Abstract
Los inmunoensayos se usan para detectar proteínas en base a la presencia de anticuerpos asociados. Debido a su amplio uso en la investigación y la práctica clínica, una gran infraestructura de los instrumentos y materiales de inmunoensayo se puede encontrar. Por ejemplo, 96 y 384 pocillos placas de poliestireno están disponibles comercialmente y tienen un diseño estándar para acomodar máquinas espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) de diferentes fabricantes. Además, una amplia variedad de inmunoglobulinas, etiquetas de detección, y agentes de bloqueo para diseños personalizados de inmunoensayos tales como ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) están disponibles.
A pesar de la infraestructura existente, kits de ELISA estándar no cumplen todas las necesidades de investigación, lo que requiere el desarrollo de inmunoensayo individualizado, que puede ser costoso y consume mucho tiempo. Por ejemplo, kits de ELISA tienen baja multiplexación (detección de más de un analito a la vez) capacidades, ya que por lo general dependen de la fluorescencia o la colmétodos orimetric para la detección. Colorimétricos y análisis basados fluorescentes tienen una capacidad limitada de multiplexación debido a picos anchos espectrales. Por el contrario, los métodos basados en la espectroscopia Raman tienen una capacidad mucho mayor para la multiplexación debido a picos de emisión estrechos. Otra de las ventajas de la espectroscopia Raman es que los reporteros Raman experimentan significativamente menos photobleaching que las etiquetas fluorescentes 1. A pesar de las ventajas que tienen sobre la prensa Raman etiquetas fluorescentes y colorimétricos, protocolos para fabricar los inmunoensayos basados en Raman son limitadas. El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo para preparar sondas funcionalizadas para utilizar en conjunción con placas de poliestireno para la detección directa de analitos por análisis UV-Vis y espectroscopía Raman. Este protocolo permitirá a los investigadores a adoptar un enfoque do-it-yourself para la futura detección de múltiples análisis al mismo tiempo aprovechar la infraestructura ya establecida.
Introduction
inmunoensayos de tipo sándwich típicos detectar indirectamente la presencia de un antígeno usando dos anticuerpos. El anticuerpo de captura se une a una superficie sólida y forma un complejo anticuerpo-antígeno cuando en la proximidad de un antígeno apropiado. Un anticuerpo de detección se presentó a continuación y se une al antígeno. Después del lavado, el anticuerpo / antígeno / restos complejo de anticuerpo y se detecta por el anticuerpo de detección marcado tal como se demuestra en la Figura 1A. Detección típica se realiza por un detector fluorescente o colorimétrico, lo que limita la multiplexación a 10 analitos debido a picos anchos espectrales 2,3. Por el contrario, los sistemas basados en Raman tienen picos de emisión mucho más estrechas que resultan en las capacidades de multiplexación mejoradas con fuentes que afirman la detección simultánea de hasta 100 analitos 2,3.
Muchas fuentes bibliográficas están disponibles que cubren aspectos importantes relacionados con inmunoensayos 4 - 6, como paso a pasodetalles para crear kits ELISA personalizadas. Desafortunadamente, estos protocolos son para la detección fluorescente o colorimétrico, lo que limita la capacidad de multiplexación de inmunoensayos personalizados. Para hacer frente a esta necesidad, se presenta un procedimiento detallado para fabricar el / Raman inmunoensayo UV-Vis previamente publicado 7 para un inmunoensayo directo como se ilustra en la Figura 1B.
Este protocolo incluye la fabricación de sondas basados en nanopartículas de oro funcionalizada, que se ilustra en la Figura 2. El procedimiento para hacer las sondas / UV-Vis Raman comienza por reporteros Raman unión a la superficie de nanopartículas de oro (AuNPs). Los AuNPs son entonces funcionalizados con anticuerpos que se asocian con polietilenglicol (PEG). sitios de unión restantes en la AuNPs se bloquean por la unión de tiol metoxi polietilenglicol (mPEG-SH) para AuNPs para evitar la posterior unión no específica durante el análisis. Las sondas AUNP preparados se prueban mediante la unión a antígenosfijado a los pocillos de una placa de poliestireno, como se ilustra en la Figura 1B. Tras lavar la placa, las sondas AUNP se detectan utilizando espectroscopia UV-Vis, mientras que los reporteros Raman asociados se detectan con la espectroscopia Raman. La combinación de datos UV-Vis y espectral Raman proporciona dos métodos de análisis, la mejora de las capacidades de este inmunoensayo.
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Protocol
1. Preparación de tampones
- Phosphate Buffered Saline (PBS)
- Diluir 50 ml de 10x PBS con 450 ml de agua de grado HPLC para hacer una concentración de 1 x PBS. Filtro estéril la solución con un filtro de 0,22 micras.
- Conserve la solución a temperatura ambiente.
- Preparación de solución salina tamponada con Tris + Tween 20 (TBST)
- Diluir 50 ml de solución salina tamponada con Tris 10x (TBS) con 450 ml de agua de grado HPLC para hacer una concentración 1x. Añadir 250 l de Tween-20 para un 0,05% (v / v) de Tween-20. Filtro estéril la solución con un filtro de 0,22 micras.
- Almacenar a temperatura ambiente.
- Preparación de albúmina de suero humano (HSA) de solución de bloqueo
- Pesar 0,45 g de HSA en 15 ml de PBS estéril filtrada 1x para hacer un 3% w / v solución de HSA. agitar hasta disolución de HSA se haya disuelto completamente.
- Almacenar la solución de HSA a 4 ° C.
NOTA: albúmina de suero bovino(BSA) también se puede utilizar como una solución de bloqueo.
- Preparación de anticuerpo PEGilado solución (PEG-Ab)
NOTA: La solución de anticuerpo debe estar libre de proteínas portadoras o estabilizantes tales como BSA, que interferirían con las reacciones de conjugación al competir por la N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) sitios de unión. Si el anticuerpo se presenta en una solución de Tris o tampón de glicina, debe someterse a un intercambio de tampón para evitar aminas o sales de amonio de interferir con la reacción de conjugación NHS. Si el anticuerpo está en una forma liofilizada, que se puede resuspender de acuerdo con la recomendación del fabricante a una concentración de 1-10 mg / ml.- Para los anticuerpos en un tampón de Tris o glicina, realizar un intercambio de tampón a bicarbonato de sodio 100 mM usando una columna de desalación. Utilice el tampón de 100 mM para elevar el pH a aproximadamente 8,5 para acelerar la reacción de conjugación.
- Hidrato de orto-piridil disulfuro-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) con 100 mM sodium bicarbonato para un volumen de 1 ml a una concentración de 1 mg / ml o mayor.
NOTA: OPSS-PEG-NHS debe hacerse fresco y usado dentro de aproximadamente 20 minutos. El grupo NHS en el OPSS-PEG-NHS tiene una vida media de aproximadamente 20 min en una solución acuosa a pH 8,5. - Añadir OPSS-PEG-NHS a la solución de anticuerpo en una relación 2: 1 (PEG: anticuerpo) relación de conjugación que se usa para las muestras de ensayo. En un tubo de microcentrífuga separado, añadir OPSS-PEG-NHS a la solución de antígeno en una proporción de 2: 1 de conjugación para ser utilizado para el control.
NOTA: La proporción de 2: 1 está asumiendo una eficiencia de conjugación 50%. El objetivo es etiquetar cada anticuerpo con una cadena de PEG. En este paso, el exceso de etiquetado es mejor que en virtud de etiquetado. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados de OPSS-PEG-NHS y solución de anticuerpos:
donde V es el volumen, C es la concentración expresada en moléculas o unaticuerpos por ml. Los subíndices PEG y Ab son OPSS-PEG-NHS y el anticuerpo, respectivamente. El volumen final debe ser de aproximadamente 250 l. - Incubar solución de PEG-Ab a 4 ° C durante 8 horas o durante la noche. Conserve la solución en alícuotas de aproximadamente 25 l trabajo a -20 ° C para limitar los ciclos de congelación y descongelación y asegúrese de usar tubos de unión de baja.
2. Preparar UV-Vis / Raman Sondas
- Preparar la solución AuNP desnuda
- Preparar una solución de AuNPs 2 ml con una concentración de aproximadamente 1 x 10 11 partículas por ml.
- Si las AuNPs deben concentrarse, llenar tubos de centrífuga de baja unión con 2.000 l de Stock AuNP y centrifugar a 5000 xg durante 20 minutos o hasta que el sobrenadante es claro. Eliminar el sobrenadante con la pipeta, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento AuNP.
- Se combinan las soluciones AUNP restantes en un tubo y estimar la concentraciónción mediante la obtención de una medición UV-Vis y comparando los valores a concentraciones conocidas ya que esta es una relación lineal.
- Preparar una solución de AuNPs 2 ml con una concentración de aproximadamente 1 x 10 11 partículas por ml.
- Determine la relación etiquetado reportero apropiado Raman
- Preparar una solución de trabajo del reportero Raman disuelto en metanol. Esta concentración será dependiente de la reportero utilizado. En este trabajo, preparar yoduro de 3,3 'diethylthiatricarbocyanine (DCTC) a una solución de trabajo de 200 mM.
- Suponiendo un volumen final de 100 l para cada pocillo, añadir una cantidad suficiente de la solución de reportero de trabajo a cada pocillo de la primera fila de una placa de 96 pocillos de manera que el reportero Raman oscilará en concentraciones de 0,2 M a 10 mM. Añadir suficiente agua de grado HPLC a cada pocillo de tal manera que el volumen es de 80 l. Añadir 20 l de AuNP a cada pocillo hacer un volumen final de 100 l para cada pocillo. Un ejemplo se proporciona en la Tabla 1.
- Medir la radiación UV-Vis de 400 a700 nm utilizando una placa de lectura de UV-Vis. La concentración apropiada es la concentración más alta con picos definidos para los espectros UV-Vis. Repita el paso 2.2.2 a concentraciones crecientes hasta que la relación de concentración más alta de reporteros Raman para AuNPs se encuentra.
NOTA: El colorante y la forma AuNP, tamaño y fabricante influyen en la concentración apropiada. Por lo tanto, los pasos que se indican deben ser evaluadas y modificadas en función de los componentes utilizados. Este protocolo implicó el uso de un colorante cargado positivamente. Como tal, la unión entre el AuNP y reportero fue mejorado mediante el uso de AuNPs con carga negativa. Esto se hace mediante el uso de citrato AuNPs tapado. Vea la sección de discusión para más detalles.
- Encuadernación reportero Raman y PEG-Ab a AUNP
- Preparar dos 1,5 ml lotes de AuNP y reportero Raman a la concentración previamente determinada, lo que permite el reportero Raman para unirse a los AuNPs durante 30 min a temperatura ambiente.
- Añadir el anticuerpo PEGilado (PEG-Ab) a un lote de la solución reportero AuNP y Raman para crear un 200: 1 de anticuerpos a partículas. Esta solución será para las muestras de ensayo. En un tubo de microcentrífuga separado, añadir el antígeno PEGilado para el otro lote de la solución reportero AuNP y Raman en un 200: 1 de anticuerpo a partículas para ser utilizado como el control. Incubar las soluciones para 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: La proporción de anticuerpos a partículas será específica para las AuNPs y tinte usado y debe ser optimizada para cada caso individual. El objetivo aquí es tener la mayor proporción de anticuerpos para las sondas AUNP que se unen a al tiempo que evita la agregación de las partículas. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados para agregar juntos:
donde V es el volumen, C es la concentración expresada en partículas o anticuerpos por ml. La aletaal volumen debe ser de aproximadamente 1,5 ml.
- Bloquear los sitios en la superficie AuNP con mPEG-SH restante.
- Preparar mPEG-SH por disolución sólida metoxi tiol a una concentración 200 mM usando agua. Vortex la solución hasta que mPEG-SH se disuelva completamente.
- Añadir mPEG-SH en un 40,000: 1 relación a la solución AuNP-PEG-Ab hecha en el paso 2.3. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 min para asegurar que los sitios restantes de la nanopartícula de oro están bloqueadas. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados para agregar juntos:
donde V es el volumen, C es la concentración expresada en partículas o anticuerpos por ml. El volumen final debe ser de aproximadamente 1,5 ml.
- Recuperar sondas funcionalizadas Raman.
- partículas de centrifugar a 5.000 g durante 20 min en baja se unen centrifuge tubos o hasta que el sobrenadante es claro. Eliminar el sobrenadante con la pipeta con cuidado de no molestar a los AuNPs.
- Volver a suspender las partículas con 1 ml de solución de PBS 1x que se hizo anteriormente. Estimar la concentración AuNP por tomar una medición UV-Vis de un pequeño volumen de solución (3 l) y comparar los resultados con las mediciones de una concentración AuNP conocido. Ajustar el volumen de tal manera que la solución final es de al menos 1 x 10 11 partículas por ml.
- Las soluciones se almacenan a 4 ° C hasta que se utiliza para la funcionalización de la placa de inmunoensayo. Utilice las soluciones dentro de una semana.
| Los volúmenes de añadir de cada componente (ml) | |||
| DCTC concentración final (mM) | solución de trabajo DCTC (200 mM) | AuNP | Agua |
| 0,2 0,1 | 20 | 79.9 | |
| 0,6 | 0,3 | 20 | 79.7 |
| 1 | 0,5 | 20 | 79.5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77.5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76.5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
Tabla 1. DCTC ejemplo dilución. Varias diluciones de DCTC y los volúmenes asociados de Stock DCTC, solución de nanopartículas de oro, y el agua.
3. Inmunoensayo Placa Preparación
- Unirse al antígeno deseado a la placa de inmunoensayo.
- Preparar suficiente antígeno diluido (50 g / ml) para llenar los pocillos de poliestireno. Vortex la solución,e inmediatamente añadir la solución a los pocillos de la placa. Permitir que el antígeno se una a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar los antígenos no unidos.
- Retire el exceso de solución de antígeno por la solución de vertido en un contenedor de eliminación de la placa y golpear contra una mesa de toallas de papel cubierto.
- Añadir TBST a los pocillos para lavar la superficie a continuación, quitar el lavado de la misma manera como se ha indicado anteriormente. Repita este paso dos veces más.
- Bloque restantes sitios de unión en la placa para evitar la unión no específica.
- Añadir 70 l de solución de bloqueo HSA a cada pocillo de la placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Retirar y enjuagar la placa utilizando el mismo procedimiento que se especifica en el paso 3.2. Cubrir la placa y seco para guardar a 4 ° C hasta que esté listo para su uso posterior.
- Funcionalizar placa de inmunoensayo.
- Añadir 70 l de tque la sonda nanopartículas preparadas en la Sección 2 de la primera columna de una placa de 96 pocillos y diluir columnas subsiguientes usando una dilución 1: 2 en serie. Dejar que la placa se incuba durante al menos 1 hora. Un ejemplo de la forma de preparar la placa de inmunoensayo se da en la Figura 3.
- Lavar la placa con TBST cinco veces como se detalla en los pasos 3.2, asegurándose de disponer de las AuNPs adecuadamente. Después del lavado final, añadir 70 l de 1x PBS a cada pocillo y cubrir con una junta de la placa.
NOTA: Las muestras de control deben ser claros. Si se ha producido la unión no específica, las muestras de control tendrán un color parecido a las muestras de ensayo.
- Prueba de la sensibilidad del ensayo UV-Vis y espectroscopía Raman.
- Para cada pocillo, medir la UV-Vis espectros que van de 400 a 700 nm utilizando una placa de lectura de UV-Vis espectrofotómetro.
- El uso de un microscopio Raman invertida, centrar el objetivo en la superficie del pozo que tiene las sondas AUNP. Transmisión exteriorner un espectro de Raman del pozo. Recoger un espectro que va desde 1.800 cm -1 a 400 cm -1. Repita este paso para todos los pozos.
- El uso de un software apropiado espectral, realice una orden de corrección de línea de base polinómica 11ª para los espectros Raman y un polinomio de orden 3º de la radiación UV-Vis.
- El uso de un software apropiado espectral, normalizar el Raman y UV-Vis. Ajuste el valor máximo de la escala 1 y todos los demás valores en consecuencia. Para normalizar los espectros Raman, seleccione un pico de poliestireno único y establezca su valor en 1 y la escala de todos los demás valores en consecuencia.
- El uso de un software apropiado espectral, lleve a cabo la integración de picos para cada espectro. Para los espectros de Raman, el pico que representa el reportero Raman debe estar en una región ausente de los picos de poliestireno. Para llevar a cabo la integración de picos, especifique los límites integrales para el pico deseado y registrar el área del pico deseado para todas las muestras incluyendo los controles.
- plAT el área promedio pico de interés como una función del logaritmo de la concentración AuNP con barras de error para cada punto que indica su desviación estándar asociada. Montar estos puntos de calibración a una curva logística de 4 parámetros.
- Determinar el valor medio de la pieza en bruto por el promedio del área del pico de interés para una muestra en blanco. Determinar la desviación típica de estas zonas; esta es la desviación estándar de la pieza en bruto.
- Para el mismo pico analizado en el paso anterior, encontrar la desviación estándar de que el área del pico para la concentración más baja.
- Calcular el límite del límite de espacio en blanco y el inferior de prueba como se especifica en la sección de resultados Representante. Utilice estos valores con las curvas de calibración para determinar la 4PL LLOD en términos de concentración AuNP.
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Representative Results
En este estudio, se utilizaron 60 partículas de oro nm para espectroscopía UV-Vis. UV-Vis espectros de absorción de 400 a 700 nm fueron recogidos y las áreas de los picos correspondientes a cada concentración AuNP se determinaron usando un software de análisis espectral de código abierto 8. Antes de pico de integración, los espectros recogidos se sometió a corrección de línea base usando un ajuste polinómico de tres puntos. Áreas de los picos se utilizaron para generar una curva de calibración logarítmica como se demuestra en la Figura 4. Debe observarse que las Figuras 4 y 5 incorporan curvas de calibración logarítmicas. El uso de curvas de calibración no lineales puede ampliar significativamente el rango dinámico de un ensayo y se ha convertido en una práctica aceptada para diversos inmunoensayos que requieren capacidades de detección de rango bajo 9,10.
Para evaluar cuantitativamente la sensibilidad del ensayo, el límite de la pieza en bruto (LOB) yel límite inferior de detección (LLOD) se calculó como sigue 
donde la desviación estándar del blanco y de la concentración de la muestra bajo es σ σ BLANCO y bajo, respectivamente, mientras 
es el valor medio de la pieza en bruto 11,12. Usando estas definiciones, así como la curva de calibración logística de 4 parámetros generados, el LLOD para UV-Vis era 15:05 de nanopartículas de oro.
El uso de una configuración de la espectroscopia de Raman se detalla previamente 7, un microscopio Raman invertida 785 nm se utilizó para recoger los espectros del reportero DCTC Raman asociado con la placa de inmunoensayo funcionalizado. Los parámetros de funcionamiento incluyen la potencia del láser 7 mW y una corriente alterna de 10 segquisition tiempo. Spectra sometido a la corrección de línea de base (11 TH polinomio de orden) y la integración de picos. Figura 5 muestra la curva de calibración logística de 4 parámetros generado para las áreas de los picos DCTC para los 493 cm-1 y 508 cm -1 picos DCTC. Como se desconocía la concentración exacta de reportero Raman unido a la superficie AuNP, la curva de calibración se basó en la concentración AuNP. El uso de las ecuaciones descritas anteriormente, el LLOD se determinó que era de 13:07 AuNP.
Figura 1. Ilustración de inmunoensayo directo e indirecto análisis. Ilustración del indirecta (A) y las intervenciones directas (B) de detección para los inmunoensayos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Nanopartículas sonda de fabricación ilustración. Proceso de funcionalización de sondas Raman / UV-Vis para inmunoensayos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Placa Preparado inmunoensayo. Imagen de una placa de inmunoensayo preparado. Las filas A a E son las pruebas de las muestras y las líneas F a H son muestras de control. La columna 1 contiene las nanopartículas sin diluir y cada columna posterior tiene la mitad de la concentraciónAUNP de sondas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Curva de calibración UV-Vis para el inmunoensayo utilizando sondas de nanopartículas. Curva de calibración logarítmica para las áreas de los picos UV-Vis a la concentración de nanopartículas. La línea ajustada es una curva logística de 4 parámetros (4PL). Las barras de error indican la desviación estándar del área del pico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura curva de calibración 5. Raman para el inmunoensayo utilizando sondas de nanopartículas. Curva de calibración que correlaciona el área del pico Raman reportero a la concentración de nanopartículas de oro. La línea ajustada es una curva logística de 4 parámetros (4PL). Las barras de error indican la desviación estándar del área del pico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En el protocolo detallado, hay varios puntos críticos para abordar. Una cuestión es la elección del reportero Raman y nanopartículas de oro. Aunque el protocolo fue escrito para ser adaptado para su uso individual, el Raman reportero DCTC fue utilizado como un ejemplo. DCTC es un reportero de carga positiva y se une a superficies tales como citrato AuNPs capsulado cargado negativamente. Este protocolo puede ser adaptado para la prensa de carga negativa mediante el uso de nanopartículas de oro con una carga superficial positiva. Por ejemplo, polietilenimina (PEI) AuNPs cubiertas proporcionan una carga superficial positiva y una mejor unión con la prensa con carga negativa.
Mantener el equilibrio entre las proteínas y nanopartículas es un paso crítico de este protocolo. Este equilibrio se consigue mediante la adición de anticuerpos PEGilados en un anticuerpo optimizado para relación de nanopartículas de oro de 200: 1. Si los anticuerpos PEGilados se añaden a la solución de nanopartículas de oro en una proporción significativamente mayor que this, se puede producir la agregación de partículas de iones inducida. Alternativamente, en demasiado pequeño de una relación, se produciría la agregación de proteínas y la insolubilidad. Esta relación debe ser determinada en cada caso individual.
Otro paso protocolo crítico es la conjugación de OPSS-PEG-NHS al anticuerpo. Este paso es precedida por la suspensión de OPSS-PEG-NHS en bicarbonato de sodio en el que el grupo NHS se une al anticuerpo. Esta etapa de conjugación compite con la reacción de hidrólisis desfavorable como se detalla anteriormente 7. es más probable que suceda con el tiempo La reacción de hidrólisis, y como tal, el OPSS-PEG-NHS a la unión del anticuerpo debe realizarse inmediatamente.
El producto final del protocolo es un inmunoensayo que puede ser probado para la sensibilidad por la construcción de una curva de calibración utilizando UV-Vis y espectroscopía Raman. Los resultados indican que el inmunoensayo es comparable a otros bioensayos 13-17 que tienen límites de detección of 13:00. No sólo es la sensibilidad de inmunoensayo Raman competitivo con otros bioensayos, que tiene el potencial de mejorar la sensibilidad por medio de una mayor superficie-Raman espectroscopia (SERS). SERS incorpora el uso de nanopartículas de oro o una superficie de oro rugosa para mejorar la emisión Raman. Como este protocolo ya incluye el uso de sondas de oro y nanopartículas, que es muy adecuado para el desarrollo en un inmunoensayo SERS. En el futuro, esta técnica podría ser usada para el desarrollo de un inmunoensayo de dispersión de la luz que podría ser utilizado para detectar muchos analitos de proteínas simultáneamente. Como perfiles de biomarcadores se vuelve cada vez más importante para el diagnóstico y tratamiento de una amplia variedad de enfermedades, esta técnica puede tener profundas aplicaciones clínicas.
Los problemas más comunes asociados con este protocolo incluyen la agregación de nanopartículas de oro, insuficiente unión de bloquear las proteínas, la unión de proteínas no específicas, y una señal Raman débil. Estos problemas sonenumerados en la Tabla 2, junto con la posible causa de los problemas y los pasos de acción para hacer frente a cada problema. Otros problemas pueden surgir debido a las limitaciones del protocolo. En primer lugar, este protocolo se limita a concentraciones AUNP de hasta 5 x 10 12 partículas / ml como concentraciones más altas tienden a causar la agregación. La técnica se basa en nanopartículas estables, no agregadas para la estimación de las concentraciones de nanopartículas. Si hay agregación, se afectará la estimación de la concentración de nanopartículas. El protocolo también se limita a los reporteros con picos Raman lo suficientemente fuerte como para superar el fondo poliestireno y son únicos a partir de poliestireno. Por último, el uso de placas de 96 pocillos tradicionales limitar el protocolo con el uso de un microscopio Raman invertida debido a la altura de las placas. De lo contrario, un aumento bajo debe ser utilizado para el objetivo del microscopio Raman para dar cabida a la altura de la placa de 96 pocillos.
| Síntoma | Causa probable | Acción correctiva |
| Las nanopartículas de oro se agregan después de la centrifugación y resuspensión. | La concentración reportero Raman es demasiado alto. | Pon a prueba una serie de concentraciones reportero Raman como se especifica en el apartado 2.2 o este protocolo. |
| El anticuerpo a la proporción de AuNP es demasiado alto. | Reducir el número de anticuerpos PEGilados unidos a la superficie de las nanopartículas para aumentar la estabilidad de las partículas. | |
| El agente de bloqueo mPEG-SH no es vinculante a la superficie AuNP. | Preparar la solución de mPEG-SH fresca antes de bloqueo de nanopartículas. | |
| la unión a la superficie de la placa de inmunoensayo no específica | La placa de inmunoensayo se bloquea insuficientemente. | Preparar una solución fresca antes de bloqueo a la placa diversiónctionalization. |
| El peso molecular de mPEG-SH no es suficientemente grande. | Asegúrese de que la molécula de mPEG-SH se utiliza para el bloqueo tiene un peso molecular de 5000 kDa o mayor. | |
| señal Raman débil o ausente | El reportero Raman no es vinculante a la superficie de la partícula. | Asegúrese de que se permitió que el reportero Raman para unir por lo menos 30 minutos antes de la adición del anticuerpo PEGilado. |
| El peso molecular de mPEG-SH no es suficientemente grande. | Asegurar que la nanopartícula agente de remate tiene la carga apropiada para la unión iónica reportero Raman. |
Tabla 2. La solución de problemas comunes. Lista de los problemas comunes encontrados durante el protocolo con las causas asociadas y elementos de acción correctiva.
En este manuscrito, hemos presentado aprotocolo para la fabricación a la medida de un inmunoensayo basado en nanopartículas-sonda para el análisis mediante espectroscopia UV-Vis / Raman. El protocolo incluye la funcionalización de nanopartículas de oro con los reporteros y las inmunoglobulinas para la detección directa de antígenos unidos a una placa de poliestireno Raman. El protocolo puede ser adaptado para adaptarse a un reportero Raman particular y la longitud de onda de excitación asociado. forma de nanopartículas de oro y el tamaño también pueden ser alterados. Sin embargo, las proporciones de solución para la unión variará de acuerdo con el reportero Raman utilizado, así como el tamaño de las nanopartículas, la forma, y el fabricante apropiado. El protocolo ha sido escrito para dar señales de investigadores de relaciones de las soluciones cuando se deben determinar para cada disposición única y por lo tanto permitir la fabricación a medida de acuerdo a las necesidades de investigación. A diferencia de los protocolos de inmunoensayos fluorescentes / colorimétrico típicos, este protocolo tiene el potencial de mayores capacidades de multiplexión al mismo tiempo aprovechar una infraestructura preexistente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 ml | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 | |
| In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
References
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- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
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