Realizzazione di un UV-Vis e Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Sommario

Le sonde ottiche basate su nanoparticelle sono state progettate come veicolo per rilevare antigeni utilizzando la spettroscopia Raman e UV-Vis. Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di tali sonde per un test immunologico di spettroscopia UV-Vis/Raman in modo tale da incorporare future capacità di multiplexing.

Abstract

Immunodosaggi sono utilizzati per rilevare le proteine ​​in base alla presenza di anticorpi associati. A causa del loro ampio utilizzo nella ricerca e ambito clinico, una grande infrastruttura di strumenti e materiali immunodosaggio può essere trovato. Ad esempio, 96 e 384 e lastre di polistirene sono disponibili in commercio e hanno un design standard per ospitare ultravioletti visibile macchine spettroscopia (UV-Vis) di diversi produttori. Inoltre, una vasta gamma di immunoglobuline, tag di rilevamento, e agenti bloccanti per i disegni personalizzati per prove immunologiche come la metodica immunoenzimatica (ELISA) sono disponibili.

Nonostante l'infrastruttura esistente, i kit ELISA standard non soddisfano tutte le esigenze di ricerca, che richiede lo sviluppo immunologico individualizzato, che può essere costoso e richiede molto tempo. Ad esempio, i kit ELISA hanno bassa multiplexing (rilevamento di più di un analita in un momento) funzionalità come di solito dipendono fluorescenza o colmetodi orimetric per il rilevamento. Colorimetrici ed analisi fluorescenti a base hanno limitate capacità di multiplexing a causa di ampi picchi spettrali. Al contrario, Raman metodi spettroscopia basati hanno una maggiore capacità di multiplexing a causa di picchi di emissione strette. Un altro vantaggio della spettroscopia Raman è che i giornalisti Raman esperienza significativamente meno photobleaching di tag fluorescenti ^1. Nonostante i vantaggi che i giornalisti Raman hanno più tag fluorescenti e colorimetriche, protocolli per fabbricare test immunologici Raman-based sono limitati. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per preparare sonde funzionalizzati da utilizzare in combinazione con lastre di polistirene per il rilevamento diretto di analiti di analisi UV-Vis e spettroscopia Raman. Questo protocollo permetterà ai ricercatori di adottare un approccio fai-da-te per il futuro il rilevamento multi-analita mentre capitalizzando sulle infrastrutture prestabilito.

Introduzione

immunodosaggi panino tipici indirettamente rilevano la presenza di un antigene usando due anticorpi. L'anticorpo di cattura è legato ad una superficie solida e forma un complesso antigene-anticorpo quando in prossimità di un antigene appropriato. Un anticorpo di rilevazione viene quindi introdotto e si lega all'antigene. Dopo il lavaggio, i / antigene / anticorpo resti complessi di anticorpi e viene rilevato dal anticorpo di rilevazione etichettato come mostrato nella Figura 1A. Rilevamento Tipica è fatto da un rivelatore a fluorescenza o colorimetrico, limitando multiplexing a 10 analiti causa di ampi picchi spettrali ^2,3. Al cont....

Protocollo

1. Preparazione del buffer

1. Tampone fosfato (PBS)
   1. Diluire 50 ml di 10x PBS con 450 ml di acqua di grado HPLC per fare una concentrazione 1x PBS. filtro sterile la soluzione con un filtro di 0,22 micron.
   2. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.
2. Preparazione di Tris Buffered Saline + Tween 20 (TBST)
   1. Diluire 50 ml di 10x Tris Buffered Saline (TBS) con 450 ml di acqua di grado HPLC per fare una concentrazione 1x. Aggiungere 250 ml di Tween-20 per un 0,05% (v / v) di Tween-20. filtro sterile la soluzione con un filtro di 0,22 micron.
   2. Conservare a temperatura ambien....

Risultati

In questo studio, 60 particelle di oro nm sono stati usati per spettroscopia UV-Vis. UV-Vis spettri di assorbimento da 400 a 700 nm sono stati raccolti e le aree dei picchi per ciascuna concentrazione AUNP sono stati determinati utilizzando un sistema open source software di analisi spettrale ^8. Prima di picco integrazione, gli spettri raccolto subito correzione al basale utilizzando un polinomio tre punti. Aree dei picchi sono stati usati per generare una curva di calibrazione logaritmica come mostrato nella.......

Discussione

Nel protocollo dettagliato, ci sono diversi punti critici da affrontare. Un problema è la scelta di Raman giornalista e nanoparticelle d'oro. Anche se il protocollo è stato scritto per essere adattato per l'uso individuale, il giornalista Raman DTTC è stato utilizzato come esempio. DTTC è un reporter carico positivamente e si lega a superfici come citrato innevate AuNPs carica negativa. Questo protocollo può essere adattato per giornalisti caricati negativamente utilizzando nanoparticelle di oro con una carica s.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
60 nm Nanoparticella d'oro	Ted Pella, Inc.	15708-6	Queste sono nanoparticelle d'oro ricoperte di citrato. Si veda la discussione sulla relazione tra il reporter Raman e la carica di superficie AuNP e la sua importanza per la corretta selezione di AuNP e/o reporter Raman.
Bicarbonato di sodio	Fisher Scientific	S233-500
Metanolo	Pharmco-Aaper	339000000
Tris Soluzione salina tamponata (10x) pH 7,5	Scy Tek	TBD999
Unità di filtrazione per flaconi	VWR	97066-202
Tween 20 (polisorbato 20)	Scy Tek	TWN500	Utilizzato come agente emulsionante per le fasi di lavaggio.
Soluzione salina tamponata con fosfato 10x concentrato, pH 7,4	Scy Tek	PBD999
Protein LoBind Tube 2,0  Le	provette Eppendorf	ml 22431102	le provette LoBind impediscono il legame di proteine e AuNP alle superfici delle provette.
Proteina LoBind Tubo 0,5  Le	provette Eppendorf	ml 22431064	le provette LoBind impediscono il legame di proteine e AuNP alle superfici delle provette.
Dispositivi per micropiastre UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	Utilizzato per sigillare e conservare piastre funzionalizzate.
Piastra di analisi, con coperchio a bassa evaporazione, 96 pozzetti a fondo piatto	Costar	3370
Acqua di grado HPLC	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3′-dietiltiatricarbocianina ioduro (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Raman reporter
mPEG-Thiol, MW 5.000 - 1 grammo	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1  grammo	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA ha un'estremità NHS.
IgG di topo, controllo dell'intera molecola	Thermo Fisher Scientific	31903	Antigene
di capra anti-IgG di topo (H+L) Anticorpo secondario adsorbito incrociato	Thermo Fisher Scientific	31164	Anticorpo
Soluzione bloccante l'albumina sierica umana	Sigma Aldrich	A1887-1G	essere utilizzata in alternativa.
Mini centrifuga	Fisher Schientific	12-006-900
Spettrofotometro UV-Vis	Thermo Scientific Spettrofotometro	Nanodrop 2000c
	BioTek	Synergy 2
Colonne di desalinizzazione	Thermor Scientific	87766
Costruito internamente 785  Unità di microscopio Raman invertito nm	N/A	N/A	Un microscopio Raman invertito è il migliore per una corretta messa a fuoco sulla superficie della piastra a pozzetti. In caso contrario, verrà utilizzato un ingrandimento molto basso a causa dell'altezza della piastra a 96 pozzetti. È stato utilizzato un sistema costruito internamente in quanto era più economico rispetto all'acquisto da un fornitore. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi sistema di microscopio Raman invertito disponibile in commercio.

Può UV-Vis