Introduction
Trypanosoma brucei es un parásito protozoario que causa trypanosomasis africana humana y nagana en el ganado. T. brucei es un organismo ideal para el análisis de la función de la proteína debido a la combinación de un genoma de alta calidad, numerosos proteómica y conjuntos de datos transcriptómica y herramientas moleculares bien desarrollados 1-3. Los avances en la proteómica y la secuenciación han dado lugar a grandes conjuntos de datos que ponen de relieve los genes potencialmente interesantes 4-6; sin embargo, muchos genes tienen un mínimo de información asociada con ellos en las bases de datos existentes. Por tanto, existe una necesidad de un método de alto rendimiento para ayudar a la caracterización funcional de proteínas.
La expresión de una proteína marcada puede dar una multiplicidad de conocimientos sobre la función de una proteína. Por ejemplo, una proteína marcada con una proteína fluorescente o epítopo puede ser localizada mediante microscopía de fluorescencia, lo que da información acerca de dónde la protein podría estar ejerciendo su efecto biológico. Alternativamente, una proteína marcada con un TAP 7, 8 o HaloTag His se puede purificar para los ensayos bioquímicos y la identificación de sus compañeros de interacción.
Recientemente hemos desarrollado una metodología robusta para el etiquetado T. brucei 9. Este utilizado durante mucho tiempo cebador de PCR para generar el ADN para la transfección y permitió que el marcaje de proteínas de docenas en paralelo - una mejora importante de los protocolos existentes. Ahora hemos mejorado la escalabilidad de este protocolo en formas procíclicas en un orden de magnitud. A continuación, presentamos nuestro método en el que llevamos a cabo la PCR y la transfección en placas de 96 pocillos, con la recuperación y la selección se produce en placas de 24 pocillos. Como cientos de proteínas ahora se pueden etiquetar de forma paralela este método proporciona un método rentable y viable para etiquetar todo el genoma tripanosoma.
Protocol
1. 96 pocillos largo cebador de PCR
- Pre-congelación enfriador 96 pocillos PCR en -80 ° C congelador.
- En un tubo de 10 ml, preparar Master Mix A: 2100 ddH l 2 O, 105 l PCR grado DMSO, 105 l dNTPs 10 mM, 105 l plantilla pPot (25 ng / l) 9, para un volumen total de 2415 l por placa .
- Alícuota de 23 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR.
- Añadir 2 l de 100 mM agrupados cebadores para cada uno cargado también con una pipeta multicanal P20 de 12 canales. Sellar con la película, placa lugar en el enfriador de PCR previamente enfriado y dejar que se congele durante un mínimo de 20 min a -80 ° C.
- En un tubo de 10 ml, preparar Master Mix B: 2,048 l ddH 2 O, 525 l de 10x tampón, 52,5 l de la polimerasa para un volumen total de 2626 l por placa.
- Retire la placa y el refrigerador de PCR a partir del congelador a -80ºC.
- Con la placa todavía en el enfriador de PCR, se añaden 25 l Master Mix B en la parte superior de la congelón Master Mix A para un volumen total de reacción de 50 l. Este es el tiempo crítico, y debe ser completado antes de la mezcla A puede descongelarse. Sellar la placa con película.
- Conjunto termociclador de la siguiente manera: 94 ° C durante 10 min, luego 30 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 65 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 2 min seguido de un periodo de extensión final de 72 ° C durante 7 min .
- Cargar la placa de PCR que el bloque haya alcanzado 94 ° C.
2. Validación de 96 pocillos a largo cebador de PCR
- Reparto de un gran 1% (w / v) en gel de agarosa en Tris acetato EDTA (TAE) tampón de ejecución con peines de 4 x 28 pocillos para dar un gel con 4 filas de pocillos. Alinear los dientes suplentes del peine con la punta de una pipeta multicanal de 12 canales. Sumerja con cuidado el gel en TAE funcionamiento de amortiguación después de que los carriles están cargados.
- Cargar escalera de ADN de 1 kb en la 1ª y 28ª pocillo de cada fila.
- Con una pipeta multicanal P20 de 12 canales, transferir 2 l de producto de PCR dirrectamente a cada carril del gel (Figura 1A). Hacer esto de manera rápida para reducir la posibilidad de contaminación de los amplicones.
- Cargar los productos de PCR de la fila A de la placa de PCR en las pistas impares de la fila 1 del gel (A1 - carril 3, A2 - carril 5 ...... A11 - carril 23, A12 - carril 25) y cargar los productos de PCR de la fila B de la placa de PCR en los carriles pares del st fila del gel 1 (B1 - carril 4, A2 - carril 6 ...... B11 - carril 24, B12 - carril 26).
- Cargar los productos de PCR de la fila C y D de la placa de PCR utilizando el mismo patrón que se ha descrito anteriormente, con la fila C en el carril numeradas y la fila D extraña en los carriles de número par. Continuar este patrón de carga hasta que cada pocillo de la placa de PCR se carga en el gel. tampón de carga de DNA no es necesaria para cargar este gel.
- Colocar el gel en el tanque de correr y llenar el tanque con TAE tampón de ejecución hasta que se sumergió el gel. Ejecutar a 100 V durante 30 min yvisualizar utilizando un transiluminador UV. Véase la Figura 1B para un gel de ejemplo.
Nota: Los productos de PCR se pueden almacenar a -20 ° C durante varias semanas antes de la transfección
3. La transfección de 96 pocillos
- Utilice la T. brucei línea celular de forma procíclica SMOXP9 10 para este procedimiento y crecer en SDM-79 medio que contiene FCS al 10% 10.
- Utilice 1 x 10 7 células por transfección (total de 1,1 x 10 9 células) cuando se marcan en el extremo N de la proteína y 2 x 10 7 células por transfección (un total de 2,2 x 10 9 células) cuando se marcan en el extremo C terminal de la proteína. Mantener las células en mid-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 células / ml) durante varios días antes de la transfección y cosechar las células para la transfección a una densidad de 5-8 x 10 6 células / ml.
- Permitir a los productos de la PCR para la transfección congelados se descongelen a temperatura ambiente.
- Recuento de células usando un hemoocytometer o contador de células automático.
- Pellet requerido número de células en múltiples tubos de 50 ml a 800 xg durante 10 min.
- Después de sobrenadante de centrifugación de descarte y resuspender las células en 10 ml Cytomix modificado (EGTA mM 0,8 mM, KCl 24, 0,15 mM CaCl 2, 10 mM de tampón de fosfato de potasio pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl 2, 0.5% (w / v) de glucosa, 100 mg / ml BSA, hipoxantina 1 mM, sacarosa 144 mM) por tubo. Transferencia de todas las soluciones de células a un solo tubo y girar de nuevo a 800 xg durante 10 min.
- Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 23 ml de Cytomix modificado para una concentración final de 5 x 10 7 células / ml.
- Mientras que las células están girando, añadir 1 ml de SDM-79 medios de comunicación a cada pocillo de placas de cultivo de tejido de 4 x 24 pocillos. Etiquetar las placas de AD y dibujar un anillo alrededor pocillo A1 en cada plato con un marcador permanente para ayudar orientación de la placa.
- Conectar el controlador de placa a la electroporador. En la electroporaunidad tor ajustar el voltaje a 1500 V, la longitud del pulso de 100 microsegundos y el número de impulsos a 12 y el intervalo de impulso de 500 ms. En el controlador de placa, establecer el cómputo de impulsos a 1. Esto asegura que que electroporador se aplicará un pulso único a cada una de las 12 columnas de la placa de la electroporación.
- El uso de un P200 12 pipeta multicanal canal, la transferencia de las reacciones de PCR de la placa de PCR a las placas de 96 pocillos de electroporación desechables, brecha 4 mm.
- Cuando las células se han hecho girar y se resuspendieron a la concentración final de 5 x 10 7 células / ml (paso 3.7), transferir a un depósito de reactivo. Pipetear 200 l de la solución de células en cada pocillo de la placa de electroporación usando un P200 12 canal pipeta multicanal, mezclar con el producto PCR mediante pipeteo.
- El uso de tejido a eliminar cualquier gota de la parte superior de la placa para evitar cortocircuitos.
- Aplicar la película de sellado proporcionada en el envase placa a la parte superior de la placa de la electroporación, positioning que a fin de dejar los orificios de los electrodos no cubierto en la parte superior e inferior de cada columna. Evitar cubrir los puntos planteados utilizados para guiar la película.
- Cargar la placa de electroporación en el controlador de la placa y cierre la tapa. Pulse 'Pulso' en la unidad electroporador.
- Después de la electroporación, transferir rápidamente las células de la placa de la electroporación de 96 pocillos a las placas de cultivo de tejido de 4 x 24 pocillos. Para transferir las células, utilizar una pipeta P200 12 canal multicanal con cada otra punta falta de tal manera que los 6 restantes puntas se alinean con los 6 filas en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Transferencia de las células electroporadas en las placas electroporaciones de 96 pocillos en patrón predefinido a las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Figura 2A).
- Preparar las puntas de pipeta P200 - para cada transfección de 96 pocillos preparar 2 cajas de 96 puntas con cada otra columna eliminado.
- pozos de transferencia A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 de la placa de electroporación de 96 pocillos aLa placa A la fila A de las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 en la fila B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 en la fila C y D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 en la fila D. Después de la transferencia de cada grupo de 6 pocillos de la placa de 96 pocillos a la placa de 24 pocillos, los pocillos en la placa de 96 pocillos se lavan a continuación con los medios de los pocillos correspondientes en el 24- así placa y el lavado se transfirieron de nuevo a los pozos de la placa de 24 pocillos.
- pozos de transferencia E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 en la placa de electroporación de 96 pocillos a 24 pocillos placa B fila A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 en la fila B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 en la fila C y H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 en la fila D. Después de la transferencia de cada conjunto de 6 pozos de la placa de 96 pocillos de la placa de 24 pocillos, los pozos en el 96 placa -bien se lavan entonces con medios de los pocillos correspondientes en la placa de 24 pocillos y el lavado se transfiere de nuevo a los pocillos en la placa de 24 pocillos.
- pozos de transferencia A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 de la placa de electroporación de 96 pocillos a 24 pocillos placa C la fila A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 en la fila B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 en la fila C y D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 en la fila D. Después de la transferencia de cada conjunto de 6 pozos desde el 96 -bien placa a la placa de 24 pocillos, los pozos de la placa de 96 pocillos se lavan a continuación con los medios de los pocillos correspondientes de la placa de 24 pocillos y el lavado se transfiere de nuevo a los pozos de la placa de 24 pocillos.
- pozos de transferencia E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 en la placa de electroporación de 96 pocillos a 24 pocillos placa D fila A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 en la fila B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 en la fila C y H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 en la fila D. Después de la transferencia de cada conjunto de 6 pozos de la placa de 96 pocillos de la placa de 24 pocillos, los pozos en el 96 placa -bien se lavan entonces con medios de los pocillos correspondientes en la placa de 24 pocillos y el lavado se transfiere de nuevo a los pocillos en la placa de 24 pocillos.
- Utilizando un microscopio de contraste de fase invertida, así examinar 1 de cada columna para comprobar las células. Habrá una mezcla de células vivas y muertas con unacantidad sustancial de los restos celulares. Las células vivas se pueden distinguir de las células muertas, ya que será brillante bajo un microscopio de contraste de fase y se mueve.
- Colocar las placas de 24 pocillos en una caja limpia, de plástico con una tapa que forma un sello hermético. Ponga la caja en un 28 ° C incubadora.
- Entre 6-8 horas más tarde, añadir 1 ml de SDM-79 con 10% de FCS que contiene el antibiótico selectivo 2x a cada pocillo. En nuestra experiencia, las líneas celulares donde los genes etiquetados en el extremo N terminal son resistentes a concentraciones más altas de la droga selectiva. Por lo tanto, el uso de blasticidin como un ejemplo, el marcado en el extremo N terminal requiere una concentración final de 20 mg / ml de blasticidina y etiquetado en el extremo C terminal requiere una concentración final de 10 mg / ml de blasticidina.
Nota: Las líneas celulares transgénicas serán visibles 9-10 días después de la transfección. - Passage al menos dos veces en fármaco fresco y medios de comunicación antes del análisis. La Figura 2B muestra los resultados de una típica transfe 96 pocilloscción para el marcado de 96 proteínas diferentes en el extremo N-terminal. Evaluar cada pocillo por microscopía de contraste de fase para determinar si contiene células sanas, resistentes a las drogas. Un bien sana contiene predominantemente (<95%) las células altamente activos que son brillantes en microscopía de contraste de fase. se requiere un análisis posterior por microscopía de epifluorescencia o transferencia de western para determinar si la proteína ha sido etiquetado con éxito.
Representative Results
En este transfección representativa, los cebadores se diseñaron utilizando la secuencia de comandos Perl TagIt 9 y sintetizados comercialmente. El 96 pocillos PCR se llevó a cabo y validó como se describe (Figura 1A); en este ejemplo, 95/96 PCR tuvieron éxito (Figura 1B). En nuestra experiencia, la repetición de las reacciones fallidas ya sea con los cebadores originales o re-sintetizado cebadores no da lugar a una PCR con éxito.
Los amplicones se transfirieron a placas de 96 pocillos de electroporación para la electroporación (Figura 2A) y después se transfirieron a placas de cultivo de 24 pocillos para la recuperación y selección. Después de tiempo suficiente para permitir la selección que se produzca, los pocillos se marcaron para la supervivencia antes de un análisis adicional. En este ejemplo, pozos 88/96 (92%) fueron positivos después de la selección de los 15 días.
Figura 1: Validación de PCR del patrón largo de imprimación (A) para la transferencia de productos de PCR de 96 pocillos placa de PCR para el gel de agarosa para la validación de PCR.. (B) A 96 pocillos gel representante validación de PCR para el marcado de 95 genes en el terminal N, y 1 amplicón no contiene 'homología 5 de orientación para actuar como un control negativo en la transfección. Las muestras se cargan en un 1% (w / v) en gel de agarosa y se resolvieron a 100 V durante 30 minutos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: de 96 pocillos electroporación y selección (A) Modelo para la transferencia de las células sometidas a electroporación de 96 pocillos plat electroporación.e a placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. (B) Un diagrama esquemático que muestra una puntuación típica en vivo / muerto después de 15 días de selección en placas de 24 pocillos. El verde representa una transfección exitosa, gris representa un pozo con sólo las células muertas. En este ejemplo, 88/96 (92%) de los pozos contenían parásitos transfectadas con éxito. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
mejoras dramáticas en la sensibilidad de la proteómica y transcriptómica métodos en los últimos 5-10 años ha proporcionado valiosos datos sobre miles de genes y sus productos. Sin embargo, las herramientas para hacer frente a la función de estas proteínas no han avanzado al mismo ritmo.
Etiquetar una proteína facilita numerosos experimentos para determinar su función. Por ejemplo, una proteína se puede fusionar a una proteína fluorescente en una variedad de diferentes colores para facilitar los estudios de localización y co-localización. Etiquetas desarrollados para microscopía electrónica, tales como APEX2 o miniSOG 11,12, permitir la localización ultraestructural de la proteína de la etiqueta. Etiquetas para la bioquímica, como la etiqueta TAP, y ProtC-TEV-ProtA (PTP) Marcar 7,13 permitir la purificación de complejos asociados con la proteína para la identificación de las parejas de unión o en ensayos bioquímicos in vitro.
Los pasos específicos que son críticos para el éxito de la protocol son: la incorporación de DMSO en la PCR Master Mix 1, la congelación de la PCR Master Mix 1 antes de la adición de la mezcla maestra 2, el uso de la polimerasa comercial en Master Mix 2 y la modificación de la memoria intermedia de Cytomix electroporación. En nuestra experiencia, es necesario usar el doble del número de células para C transfecciones terminal de marcado como para N terminal de transfecciones de etiquetado con el fin de lograr una proporción similar de los pocillos positivos. Por lo tanto, todos los pasos deben realizarse como se ha descrito.
Esta técnica sólo es probable que tenga éxito cuando la transfección de la forma de insecto tripanosoma procíclico. Formas sanguíneas tienen una menor eficiencia de transfección 14, por otra parte son propensos a morir durante la selección debido a la toxicidad dependiente de la densidad que no está relacionada con el fármaco selectivo. Por lo tanto, nuestro protocolo anterior representa la mejor tecnología actual para etiquetar de forma tripanosomas torrente sanguíneo 9. También es probable que el transeficiencia infección variará dependiendo del aislado tripanosoma específico. Este protocolo se ha optimizado el uso de 927 SMOX procíclico formas - otras cepas pueden requerir una optimización adicional. Medidas que pueden aumentar la probabilidad de éxito incluyen: el aumento de la cantidad de amplicón de PCR, el aumento del número de células incluidas en la transfección.
Se presenta un método donde cientos de proteínas se pueden etiquetar de forma paralela. Esto facilitará estudios a gran escala sobre la localización y la interacción, como complemento de grandes conjuntos de datos existentes y proporcionar información de gran valor para la comunidad. plantillas de cebadores están disponibles bajo petición y una lista de plantillas de plásmidos está disponible a partir de: http://www.sdeanresearch.com/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
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