "Mars" all'interno del software di controllo per aprire il pacchetto di analisi statistica.
- Recuperare dati da "doppio clic" sul numero di targa di interesse per accedere ai dati per l'analisi.
Analisi 5. I dati
- Valutare l'uniformità e la riproducibilità del test utilizzando l'analisi robusta z ', che è la metriche più comuni di qualità segnalati per schermi high-throughput. Calcolare z robusta 'con la formula:
Dove MAD (mediana Absolute deviazione) è una stima della deviazione standard, p è il controllo positivo (100% di inibizione) ed n è il controllo negativo (0% di inibizione) sia per OD 600 e GFP valori. Nota: Un saggio con un valore solido z '(calcolato sia per OD 600 e GFP dati grezzi) maggiore o uguale a 0,5 è considerato come un saggio eccellente. - Calcolare% di inibizione della crescita mediante la formula:
Dove Xi OD600 è il iterata valore di OD 600 di ciascun campione. % Di inibizione OD600> 0, inibitore della crescita; % Di inibizione OD600 <0, promotore della crescita. - Valutare l'inibizione% del livello intracellulare di c-di-GMP utilizzando la formula (la variazione di unità di intensità di fluorescenza arbitraria vengono corretti per la variazione di densità cellulare):
Dove Xi GFP è il valore GFP iterata di ciascun campione. Inibizione% GFP> 0, inibitore c-di-GMP; % &# 160; Inibizione GFP <0, c-di-GMP promotore. - Impostare una soglia di rilevamento per zone a 3 MAD dalla mediana (mediana ± 3 MAD), calcolato dal campione colto-out di ogni piatto, ipotizzando una distribuzione normale di punti di dati. Nota: Tuttavia, un ± 50% di inibizione cut-off può essere selezionato per saggi dose-risposta più riproducibili e precisi, se necessario.
Representative Results
L'approccio qui descritto permette un singolo ricercatore per schermare efficacemente e con successo una media di 3.500 composti entro un periodo di 48 ore. Una panoramica del protocollo di screening high-throughput è illustrata come un diagramma di flusso nella figura 1. Per l'articolo corrente, abbiamo proiettato una biblioteca composta compatibile regola-di-cinque per i potenziali composti modulanti c-di-GMP ad una concentrazione finale di 600 micron . Tuttavia, ci sono molti disponibili in commercio droga-like e non-farmaco come insiemi composti che potrebbero essere utilizzati nel saggio. Questi set possono essere composti batteri concentrati o composti pool casuali ma ogni libreria avrebbero predicato proprietà fisico-chimiche e le caratteristiche assegnati come il set proiettato qui, che aveva gruppi funzionali polari e più centri stereogenici. In questo protocollo, i batteri vengono inoculati in piastra lungo con composti, un controllo positivo antibiotico e un veicolo DMSOcontrollo, secondo la disposizione mostrata nella figura 2. La Figura 3 illustra i risultati dello screening primario esemplificato da una singola piastra di libreria. OD rappresentativa 600 e dati grezzi GFP sono mostrati in Figura 3A e 3B rispettivamente. Una mappa di calore sfumatura di colore, con caldo (rosso) per il raffreddamento (verde) i colori che indicano basso ad alto OD valori 600 / GFP, è stato applicato ai valori così. Le mappe di calore sono stati generati in un foglio elettronico mediante l'applicazione di una scala di formattazione condizionale di 3 colori che va dal basso OD 600 / GFP read-out fino al più alto OD 600 / GFP read-out. Low OD 600 e GFP valori relativi al controllo negativo DMSO corrispondono ad una inibizione della crescita e livelli di c-di-GMP, rispettivamente, mentre valori elevati relativi al controllo negativo DMSO corrispondono rispettivamente ad una promozione della crescita e livelli di c-di-GMP . I valori z robusta 'per OD 600 e GFP are calcolata secondo la formula di cui al protocollo (5.1). Dal momento che sono entrambi al di sopra di 0,5 (rispettivamente 0,694 e 0,761), la qualità del test è stato ritenuto affidabile e i dati sono stati ulteriormente analizzato. L'inibizione% della crescita (OD 600) e intracellulare Livello C-di-GMP (GFP) sono calcolati dalle formule previste dal protocollo (5.2, 5.3). Dati rappresentativi sono mostrati in Figura 4A e 4B, rispettivamente. Una mappa di calore sfumatura di colore, con caldo (rosso) per il raffreddamento (verde) i colori che indicano basso dell'inibizione alta%, è stato applicato ai valori così. Un grafico a dispersione di inibizione% (OD600 / GFP) dai singoli pozzi in base alla schermata principale è tracciata nella Figura 5A e 5B per OD 600 e dei dati GFP, rispettivamente. Un taglio-off ± 50% (indicato con linee tratteggiate) è selezionata per la rilevazione colpo. colpi potenziali basati su questa cut-off sono indicati con punti rossi. Due tipi di composti di interesse possono essere discerned dal saggio. Accessi identificati nella Figura 5A sono composti che inibiscono la crescita batterica, mentre risultati identificati nella Figura 5B sono composti che possiedono potenzialmente la capacità di modulare i livelli intracellulari di c-di-GMP. Due composti sono stati identificati come risultati rappresentativi per questo test. Questi sono composti A, un potenziale inibitore della crescita e composti B, un potenziale inibitore c-di-GMP. Il composto A corrisponde a ben F8 nelle figure 3 e 4, e aveva una inibizione del 72,5% in crescita. C'era una inibizione corrispondente previsto nel ciclici livelli di-GMP. Composto B corrisponde a ben K3 nelle figure 3 e 4, e aveva una inibizione del 61% nel ciclici livelli di-GMP senza cambiamento nella crescita. Seleziona composti hit sono stati ulteriormente analizzati mediante un saggio dose-risposta 10 punti con una concentrazione superiore di 2 mM e serie di diluizioni doppie. IC 50 valori sono calcolati sulla base della dose-rispostacurve (Figura 6A e B).
Figura 1. Panoramica: Installazione high-throughput per lo screening piccole molecole per il loro potenziale di modulare i livelli cellulari di c-di-GMP in P. aeruginosa. Questa panoramica mostra una rappresentazione step-by-step del protocollo utilizzato in questo test. Una colonia batterica P. aeruginosa è cresciuto durante la notte in una cultura di avviamento LB. Utilizzando un dispensatore di reagente, le cellule vengono inoculati in 384 pozzetti contenenti composti selezionati. Le piastre vengono incubate per 6 ore, dopo di che vengono misurati i valori di OD 600 e GFP. L'utilizzo di questi-outs leggere, composti che influenzano i livelli cellulari di c-di-GMP può essere identificato. Cliccate qui per visualizzare ungrande versione di questa figura.
. Figura 2. A 384 pozzetti Mappa Utilizzato per la piccola molecola Screening Assay I composti dalla libreria (azzurro) sono aliquotati in pozzetti A1 - P22. Il "controllo positivo" (rosso) costituito da una concentrazione finale di 50 ug / ml di solfato di tobramicina viene aggiunto ai pozzetti A23 - P23 ed il "controllo negativo" (verde) contenente una concentrazione finale di 1% di DMSO viene aggiunta ai pozzetti A24 - P24. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Risultati rappresentativi per una piastra da 384 pozzetti screening. Rdati grezzi epresentative è per OD 600 (A) e GFP (B). Una mappa di calore sfumatura di colore, con acqua calda (Red: OD 600 = 0,65 o GFP = 250.000) per il raffreddamento (verde: OD 600 = 0,10 o GFP = 40.000) i colori che indicano basso a valori elevati, è stato applicato ai valori così. Wells che hanno minore OD 600 / GFP letture rispetto al controllo negativo DMSO tenderanno ad essere in rosso, mentre i pozzi che hanno elevati valori di DO 600 / GFP relativi al controllo DMSO tenderanno ad essere di colore verde. Clicca qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.
Figura 4. Rappresentante dei risultati per l'inibizione percentuale calcolata per un piatto 384 pozzetti. I dati analizzati% di inibizione è rappresentata per entrambe le OD 600 (A) e GFP (B) read-out. Una mappa sfumatura di colore caldo, con caldo (Red: OD 600 = -150% o GFP = -20%) per il raffreddamento (verde: OD 600 = 100% o 100% = GFP) colori che indica bassa per alti valori di inibizione, è stato applicare ai valori così. Piccole molecole, che potenzialmente inibiscono la crescita e intracellulare c-di-GMP tenderanno ad essere di colore verde mentre le piccole molecole che promuovono potenzialmente crescita e intracellulari livelli di c-di-GMP tenderanno ad essere in rosso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. grafici a dispersione rappresentativi per% di inibizione (OD600 / GFP) ottenuti da ciascuna testata piccole molecole. Ogni piccola molecola è rappresentata da un punto e la distribuzione% di inibizioneper ciascuna delle OD 600 (A) e GFP (B) outs lettura è mostrato. Un cut-off ± 50% è stato selezionato per l'identificazione colpo. I potenziali colpi sono evidenziati in rosso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Risultati rappresentante di una dose -. La risposta del dosaggio due composti (potenziale inibitore della crescita A e potenziale c-di-GMP inibitore B) individuate dagli schermi precedenti sono ulteriormente testati in un saggio di dose-risposta 10 punti con una concentrazione superiore del 2 mM e serie di diluizioni duplice. Montaggio di una funzione logistica a quattro parametri per i dati risultanti IC50 valori di 158 micron e 193 micron, rispettivamente. Please clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Al fine di migliorare il trattamento di infezioni batteriche, è evidente che è necessaria una migliore comprensione del comportamento batterica a livello regolamentare molecolare. La procedura descritta qui sarà utile per microbiologi, biochimici e clinici che vogliono scoprire le piccole molecole che hanno il potenziale per manipolare o interferire con le concentrazioni cellulari di c-di-GMP nei batteri. Il metodo utilizza una marcatura già GFP recentemente sviluppato per monitorare i livelli cellulari di c-di-GMP in P. aeruginosa 12. Questa marcatura già è stato convalidato e dimostrato importante non influenzare la crescita del ceppo usato quando coltivate in 5% LB in PBS. L'uso di uno schermo whole-cell per identificare piccole molecole che altera i livelli di c-di-GMP in vivo supera le maggiori difficoltà di destinazione-based drug discovery in termini di penetrazione molecola attraverso le membrane batteriche, in particolare attraverso quelli di batteri Gram-negativi . È importante sottolineare che, tegli saggio appare molto robusto come un valore solido z 'costantemente al di sopra di 0,5 è stata osservata in tutte le schermate fino ad oggi. Lo screening utilizzando questo protocollo rivelerà una serie di piccole molecole che inibiscono e / o promuovono intracellulari livelli di c-di-GMP in P. aeruginosa. Inoltre, questo test ha anche la possibilità di identificare battericide o batteriostatiche composti con conseguente diminuzione della OD 600 read-out.
Sebbene non discusso nella sezione del protocollo, ci sono diverse considerazioni importanti per la preparazione dell'esperimento. È importante tenere presente che la marcatura già GFP è basato su un plasmide. Sebbene il plasmide giornalista è noto per essere molto stabile in P. aeruginosa, può essere interrotta dopo continua ri-placcatura, quindi la necessità di utilizzare ceppi appena placcato da -80 ° C stock di glicerolo, e controllando espressione fluorescenza è critica. È inoltre molto importante per mantenere condizioni di crescita uniformi in tutto lo schermodal momento che eventuali fluttuazioni in queste condizioni potrebbero avere effetti a catena sullo schermo. Ciò include assicurandosi che i media e antibiotici sono premade in batch e utilizzato nel corso della schermata. Le colture batteriche non cresce (sulla base di OD 600 read-out) in modo uniforme è un problema comune per la maggior parte degli schermi high-throughput di questa natura. Questo può essere dovuto ad effetti di bordo o l'erogazione di una coltura batterica non omogenea nelle piastre. Per i primi, assicurandosi che la tenuta di gas-permeabile viene utilizzato durante l'incubazione è di vitale importanza. Mentre per quest'ultimo, innescando il tubo conduttore liquido con un volume di coltura almeno tre volte si raccomanda il volume morto del tubo stesso. È fondamentale mantenere l'agitatore magnetico a velocità minima durante l'erogazione. Mentre monitoraggio e memorizzazione delle piastre a 384 pozzetti di crescita costante nel corso degli esperimenti è fondamentale, una situazione per evitare la sovrapposizione delle lastre durante l'incubazione in quanto può causare unvoluto gradienti di ossigeno che portano ad un disallineamento nel modello di crescita. E 'anche importante assicurare che il veicolo DMSO usato come controllo negativo non influisce negativamente la crescita del ceppo di interesse. Molti di questi problemi associati con la crescita possono essere evitati eseguendo uno schermo finto con il ceppo batterico di interesse prima dello screening. Interpretazione dei dati anche merita considerazione visto che c-di-GMP risultati di inibizione sono calcolati dal cambiamento in unità di intensità di fluorescenza arbitrarie che deve essere corretto per il cambiamento di densità cellulare. Con questo in mente diverse formule matematiche per valutare i dati in uscita da questi esperimenti dovrebbero essere considerati. Ad esempio, un composto potrebbe apparire come inibitore c-di-GMP ma in realtà essere un inibitore della crescita o viceversa, richiedendo prudente interpretazione dei risultati identificati.
Ci sono diversi inconvenienti e limitazioni che devono essere considerati durante lo sviluppo e le prestazioni di questohigh-throughput cell-based schermo. Ad esempio, le funzioni bio-reporter su una misura indiretta di cellulari livelli c-di-GMP utilizzando una sonda fluorescente cui proprietà rilevamento potrebbe potenzialmente essere influenzata da piccole molecole utilizzate in uno schermo. Un problema tangenziale è il fatto che il saggio basato su cellule non contiene informazioni relativamente al meccanismo dietro cambiamenti nei livelli di intracellulare c-di-GMP. Pertanto, importanti osservazioni da esperimenti devono essere confermati mediante un approccio di spettrometria liquida ad alta prestazione cromatografia di massa, che è considerato il metodo "gold-standard" per misurare intracellulari fluttuazioni c-di-GMP in batteri. Inoltre, il procedimento può fornire solo informazioni sul comportamento dei batteri coltivati in vitro, le cellule batteriche coltivate nel contesto del host (in vivo) modificare rapidamente le loro attività a causa di questo ambiente. Inoltre, il processo di utilizzo di una marcatura già GFP significa che lo schermo non prendein considerazione lo stato fisiologico delle cellule batteriche. Tuttavia, il protocollo può essere adattato al monitoraggio microscopica dei singoli pozzetti durante il corso della schermata.
Anche con tali considerazioni e limitazioni, questo saggio ad alta prestazione è ancora uno schermo robusto per piccole molecole capaci di interferire con livelli intracellulari di c-di-GMP. Poiché molte specie microbiche tra cui molti patogeni batterici sono stati studiati per caratterizzare la modulazione dei livelli intracellulari c-di-GMP, il protocollo può essere applicata a diverse specie batteriche e ampliato per lo studio dei più complessi modelli batteri multispecie. Il dosaggio può essere facilmente ottimizzato per altre specie batteriche cambiando le condizioni di crescita utilizzati, o possono essere adattati per leggere altre uscite utilizzando diversi bioreporters. Diversi tempi di incubazione possono essere applicati a seconda della fase di crescita di interesse. Tuttavia, quando scaling up o aumentare through-put, è importan t da tenere a mente che i batteri saranno ancora in crescita durante i preparativi della piastra e le misure di read-out. Pertanto si raccomanda di schermare un massimo di 15 piastre alla volta utilizzando questo protocollo. Inoltre, utilizzando piastre con più di 384 pozzi potrebbe non consentire la crescita uniforme, che richiede un'ulteriore ottimizzazione. Quando ridimensionamento del numero di piastre, può essere più appropriato per inoculare manualmente utilizzando una pipetta elettronica invece di un robot gestione dei liquidi. È chiaro che questo protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare piccole molecole che disperdono biofilm, dato che i composti anti-biofilm interferiscono con segnalazione c-di-GMP. Il protocollo potrebbe anche essere rivisto per comprendere i vari aspetti della fisiologia batterica. Dato che la segnalazione c-di-GMP è prevalente nella maggior parte dei batteri, studiando le fisiologia di questi organismi usando questo protocollo possiamo identificare diversi stimoli chimici per determinare se i loro meccanismi di funzionamento richiedono segnalazione c-di-GMP.
_content "> In sintesi, la robustezza e la versatilità dell'approccio presentato in questo protocollo aiuterà l'identificazione di modulatori chimici di c-di-GMP segnalazione in molti sistemi biologici.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG | |
| Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG | |
| Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 | |
| Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML | |
| Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 | |
| 2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 | |
| BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 | |
| Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA | |
| 384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 | |
| VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 | |
| 100 ml sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 | |
| AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 | |
| Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |
References
- Lewis, K. Recover the lost art of drug discovery. Nature. 485, 439-440 (2012).
- Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation? Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).
- Hengge, R.
- Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria. Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).
- Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger. Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).
- Boyd, C. D., GA, O. 'T. oole Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems. Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).
- Ryan, R. P., et al. HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).
- Christensen, L. D., et al. Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria. Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Comm. 5, (2014).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation. Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development. Biofouling. 30, 17-28 (2014).
- Rybtke, M. T., et al. Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa. App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).
