Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Høy throughput Gene Tagging i Published: August 12, 2016 doi: 10.3791/54342
Automatic Translation
1, 1, 1
1Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford

Introduction

Trypanosoma brucei er en protozo parasitten som forårsaker menneskelig afrikanske trypanosomasis og nagana hos storfe. T. brucei er en ideell organisme for analyse av protein funksjon på grunn av kombinasjonen av høy kvalitet genomet, mange proteomforskning og transcriptomics datasett og vel utviklede molekylære verktøy 1-3. Fremskritt innen proteomikk og sekvensering har resultert i store datasett som synliggjør potensielt interessante gener 4-6; imidlertid mange gener har minimal informasjon assosiert med dem i de eksisterende databaser. Det er derfor et behov for en high-throughput-metoden for å hjelpe til protein funksjonell karakterisering.

Ekspresjon av et merket protein som kan gi en flerhet av innsikt i en proteinets funksjon. For eksempel kan et protein merket med en fluorescerende protein eller epitop lokaliseres ved fluorescens mikroskopi, som gir informasjon om hvor protein kan utøve sin biologiske effekt. Alternativt, et protein merket med en TAP 7, HaloTag 8 eller His tag kan renses for biokjemiske analyser og identifisering av sine interaksjonspartnere.

Vi har nylig utviklet en robust merking metodikk for T. brucei 9. Dette pleide lang primer PCR for å generere DNA for transfeksjon og tillot merking av dusinvis av proteiner i parallell - en stor forbedring til eksisterende protokoller. Vi har nå forbedret skalerbarhet av denne protokollen i procyclic former av en størrelsesorden. Her presenterer vi vår metode hvor vi utføre PCR og transfeksjon inn i 96-brønners plater, med utvinning og seleksjon forekommer i 24-brønners plater. Som hundrevis av proteiner kan nå merkes parallelt denne metoden gir en kostnadseffektiv og gjennomførbare metoden for merking hele trypanosom genom.

Protocol

1. 96-brønn Long Primer PCR

  1. Pre-freeze 96-brønns PCR kjøligere i -80 ° C fryser.
  2. I en 10 ml tube, forberede Master Mix A: 2100 mL DDH 2 O, 105 mL PCR klasse DMSO, 105 mL 10 mM dNTP, 105 mL pPOT mal (25 ng / mL) 9, for et totalt volum på 2415 mikroliter per plate .
  3. Alikvoter 23 ul i hver brønn av en 96-brønners PCR-plate.
  4. Tilsett 2 mL av 100 mikrometer sammenslåtte primere til hver lastet brønn med P20 12 kanal multikanalspipette. Forsegl med film, sted plate på forhånd avkjølt PCR kjøler og tillater å fryse i minst 20 minutter ved -80 ° C.
  5. I et 10 ml rør, forberede Master Mix B: 2048 pl DDH 2 O, 525 ul 10 x buffer, 52,5 pl polymerase for et totalvolum på 2626 pl per plate.
  6. Fjern plate og PCR kjøligere fra -80 ° C fryser.
  7. Med platen fortsatt på PCR kjøler, tilsett 25 ul Blanding B master på toppen av frøsn Master Mix A for et totalt reaksjonsvolum på 50 ul. Dette er tidskritisk, og skal være ferdig før Mix A kan tine. Tett plate med film.
  8. Satt thermal cycler som følger: 94 ° C i 10 min, deretter 30 sykluser ved 94 ° C i 15 sek, 65 ° C i 30 sek, 72 ° C i 2 minutter etterfulgt av en endelig forlengelse periode på 72 ° C i 7 min .
  9. Last PCR-platen etter at blokken har nådd 94 ° C.

2. Validering av 96 brønner Long Primer PCR

  1. Støpes et stort 1% (w / v) agarosegel i Tris-acetat-EDTA (TAE) rennende buffer med 4 x 28-brønners kammer for å gi en gel med 4 rekker av brønner. Rett alternative tennene på kammen med tuppen av en 12 kanals multikanalspipette. senk forsiktig gelen i TAE buffer etter banene er lastet.
  2. Load en kb DNA stige inn i 1. og 28. godt av hver rad.
  3. Ved hjelp av en P20 12 kanal multikanalspipette, overføre 2 mL av PCR-produktet directly til hver kolonne av gelen (figur 1A). Gjør dette raskt for å redusere muligheten for å forurense amplikonene.
    1. Last PCR produktene fra rad A av PCR-platen inn i oddetalls baner av første rad av gel (A1 - spor 3, A2 - kjørefelt fem ...... A11 - lane 23, A12 - lane 25) og laste PCR-produkter fra rad B av PCR-platen inn i partalls baner av en st raden i gel (B1 - lane 4, A2 - spor 6 ...... B11 - lane 24, B12 - lane 26).
    2. Last PCR produktene fra rad C og D av PCR-platen med samme mønster som beskrevet ovenfor, med rad C i oddetalls baner og rad D i partalls baner. Fortsett denne lasting mønsteret til hver brønn av PCR-plate er lastet på gelen. DNA lasting buffer er ikke nødvendig å laste denne gel.
  4. Plasser gelen inn i driften tanken og fyll tanken med TAE buffer inntil gelen er under vann. Kjør på 100 V i 30 min ogvisualisere ved hjelp av en UV transilluminator. Se figur 1B for eksempel et gel.
    Merk: PCR-produkter kan oppbevares ved -20 ° C i flere uker før transfeksjon

3. 96-brønn Transfeksjon

  1. Bruk T. brucei procyclic skjema cellelinje SMOXP9 10 for denne prosedyren og vokse i SDM-79 media som inneholder 10% FCS 10.
  2. Bruke 1 x 10 7 celler pr transfeksjon (totalt 1,1 x 10 9 celler) når merking på N-terminalen av proteinet, og 2 x 10 7 celler pr transfeksjon (totalt 2,2 x 10 9 celler) når merking på den C-terminale ende av proteinet. Opprettholde cellene i midt-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 celler / ml) i flere dager før transfeksjon og høste celler for transfeksjon ved en tetthet på 5-8 x 10 6 celler / ml.
  3. Tillat frosne PCR-produkter for transfeksjon for å tine ved romtemperatur.
  4. Telle celler ved hjelp av en hemdelenocytometer eller automatisk celleteller.
  5. Pellet nødvendige antall celler i flere 50 ml rør ved 800 xg i 10 min.
  6. Etter sentrifugering Fjern supernatant og resuspender cellene i 10 ml modifisert cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM kaliumfosfatbuffer pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl2, 0,5% (vekt / volum) glukose, 100 ug / ml BSA, 1 mM hypoxantin, 144 mM sakkarose) per rør. Overføre alle celle oppløsninger til et enkelt rør og spinne igjen ved 800 xg i 10 min.
  7. Etter sentrifugering kast supernatant og resuspender cellene i 23 ml av modifisert cytomix for en endelig konsentrasjon på 5 x 10 7 celler / ml.
  8. Mens celler blir sentrifugering, tilsett 1 ml av SDM-79 media til hver brønn av 4 x 24-brønners vevskulturplater. Label plater AD og tegne en ring rundt brønn A1 på hver plate i permanent markør for å hjelpe plate orientering.
  9. Koble plate behandleren til electroporator. På electroporator enhet satt spenningen til 1500 V, pulslengden til 100 usek og antall pulser til 12 og pulsintervall til 500 msek. På plate behandleren, setter pulstelling til 1. Dette sikrer at det electroporator vil gjelde en enkelt puls til hver av de 12 kolonnene i electroporation platen.
  10. Ved hjelp av en P200 12 kanal multikanal pipette, overføres PCR-reaksjonene fra PCR-platen til 96-brønners plater engangs electroporation, 4 mm åpning.
  11. Når cellene er blitt spunnet og resuspendert til den endelige konsentrasjon på 5 x 10 7 celler / ml (trinn 3.7), overføring til et reagens reservoaret. Pipetter 200 mL av celleløsning i hver brønn av electroporation platen ved hjelp av en P200 12 kanal multikanalspipette, bland med PCR-produkt ved pipettering.
  12. Ved hjelp av vev fjerne eventuelle dråper fra toppen av platen for å unngå kortslutninger.
  13. Anvende forseglingsfilmen anordnet i platen emballasjen til toppen av elektroporering plate, positioning det slik at det etterlates hullene for elektrodene avdekket ved toppen og bunnen av hver kolonne. Unngå å dekke de opphøyde punkter som brukes til å veilede filmen.
  14. Last elektroporeringsmetoden plate til plate handler og lukke lokket. Trykk på 'Pulse "på electroporator enhet.
  15. Etter elektroporering, raskt overføre cellene fra den 96-brønns plate electroporation til 4 x 24-brønners vevskulturplater. For å overføre celler, bruk en P200 12 kanal multikanalspipette med alle andre tips mangler slik at de resterende 6 tips linje med 6 rader på en 24-brønns vevskultur plate. Overfør de elektroporerte cellene i 96-brønners plater i electroporations forhåndsdefinert mønster til de 24-brønners vevskulturplater (figur 2A).
  16. Forbered P200 pipettespisser - for hver 96-brønn transfeksjon forberede 2 bokser av 96 tips med alle andre kolonne fjernet.
    1. Overfør brønner A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 på 96-brønners electroporation plate tilplate En rad A i 24-brønners vevskulturplater, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 inn i rad B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 inn i rad C og D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 inn i rad D. Etter overføring av hvert sett av brønner 6 fra den 96-brønns plate til den 24-brønns plate, er brønnene i 96-brønns plate ble deretter vasket med mediene fra de tilsvarende brønner i 24- brønn plate og vaske overføres så tilbake til brønnene i 24-brønns plate.
    2. Overfør brønner E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 på 96-brønners electroporation plate til 24-brønns plate B rad A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 i rad B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 i rad C og H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 i rad D. Etter overføring av hvert sett av brønner 6 fra den 96-brønns plate til den 24-brønns plate, brønnene i 96 -godt plate ble deretter vasket med mediene fra de tilsvarende brønner i 24-brønners plate, og vaske overføres så tilbake til brønnene i 24-brønns plate.
    3. Overføring av brønnene A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 på 96-brønners plate elektroporering til 24-brønns plate C rad A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 inn i rad B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 inn i rad C og D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 inn i rad D. Etter overføring av hvert sett av 6 brønner fra 96 -godt plate til den 24-brønns plate, er brønnene i 96-brønns plate ble deretter vasket med mediene fra de tilsvarende brønner i 24-brønners plate, og vaske overføres så tilbake til brønnene i 24-brønns plate.
    4. Overføring av brønnene E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 på 96-brønners electroporation plate til 24-brønns plate D rad A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 inn i rad B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 inn i rad C og H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 i rad D. Etter overføring av hvert sett av brønner 6 fra den 96-brønns plate til den 24-brønns plate, brønnene i 96 -godt plate ble deretter vasket med mediene fra de tilsvarende brønner i 24-brønners plate, og vaske overføres så tilbake til brønnene i 24-brønns plate.
  17. Ved hjelp av et invertert fasekontrastmikroskop, undersøke en brønn fra hver kolonne for å kontrollere cellene. Det vil være en blanding av levende og døde celler medbetydelig mengde av cellerester. Levende celler kan skilles fra døde celler, fordi de vil være lys i henhold til fasekontrastmikroskopi, og vil være i bevegelse.
  18. Plasser 24-brønners plater i en ren, plastboks med et lokk som danner en tett forsegling. Sett boksen i en 28 ° C inkubator.
  19. Mellom 6-8 timer senere, tilsett 1 ml SDM-79 med 10% FCS inneholdende 2 x selektive antibiotikum til hver brønn. I vår erfaring, cellelinjer hvor genene er merket på N endestasjonen er motstandsdyktig mot høyere konsentrasjoner av selektiv narkotika. Derfor bruker blasticidin som et eksempel, merking på den N-terminale ende krever en sluttkonsentrasjon på 20 ug / ml blasticidin og merking på den C-terminale ende krever en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml blasticidin.
    Merk: Transgene cellelinjer blir synlige 9-10 dager etter transfeksjon.
  20. Passasje i det minste to ganger i friskt medikament og media før analysen. Figur 2B viser resultatene fra en typisk 96-brønners transfeDette skjer for tagging 96 ulike proteiner på N-terminalen. Vurdere hver brønn ved fasekontrastmikroskop for å finne ut om det inneholder sunne, narkotika resistente celler. En sunn brønn inneholder hovedsakelig (<95%) svært aktive celler som er lyse i fase kontrakt mikroskopi. Etterfølgende analyse av epifluorescens mikroskopi eller western blot er nødvendig for å bestemme om proteinet har blitt merket.

Representative Results

I denne representative transfeksjon ble primere designet med TagIt perl script 9 og syntetisert kommersielt. 96-brønners PCR ble utført og validert som beskrevet (figur 1A); i dette eksempel, 95/96 PCR var vellykket (figur 1B). I vår erfaring, gjenta mislykkede reaksjoner enten med de opprinnelige primere eller re-syntetisert primere ikke resulterer i en vellykket PCR.

De amplikonene ble overført til 96-brønners plater for electroporation elektroporering (figur 2A) og deretter overført til 24-brønners kulturplater for gjenvinning og seleksjon. Etter tilstrekkelig tid til å tillate valg skal finne sted, ble brønnene mottok for overlevelse før ytterligere analyse. I dette eksemplet, 88/96 brønner (92%) var positive etter 15 dager utvalg.

"Figur Figur 1: Validering av lang primer PCR (A) Mønster for overføring av PCR-produkter fra 96-brønns PCR plate til agarosegel for validering av PCR.. (B) Et representativt 96-brønners PCR-validering gel for merking av 95 gener som på N-terminalen, og ett fragment som ikke inneholder noe 5 'målretting homologi til å fungere som en negativ kontroll i transfeksjon. Prøvene blir lastet på en 1% (w / v) agarosegel og løst ved 100 V i 30 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: 96-brønn electroporation og seleksjon (A) Mønster for overføring electroporated celler fra 96 brønner electroporation plat.e til 24-brønns vevskulturplater. (B) En skjematisk viser et typisk live / dead scoring etter 15 dager med utvalget i 24-brønners plater. Grønn representerer en vellykket transfeksjon, grått representerer et godt med bare døde celler. I dette eksempelet, 88/96 (92%) av brønner inneholdt vellykket transfektert parasitter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dramatiske forbedringer i følsomheten av proteomikk og transcriptomics metoder i de siste 5-10 årene har gitt verdifulle data på tusenvis av gener og deres produkter. Imidlertid verktøy for å ta opp funksjonen til disse proteinene ikke har holdt tritt.

Tagging et protein letter mange eksperimenter for å bestemme sin funksjon. For eksempel kan et protein bli fusjonert til en fluorescerende protein i en rekke forskjellige farger for å lette lokalisering og co-lokaliseringsstudier. Tags utviklet for elektronmikroskopi, som APEX2 eller miniSOG 11,12, la ultrastructural lokalisering av merket protein. Koder for biokjemi, som TAP-taggen, og ProtC-TEV-PROTA (PTP) tag 7,13 tillate rensing av komplekser forbundet med proteinet for å identifisere bindingspartnere eller in vitro biokjemiske analyser.

De konkrete tiltak som er avgjørende for å lykkes i protocol er: inkorporering av DMSO i PCR Master Mix 1, frysing av PCR Master Mix 1 før tilsetningen av Master Mix 2, bruk av den kommersielle polymerase i Master Mix 2 og modifikasjon av cytomix electroporation buffer. I vår erfaring, er det nødvendig å bruke doble antall celler for C-terminal tagging trans som for N-terminal tagging transfections for å oppnå en tilsvarende andel av positive brønner. Derfor skal alle trinnene utføres som beskrevet.

Denne teknikken er bare sannsynlig å være vellykket når trans insekt procyclic skjema trypanosom. Blodet former har en lavere transfeksjonseffektivitet 14, dessuten er de sannsynligvis til å dø i løpet av valget på grunn av tetthetsavhengig toksisitet som er relatert til den selektive stoffet. Derfor representerer vår forrige protokollen dagens beste teknologi for merking av blodet skjema trypanosomer 9. Det er også sannsynlig at transsjon effektivitet vil variere avhengig av den spesifikke trypanosom isolatet. Denne protokollen ble optimalisert ved hjelp av 927 SMOX procyclic former - andre stammer kan kreve ytterligere optimalisering. Tiltak som kan øke sannsynligheten for suksess omfatter: å øke mengden av PCR-amplikon, øke antall celler som inngår i transfeksjon.

Vi presenterer en metode der hundrevis av proteiner kan bli merket parallelt. Dette vil lette store studier på lokalisering og samhandling, supplerer eksisterende store datasett og gi uvurderlig informasjon til samfunnet. Primer maler er tilgjengelig på forespørsel og en liste over plasmider maler er tilgjengelig fra: http://www.sdeanresearch.com/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotide Life technologies na desalt only (do not use additional purification)
DMSO Roche Included with the Expand HiFi pack Must be PCR grade
dNTP any reputable
Expand HiFi polymerase Roche 11759078001
BTX ECM830 Harvard Apparatus Electroporator
HT-200 plate handler Harvard Apparatus HT-200 Handles the 96-well eletroplates
MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm Harvard Apparatus 45-0452 Electroplate for the 96-well electroporation
Blasticidin S Hydrochloride Melford 3513-03-9
Hygromycin b Gold Invivogen ant-hg-1
Phleomycin Melford P0187
225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap Appletonwoods BC006
24 well culture plates Appletonwoods BC017
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes Sigma Aldrich Z606634-1EA
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt Sarstedt 72.1979.203

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
  2. Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
  3. Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).
  4. Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
  5. Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
  6. Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
  7. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  9. Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197 (2015).
  10. Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037 (2012).
  11. Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
  12. Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
  13. Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
  14. Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).

Tags

Immunologi High-throughput endogene genet tagging PCR, 96-brønn elektroporering fluorescerende protein lokalisering
Høy throughput Gene Tagging i<em&gt; Trypanosoma brucei</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dyer, P., Dean, S., Sunter, J.… More

Dyer, P., Dean, S., Sunter, J. High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (114), e54342, doi:10.3791/54342 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter