Summary
Vi beskriver en hurtig, molekylær-baserte Influensa A og B assay. Den Influensa analysen registrerer hvert mål innen 15 min ved å ansette isotermisk forsterkning med influensaspesifikke primere etterfulgt av mål deteksjon med molekylære beacon sonder. Den Influensa A og B-analysen er brukervennlig og krevde minimal hands-on tid til å utføre.
Abstract
Influensa er en smittsom luftveissykdom forårsaket av influensavirus A og B hos mennesker og forårsaker en betydelig mengde av sykelighet og dødelighet hvert år. Den Influensa A og B-analysen var den første CLIA-fravikes molekylær rask influensa test tilgjengelig. Den Influensa A og B-test fungerer ved å ansette isotermisk forsterkning med influensaspesifikke primere etterfulgt av mål deteksjon med molekylære beacon sonder. Her utførelsen av influensa A og B-analyse på frossen, arkivert nasofaryngeal pinne (NPS) eksemplarer lagret i virustransportmedium (VTM) ble sammenlignet med en luftveis analysen panel.
Utførelsen av influensa A og B assay ble evaluert ved å sammenligne resultatene for luft panel referansemetoden. Følsomheten for total influensavirus A var 67,5% (95% KI (CI), 56,6 til 78,5) og spesifisiteten var 86,9% (CI, 71,0 til 100). For influensavirus B-testing, sensitivitet og spesifisitet var 90,2% (CI, 68,5 til 100) Og 98,8% (CI, 68,5 til 100), henholdsvis.
Dette systemet har fordelen av en vesentlig kortere tid enn test enhver annen for tiden tilgjengelig molekylær analyse og den enkle, pipette-fri fremgangsmåte kjører på en fullt integrert, lukket, liten plass system. Totalt sett er influensa A og B assay undersøkt i denne undersøkelsen har potensiale til å tjene som et point-of-care hurtig influensa diagnostisk test.
Introduction
Influensa virus infeksjoner resultere i en betydelig mengde av sykelighet og dødelighet hvert år 1, 2, 3. Ukomplisert influensa er preget av konstitusjonelle og luftveissymptomer som feber, myalgi, hodepine, og ikke-produktiv hoste 4, 5. Eldre personer, små barn, immunsupprimerte pasienter og pasienter med underliggende komorbiditet er på et høyere risiko for alvorlige komplikasjoner som lungebetennelse, myokarditt, sentralnervesystemet sykdom eller død seks, syv.
Influensainfeksjon er unik fra andre luftveisvirus i at rask behandling med antiviral behandling innen 48 timer fra symptomdebut kan redusere sykdommens alvorlighetsgrad og lengde 8. Rask identifisering av influensa har også værtvist seg å redusere bruken av unødvendige antibiotika 9, 10. Videre må innlagte pasienter med influensa infeksjoner plasseres i isolert rom med passende smittevern forholdsregler. Imidlertid kan luftveissykdommer forårsaket av ikke-influensavirus være vanskelig å skille fra klinisk influensa. Av denne grunn er hurtig og nøyaktig diagnostisk testing for influensa meget viktig for klinisk behandling av pasienten.
Flere analyser er tilgjengelige for påvisning og identifisering av influensavirus. Rapid influensa antigendeteksjon tester (RIDTs) er mye brukt i klinisk praksis som point-of-care testene fordi de er enkle å bruke og gir resultater innen 15 til 30 min 11, 12; Men deres følsomhet varierer mye (10-80%), avhengig av produsent og befolkningen blir testet, og influensa type og subtype 13, 14, 15. Direkte fluorescensanalyser (DFAs) gir overlegen følsomhet enn RIDTs, men behandlingstiden er større (~ 3 timer) og må fullføres av dyktige teknologer 16, 17. Viral kultur har vært gullstandarden for influensadiagnose og har forbedret følsomhet over begge RIDTs og DFAs 18. Imidlertid kan influensa viral kultur ta alt 2-14 d å fullføre, avtagende sin nytteverdi i å hjelpe pasientbehandling 19. Endelig har nukleinsyreamplifikasjonsmetoder tester (NAAT) erstattet kultur teknikker som den nye gullstandarden i influensadiagnostikk. NAAT anses å ha størst følsomhet for påvisning av influensa i et par timer. Men NAAT er de dyreste analyser og krever spesialutstyr og teknologer for å utføre 5
Influensa A og B analyse beskrevet her er den første CLIA-fravikes molekyl hurtig influensa test som er lett tilgjengelig. Denne analysen fungerer ved å ansette en knekk Endonuklease Amplification Reaction (NEAR) som bruker isotermisk forsterkning med influensaspesifikke primere etterfulgt av mål deteksjon med molekylære beacon sonder. Denne analyse skiller influensa A fra B, krever 2 min for å sette opp og behandle en prøve, og krever totalt 15 minutter å fullføre.
Her presenterer vi protokollen for Influensa A & B-analysen. I tillegg gir vi en prøve datasett sammenligne resultatene av influensa A og B-analyse på arkiverte nasofaryngeal pinne (NPS) eksemplarer lagret i virustransportmedium (VTM) til et annet luft assay patogen panel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ETIKK UTTALELSE: Bruken av venstre-over kliniske prøver er godkjent og følger retningslinjene for Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review Board.
1. Før Kjøre analysen
MERK: Influensa A og B-analysen er godkjent for nasofaryngeale penselprøver og for nasofaryngeale kompresser som er lagret i virustransportmedium. Vattpinner er inkludert i settet og bør brukes for optimal ytelse. Imidlertid, rayon, skum, strømmet spinner eller polyester neseutstryk kan også brukes til å samle inn nesepenselprøver.
- Å samle en prøve nesepinne, sett pinnen inn i neseboret som har den mest synlige drenering eller som er mest trafikk. Med milde rotasjon, trykk pinnen inn i neseboret til møter motstand og rotere flere ganger mot neseveggen før sakte fjerner fra neseboret. Oppbevar vattpinner og transportere dem i hetteglass som inneholder 3 ml viral transport media (VTM).
MERK: Omsorgen for approprIate prøvetaking må tas som utilstrekkelig prøvetaking kan gi feilaktige resultater.
MERK: prøver skal testes så snart som mulig etter samlingen. Imidlertid kan de lagres ved romtemperatur i opp til 2 timer eller i kjøleskap ved 2-8 ° C i opp til 24 timer hvis testing er ikke umiddelbart tilgjengelig. Fersk innsamlede prøvene er ideelle for optimal teste ytelsen. Feil prøvehåndtering, lagring og / eller transport kan gi feilaktige resultater.
MERK: Som et forebyggende tiltak, bør personer som utfører denne testen behandle alle prøver som potensielt smittefarlige ved å følge generelle forholdsregler ved håndtering av prøver. - Ta med alle prøvene til romtemperatur før testing.
MERK: Alle test komponenter er for engangsbruk, og bør ikke brukes til å utføre flere tester. Ikke bland kit komponenter fra forskjellige partinumre. Ikke bruk reagenser forbi sin utløpsdato. - Ta den blå prøven mottaker i Room temperatur før testing. Den oransje test base kan bli testet uten behov for å oppvarmes til romtemperatur.
- La alle prøvestykker i folie innpakning før umiddelbart før bruk. Slå på instrumentet ved å trykke på power-knappen på siden av instrumentet. Skriv inn bruker-ID og trykk "OK".
2. Kjøre Test
- Til å begynne testprosessen, trykker du på "Run Test 'på instrumentet skjermen. Skriv inn pasientens ID ved hjelp av skjermtastaturet eller strekkodeleser og trykk "OK". Åpne lokket og sett Orange test base i Orange test base holderen.
- Bekreft at den korrekte testen vises på skjermen, og trykk "OK". Sett den blå prøven mottakeren i den blå prøve mottaker holderen.
MERK: Ikke åpne prøven mottakeren før du legger i instrumentet da dette vil hindre elusjonsbuffer fra å nå riktig driftstemperatur og kan påvirke testprestasjoner. Vent på prøven mottaker for å varme opp. Når du blir bedt av instrumentet, fjern folien segl og legg pasienten pinne for å bli testet i prøve mottaker.
MERK: Når du fjerner folien, plasserer du to fingre på kanten av prøve Receiver for å sikre at den holder seg på plass. - Kraftig blande pinnen i væsken i 10 sek, trykke hodet pinnen mot siden prøven mottaker som du blander det for å løsne prøven fra pinnen. Trykk OK for å fortsette. Hvis testing vattpinner lagret i virustransportmedium, vortex VTM i 10 sek deretter legge 200 ul til prøven mottaker.
- Trykk den hvite overføring kassetten inn i blå prøven mottaker. Fortsett å trykke på prøven mottakeren til den oransje indikatoren stiger.
- Løft og koble deretter overføre patronen til test base. Observere den oransje indikatoren stige når kassetten overføringen er riktig montert. Lukk lokket og ikke åpne før "Test Complete"Meldingen vises på skjermen.
3. Quality Control
- Trykk "Kjør QC Test" på startskjermen. Velg QC Test skal kjøres. Bekreft testtype for å matche QC prøve beregnet for testing ved å trykke "OK" og følge instruksjonene på skjermen for å fullføre testing.
4. Resultat Tolkning
- Etter testkjøringen er fullført, observere resultatene av testen som vises på skjermen med tolkninger for tilstedeværelsen av influensa A, B, ukjente subtyper. For ugyldige resultater gjenta testen.
5. Vedlikehold og rengjøring
- Rengjør apparatet og det omkringliggende benk området daglig med 70% etanol eller 10% blekemiddel. Spray rengjøringsmiddelet på en fuktig, lofri klut til å rengjøre. Ikke hell løsningene direkte på instrumentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble arkivert NPS prøver samlet inn fra inneliggende pasienter presenterer med influensalignende symptomer på Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) under en influensa utbrudd mellom 15 desember 2012 og 1. mars 2013. NPS prøvene ble sendt inn i 3 ml av VTM og testet som del av rutinemessig klinisk praksis med et molekylært assay som oppdager et panel av respiratoriske virus (RP), inkludert Influensa A, A-1, A-3, og B. i løpet av studieperioden ble 3,675 NPS prøver innsendt til den MSKCC kliniske laboratorium for testing. Av disse prøver, 45, 425, 37, og 77 testet positivt for influensa virus A-1, A-3, A-un-subtypable (Au), og B, henholdsvis med RP. Totalt 360 positive prøver, 40 prøver fra hver av de influensa subtyper, og 37 Au. I tillegg ble 1-2 negative prøver som kom til laboratoriet umiddelbart før eller etter hver av de positive prøvene er valgt for påfølgende testing med influensa A og B assay.
Totalt influensa A og B-analysen oppdaget 79 influensavirus A, 37 influensavirus B, 240 negative, og 4 ugyldige resultater (svikt i internkontrollen) (tabell 1). Det var 46 avvikende resultater med 44 prøver positive på RP bare og to positive på influensa A og B analysen bare. En tredje molekylær-baserte influensa analyse ble utført på de 44 prøvene som uharmoniske detekterte 33/43 (8 influensavirus A, 21 Au, og to influensavirus B) som var positive ved RP og 0/1 positive (influensavirus A) av influensa A og B assay. En avtale mellom to eller flere analyser ble ansett som en nøyaktig identifikasjon.
Den generelle Influensa A og B analysefølsomhet for total influensavirus A var 67,5% (95% CI (CI), 56,6 til 78,5). Følsomheten for influensa A subtyper var A-1, 84,6% (CI, 58,5 til 100), A- 3, 90,2% (CI, 62,8 til 100), og Au, 21,9% (CI, 19,6 til 24,1). Den samlede spesifisitet for influensavirus A var 86,9% (CI, 71,0 til 100). For influensavirus B-testing, sensitivitet og spesifisitet var 90,2% (CI, 68,5 til 100) og 98,8% (CI, 68,5 til 100), henholdsvis.
Totalt sett gjennomsnitts CT verdiene i prøver med uharmoniske resultater var betydelig høyere enn de som oppnås ved samstemmige resultater (16,4 ± 0,48 vs. 25,7 ± 0,51; p> 0,000) (figur 1).
Figur 1: Gjennomsnittlig CT-verdier bestemt ved RP-analysen for prøver som var positive og negative, henholdsvis ved analysen for hver influensa subtype. Feilfelt representerer standardavvik. **, P <0,01; *** P <0,001.1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Resultater av Influensa A & B på VTM eksemplarer sammenlignet med referanse resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Influensavirus er betydelige globale årsaker til sykelighet og dødelighet. Rask og nøyaktig diagnose av influensa er en av de viktigste nøklene til styring av influensa respiratorisk utbrudd i løpet av sesongen. Andre antigen-baserte tester er rask og enkel å utføre; men de har lav følsomhet 13. På den annen side har tradisjonelle molekylære tester forbedret følsomhet, men krever mer erfarne laboratorie teknologer å utføre, og er mer kostbare. Den Influensa A og B analysen beskrevet i denne studien, og protokollen er en CLIA-fravikes, rask molekylær test for influensa A og B. Teknologien er basert på en isoterm-forsterkning for påvisning og differensiering av influensavirus A og B. Vi viser representative resultater for å demonstrere utførelsen av influensa A og B assay på et panel av arkiverte, frosne NPS VTM prøver ble evaluert sammenlignet med en annen molekyl-baserte analysen respiratorisk panel.
C-T-verdier i RP-analyser, tyder på at den nedre deteksjonsraten av analysen ble forbundet med de nedre virale titere. Analysen hadde en forbedret ytelse for påvisning av influensavirus B over influensavirus A deteksjon med en 90,2% sensitivitet og 98,1% spesifisitet. Resultatene her er i overensstemmelse med tidligere publiserte litteratur 26, 27, 28.
Denne studien har to viktige begrensninger. For det første prøver ble lagret i VTM for å teste på plattformen. Imidlertid, på det tidspunkt prøvene ble testet, er plattformen ikke har FDA-godkjenning for denne prøvetype. Derfor er den fortynning i VTM, kan ha redusertdeteksjonen av lav-titer VTM prøver. For det andre prøvene som ble testet med influensa A og B analyse var blitt lagret ved -70 ° C i 6 til 9 måneder før testing, mens RP-testing ble utført på friske prøvene umiddelbart etter at de ble mottatt. Det er mulig at frysing prøvene ytterligere redusert influensa deteksjon i prøvene.
Influensa A og B assay har få trinn og er enkel å utføre. Men det er to viktige skritt som må fullføres på riktig måte, og at brukere kan feilsøke hvis de opplever feil. Først under konfigureringen av analysen, overføring patronen må være koblet til testen basen til de klikker på plass. Hvis disse to delene ikke er festet på riktig måte, vil den løpe mislykkes og må gjentas fra begynnelsen. For det andre, må instrumentet for å varme opp i 2 min før tilsetning av prøven. Etter denne varme opp tid, brukerne har 30 sekunder å legge prøven, kobler overføringen cartridge til test base, og lukk lokket. Hvis tiden går før dette trinnet er fullført, vil instrumentet mislykkes kjøringen og prøven satt opp må gjentas fra begynnelsen.
Begrensningene for analysen inkluderer noe økt hands-on tid og lavere følsomhet i forhold til luft panelet og som ikke undertype influensa A. Videre, de eneste prøvetyper som kan brukes med analysen er nasofaryngeale spinner eller NPS som er lagret i virustransportmedium; resultatene av analysen for noen annen prøvetype, slik som lavere respiratoriske prøver, ikke har blitt evaluert. Det er viktig å merke seg at alle trinnene i denne protokollen er kritiske. Eventuelle endringer eller avvik fra protokollen som er skrevet kan føre til lavere ytelse eller av analysen og må vurderes av brukeren. Fordelen med teknologien er at instrumentet har en liten plass, tar bare 15 minutter å utføre, og selv om teknologiener basert på molekylære metoder, krever ikke spesiell opplæring eller kompetanse til å utføre. Influensa A og B assay undersøkt i denne undersøkelsen har potensiale til å tjene som et alternativ til RIDTs for diagnose av influensa. Systemet har fordelen av en kort total testtid, har en liten plass og er lett å bruke. Totalt sett, er utformingen av apparatet er egnet for point-of-care testing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
| Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
| Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
| Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
| 200 µl precision pipette | |||
| 200 µl disposable pipette tips | |||
| Viral transport medium | Remel | M4-RT |
References
- Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
- Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
- Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
- Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
- Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
- Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
- Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
- Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
- Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
- Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
- Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
- van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
- Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
- Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
- Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
- Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
- Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
- Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244 (2010).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
- Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
- Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
- Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
- Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
- Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
- Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
- Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
- Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).
