Abstract
Immunoassays worden gebruikt om eiwitten op basis van de aanwezigheid van bijbehorende antilichamen. Door hun grote gebruik in onderzoek en klinische settings, kan een grote infrastructuur van immunoassay instrumenten en materialen te vinden. Bijvoorbeeld, 96- en 384-well polystyreen platen zijn in de handel verkrijgbaar en hebben een standaard ontwerp aan ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectroscopie machines van verschillende fabrikanten tegemoet te komen. Daarnaast is een grote verscheidenheid aan immunoglobulinen, detectie labels en blokkeringsmiddelen voor aangepaste ontwerpen immunoassay zoals enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) zijn beschikbaar.
Ondanks de bestaande infrastructuur, hoeft standaard ELISA-kits niet voldoen aan alle behoeften aan onderzoek, waarvoor geïndividualiseerde immuno-ontwikkeling, die duur en tijdrovend kan zijn. Bijvoorbeeld, ELISA kits lage multiplexing (detectie van meer dan één analyt tegelijkertijd) kunnen leveren als gewoonlijk afhankelijk fluorescentie of colorimetric methoden voor detectie. Colorimetrische en fluorescerende gebaseerde analyses hebben beperkte multiplexing mogelijkheden als gevolg van brede spectrale pieken. Daarentegen Raman-spectroscopie gebaseerde werkwijzen hebben een veel grotere capaciteit voor multiplexen door smalle piekt. Een ander voordeel van Raman spectroscopie is dat Raman verslaggevers ervaren aanzienlijk minder fotobleken dan TL-tags 1. Ondanks de voordelen die Raman verslaggevers hebben meer dan fluorescerende en colorimetrische labels, protocollen te fabriceren Raman-gebaseerde immunoassays zijn beperkt. Het doel van dit document is een protocol gefunctionaliseerde probes te bereiden voor gebruik in combinatie met polystyreen platen voor directe detectie van analyten door UV-Vis analyse en Raman spectroscopie bieden. Dit protocol zal toelaten onderzoekers om een doe-het-zelf-aanpak voor de toekomstige multi-analytdetectiezone terwijl het benutten van vooraf vastgestelde infrastructuur.
Introduction
Typische sandwich immunoassays indirect detecteren van de aanwezigheid van een antigeen met twee antilichamen. De capture-antilichaam wordt gebonden aan een vast oppervlak en vormt een antilichaam-antigeen complex als in de nabijheid van een geschikt antigeen. Een detectie antilichaam wordt vervolgens ingebracht en bindt aan het antigen. Na wassen wordt het antilichaam / antigeen / antilichaamcomplex overblijfselen en gedetecteerd door het gelabelde detectie antilichaam zoals getoond in Figuur 1A. Typische detectie wordt uitgevoerd door een fluorescente of colorimetrische detector, multiplexing beperkt tot 10 analyten door brede spectrale pieken 2,3. Daarentegen Raman-gebaseerde systemen veel smallere emissiepieken waardoor er betere mogelijkheden met multiplexing bronnen beweren gelijktijdige detectie tot 100 analyten 2,3.
Vele literatuurbronnen beschikbaar die belangrijke aspecten omvatten immunoassays 4-6 als de stap-voor-stapDetails om gepersonaliseerde ELISA-kits te creëren. Helaas, deze protocollen zijn voor fluorescerende of colorimetrische detectie, het beperken van multiplexing vermogen van op maat gemaakte immunoassays. Om hieraan te voldoen, presenteren wij een gedetailleerde procedure voor de UV-Vis / Raman immunoassay eerder gepubliceerd 7 een directe immunoassay zoals in figuur 1B fabriceren.
Dit protocol omvat de fabricage van gefunctionaliseerde goud-nanodeeltjes probes, geïllustreerd in figuur 2. De procedure voor de Raman / UV-Vis probes maken begint door binding Raman reporters aan het oppervlak van goud nanodeeltjes (AuNPs). De AuNPs worden vervolgens gefunctionaliseerd met antilichamen die zijn gekoppeld aan polyethyleenglycol (PEG). Resterende bindingsplaatsen op de AuNPs worden geblokkeerd door binding methoxypolyethyleenglycol thiol (mPEG-SH) naar AuNPs daaropvolgende niet-specifieke binding tijdens de analyse te voorkomen. De bereide AuNP probes getest door binding aan antigenenbevestigd aan de putjes van een polystyreen plaat zoals getoond in figuur 1B. Na wassen van de plaat, worden de AuNP probes gedetecteerd met UV-Vis-spectroscopie en de daarmee samenhangende Raman reporters worden gedetecteerd met Raman spectroscopie. De combinatie van UV-Vis en Raman spectrale gegevens op twee manieren van analyses, het verbeteren van de mogelijkheden van deze immunoassay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Buffers
- Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
- Verdun 50 ml van 10x PBS met 450 ml HPLC kwaliteit water tot een 1X PBS concentratie te maken. Steriele filter de oplossing met een 0,22 urn filter.
- Winkeloplossing bij kamertemperatuur.
- Bereiding van Tris gebufferde zoutoplossing + Tween 20 (TBST)
- Verdun 50 ml van 10x Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) met 450 ml HPLC kwaliteit water tot een 1X concentratie te maken. Voeg 250 ul van Tween-20 voor een 0,05% (v / v) Tween-20. Steriele filter de oplossing met een 0,22 urn filter.
- Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereiding van menselijk serumalbumine (HSA) blokkeeroplossing
- Weeg 0,45 g HSA in 15 ml steriel gefiltreerde 1 x PBS tot een 3% te w / v HSA oplossing. Vortex oplossing totdat HSA volledig is opgelost.
- WINKEL HSA oplossing bij 4 ° C.
OPMERKING: runderserumalbumine(BSA) kan ook worden gebruikt als blokkerende oplossing.
- Bereiding van gePEGyleerde antilichaam (Ab-PEG) -oplossing
LET OP: Het antilichaam oplossing moet vrij zijn van vervoerder of het stabiliseren van eiwitten zoals BSA, die met conjugatiereacties zou verstoren door te concurreren voor de n-hydroxysulfosuccinimide (NHS) binding sites. Wanneer het antilichaam wordt geleverd in een Tris of glycine bufferoplossing moet een buffer uitwisseling aminen of ammoniumzouten voorkomen stoort de NHS conjugatiereactie ondergaat. Als het antilichaam in een gelyofiliseerde vorm kunnen worden geresuspendeerd volgens de aanbeveling van de fabrikant in een concentratie van 1-10 mg / ml.- Op antilichamen in een Tris of glycinebuffer Voer een bufferuitwisseling naar 100 mM natriumbicarbonaat met een ontzoutingskolom. Gebruik de 100 mM buffer om de pH te verhogen tot ongeveer 8,5 tot het versnellen van de conjugatiereactie.
- Hydraat ortho-pyridyl disulfide-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) met 100 mM sodium bicarbonaat tot een volume van 1 ml in een concentratie van 1 mg / ml of hoger.
LET OP: OPSS-PEG-NHS moet vers worden gemaakt en gebruikt binnen ongeveer 20 minuten. De NHS groep op de OPSS-PEG-NHS heeft een halfwaardetijd van ongeveer 20 min in een waterige oplossing bij pH 8,5. - Add OPSS-PEG-NHS het antilichaam oplossing bij een 2: 1 verhouding (PEG: Antibody) conjugatie verhouding te gebruiken voor de testmonsters. In een aparte microcentrifugebuis, voeg OPSS-PEG-NHS het antigeen oplossing bij een 2: 1 verhouding van conjugatie wordt gebruikt voor de controle.
NB: De 2: 1 verhouding wordt uitgaande van een 50% rendement conjugatie. Het objectief is elk antilichaam te labelen met een PEG-keten. In deze stap, over-labeling is beter dan onder-labeling. Gebruik de volgende vergelijking om de juiste hoeveelheden OPSS-PEG-NHS en oplossing antilichaam te bepalen:
waarbij V het volume is, C is de concentratie in moleculen oftibodies per ml. Subscripts PEG en Ab OPSS-PEG-NHS en antilichamen, respectievelijk. Het uiteindelijke volume moet ongeveer 250 ul. - Incubeer PEG-Ab oplossing bij 4 ° C gedurende 8 uur of overnacht. Winkeloplossing in goede hoeveelheden van ongeveer 25 ul bij -20 ° C om de bevriezing dooicycli beperken en zorg ervoor dat lage bindingsaffiniteit buizen gebruikt.
2. Bereid UV-Vis / Raman Probes
- Bereid kale AuNP oplossing
- Bereid een 2 ml oplossing van AuNPs met een concentratie van ongeveer 1 x 10 11 deeltjes per ml.
- Als de AuNPs moeten worden geconcentreerd, vul lage binding centrifuge buizen met 2000 ul voorraad AuNP en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 20 minuten of totdat het supernatans helder is. Verwijder de bovenstaande vloeistof door pipetteren, zorg dat u de AuNP pellet niet te verstoren.
- Combineer de resterende AuNP oplossingen in één buis en schat de ConcentraTIE verkrijgen van een UV-Vis meten en vergelijken van waarden met bekende concentraties is een lineair verband.
- Bereid een 2 ml oplossing van AuNPs met een concentratie van ongeveer 1 x 10 11 deeltjes per ml.
- Bepaal de juiste Raman verslaggever etikettering verhouding
- Bereid een werkoplossing van het Raman reporter opgelost in methanol. Deze concentratie is afhankelijk van de reporter gebruikt wordt. In dit werk voor te bereiden 3,3-diethylthiatricarbocyanine jodide (DTTC) bij een werkende oplossing van 200 micrometer.
- Uitgaande van een eindvolume van 100 ui voor elk putje, voeg genoeg van de werkende reporter oplossing in elk putje van de eerste rij van een 96-wells plaat zodanig dat de Raman reporter zal variëren in concentraties van 0,2 uM tot 10 uM. Voeg genoeg HPLC kwaliteit water aan elk putje zodat het volume 80 pi. Voeg 20 ul van AuNP aan elk putje om een eindvolume van 100 ul per put. Een voorbeeld wordt gegeven in tabel 1.
- Meet het UV-Vis spectra van 400 tot700 nm met behulp van een plaat lezen UV-Vis spectrofotometer. De geschikte concentratie van de hoogste concentratie met gedefinieerde pieken voor de UV-Vis spectra. Herhaal stap 2.2.2 bij toenemende concentraties tot de hoogste concentratieverhouding van Raman reporters AuNPs gevonden.
OPMERKING: De kleurstof en AuNP vorm, grootte en fabrikant beïnvloeden de geschikte concentratie. Daarom moet de vermelde stappen worden beoordeeld en aangepast afhankelijk van de elementen. Dit protocol omvatte de toepassing van een positief geladen kleurstof. Als zodanig, binding tussen de AuNP en reporter werd verbeterd door het gebruik van negatief geladen AuNPs. Dit werd gedaan met behulp van citraat bedekte AuNPs. Zie de discussie sectie voor meer informatie.
- Bindend Raman reporter en PEG-Ab naar AuNP
- Bereid twee 1,5 ml partijen AuNP en Raman reporter op de vastgelegde concentratie, waardoor de Raman reporter te binden aan de AuNPs gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het gepegyleerde antilichaam (Ab-PEG) tot een partij van de AuNP en Raman reporter oplossing voor een 200 maken: 1 verhouding van antilichamen tegen deeltjes. Deze oplossing zal zijn voor de testmonsters. In een aparte microcentrifugebuis, voeg gePEGyleerde antigeen aan de andere partij van de AuNP en Raman reporter oplossing bij een 200: 1 verhouding van antilichaam tegen deeltjes worden gebruikt als de controle. Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De verhouding van antilichamen tegen deeltjes specifiek voor de AuNPs en kleurstof gebruikt en moeten worden geoptimaliseerd voor elk individueel geval. Het doel hier is om de hoogste verhouding van antilichamen voor de AuNP probes binden aan en voorkomt aggregatie van de deeltjes. Gebruik de volgende vergelijking om de juiste hoeveelheden te bepalen om samen te voegen:
waarbij V het volume is, C is de concentratie in deeltjes per ml of antilichamen. de final volume moet ongeveer 1,5 ml.
- Block overige locaties op het AuNP oppervlak met mPEG-SH.
- Bereid mPEG-SH door oplossende vaste methoxypolyethyleenglycol thiol een 200 uM concentratie met water. Vortex de oplossing tot mPEG-SH volledig is opgelost.
- Add mPEG-SH met een 40.000: 1 verhouding voor AuNP-PEG-Ab oplossing bereid in stap 2.3. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 min te zorgen voor de resterende plaatsen op de gouden nanodeeltjes worden geblokkeerd. Gebruik de volgende vergelijking om de juiste hoeveelheden te bepalen om samen te voegen:
waarbij V het volume is, C is de concentratie in deeltjes per ml of antilichamen. Het eindvolume moet ongeveer 1,5 ml.
- Recover gefunctionaliseerde Raman probes.
- Centrifuge deeltjes bij 5.000 g gedurende 20 min in lage bind centrifuge buizen of totdat het supernatans helder is. Verwijder de bovenstaande vloeistof door pipetteren zorg dat u de AuNPs niet te verstoren.
- Resuspendeer de deeltjes met 1 ml 1x PBS-oplossing die eerder werd gemaakt. Schat de AuNP concentratie door een UV-Vis meting van een kleine hoeveelheid oplossing (3 ui) en de resultaten vergelijkt met metingen van een bekende concentratie AuNP. Stel het volume zodanig dat de uiteindelijke oplossing ten minste 1 x 10 11 deeltjes per ml.
- Winkeloplossingen bij 4 ° C totdat het wordt gebruikt voor het functionaliseren van de immunoassay plaat. Gebruik de oplossingen binnen een week.
| Volumes toevoegen van elke component (ml) | |||
| DTTC uiteindelijke concentratie (mm) | DTTC werkende oplossing (200 mm) | AuNP | Water |
| 0.2 0.1 | 20 | 79.9 | |
| 0.6 | 0.3 | 20 | 79.7 |
| 1 | 0.5 | 20 | 79.5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77.5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76.5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
Tabel 1. DTTC verdunning voorbeeld. Verschillende verdunningen van DTTC en de bijbehorende volumes voorraad DTTC, gouden nanodeeltjes oplossing en water.
3. Immunoassay Plate Voorbereiding
- Binden gewenst antigeen aan de immunoassay plaat.
- Bereid voldoende verdund antigeen (50 ug / ml) aan de putjes polystyreen vullen. Vortex de oplossing,en meteen de oplossing toe te voegen aan de putjes. Laat het antigen te binden aan de platen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Afwassen ongebonden antigenen.
- Verwijder de overtollige antigeen oplossing door storten oplossing in een afvalcontainer en het raken van de plaat tegen een papieren handdoek bedekte tafelblad.
- TBST toevoegen aan de putjes aan het oppervlak te wassen verwijdert de was op dezelfde wijze als eerder vermeld. Herhaal deze stap nog twee keer.
- Resterende blok bindingsplaatsen op de plaat om niet-specifieke binding te voorkomen.
- Voeg 70 ul van HSA blokkerende oplossing aan elk putje van de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Verwijderen en spoel de plaat volgens dezelfde procedure als beschreven in stap 3.2. Bedek de plaat en opslag droog bij 4 ° C tot klaar voor verder gebruik.
- Functionaliseren immunoassay plaat.
- Voeg 70 gl tHij sonde nanodeeltjes bereid in deel 2 naar de eerste kolom van een 96-putjesplaat en verdund daaropvolgende kolommen onder toepassing van een 1: 2 seriële verdunning. Laat de plaat geïncubeerd gedurende ten minste 1 uur. Een voorbeeld van hoe de immunoassay plaat prepare wordt gegeven in figuur 3.
- Was de plaat met TBST vijf keer zoals beschreven in de stappen 3.2, zorg ervoor te ontdoen van de AuNPs gepast. Na de laatste wasbeurt, voeg 70 pl 1x PBS aan elk putje en afdekken met een plaat afdichting.
NB: De controlemonsters moet helder zijn. Als niet-specifieke binding is opgetreden, zal de controlemonsters dezelfde kleur als de analysemonsters.
- Test assay gevoeligheid door UV-Vis en Raman spectroscopie.
- Voor elk putje, meet het UV-Vis spectrum tussen 400 en 700 nm met behulp van een plaat lezen UV-Vis spectrofotometer.
- Middels een omgekeerde Raman microscoop, richten de doelstelling op het oppervlak van de put dat de AuNP probes heeft. obTain een Raman spectra van de put. Verzamel een spectrum variërend van 1800 cm-1 tot 400 cm -1. Herhaal deze stap voor alle putjes.
- Behulp van een geschikte spectrale software voert een 11 Ode orde polynoom basislijncorrectie de Raman spectra en een 3e orde polynoom van de UV-Vis spectra.
- Behulp van een geschikte spectrale software, normaliseren de Raman en UV-Vis spectra. Stel de maximumwaarde 1 en dienovereenkomstig schaal alle andere waarden. De Raman spectra normaliseren, selecteer een unieke polystyreen piek en zet deze gelijk aan 1 en dienovereenkomstig schaal alle andere waarden.
- Met behulp van een geschikte spectrale software, het uitvoeren van peak-integratie voor elk spectrum. Voor Raman spectra, moet de piek die de Raman reporter in een gebied afwezig polystyreen pieken. Piek integratie uit te voeren, geeft u de integrale grenzen voor de gewenste piek en de gewenste piekoppervlak voor alle monsters, met inbegrip van de controles op te nemen.
- plot de gemiddelde piekoppervlak van belang als een functie van de log van de concentratie AuNP foutbalken voor elk punt aangeven bijbehorende standaarddeviatie. Breng deze kalibratiepunten een 4-parameter logistische curve.
- Bepaal de gemiddelde waarde van de blanco door het gemiddelde gebied van de piek van belang voor een blanco monster. Bepaal de standaardafwijking van deze gebieden; Dit is de standaarddeviatie van de blanco.
- Om dezelfde piek in de vorige stap geanalyseerd, vindt de standaardafwijking van die piekoppervlak voor de laagste concentratie.
- Bereken de grens van het onbewerkte en onderste detectielimiet zoals gespecificeerd in de sectie Representatieve resultaten. Gebruik deze waarden met de 4PL kalibratiecurven de LLOD te bepalen in termen van AuNP concentratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werden 60 nm gouddeeltjes gebruikt voor UV-Vis spectroscopie. UV-Vis absorptiespectra 400-700 nm werden verzameld en het piekoppervlak voor elke AuNP concentratie werd bepaald met behulp van een open source spectrale analyse software 8. Voorafgaand aan de integratie van de piek, de verzamelde spectra onderging basislijn correctie met behulp van een driepunts polynoom fit. Piekoppervlakken werden gebruikt om een logaritmische kalibratiecurve gegenereerd zoals aangetoond in figuur 4. Opgemerkt wordt dat de figuren 4 en 5 opgenomen logaritmische kalibratiekrommen. Het gebruik van niet-lineaire kalibratie curves kan aanzienlijk uit te breiden het dynamische bereik van een test en is uitgegroeid tot een geaccepteerde praktijk van verschillende immunoassays die lage bereik detectiemogelijkheden 9,10 vereisen.
Kwantitatief beoordelen van de gevoeligheid van de test, de grens van de plano (LOB) ende onderste detectielimiet (LLOD) werd als volgt berekend 
waarbij standaarddeviatie van de blanco en de laagste concentratie monster BLANK σ en σ Low respectievelijk terwijl 
is de gemiddelde waarde van de blanco 11,12. Met deze definities, en de gegenereerde 4-parameter logistische ijkkromme, de LLOD UV-Vis was 15:05 gouden nanodeeltjes.
Met behulp van een Raman spectroscopie setup eerder beschreven 7, een 785 nm omgekeerde Raman microscoop werd gebruikt om de spectra te verzamelen van de DTTC Raman verslaggever verbonden aan de gefunctionaliseerde immunoassay plaat. Operating parameters opgenomen 7 mW laservermogen en een 10 sec acinquisitie tijd. Spectra ondergingen basislijncorrectie (11 Ode orde polynoom) en piekintegratie. Figuur 5 toont de 4-parameter logistische kalibratiekromme gegenereerd voor de DTTC piekoppervlakken voor de 493 cm -1 en 508 cm -1 DTTC pieken. Aangezien de precieze concentratie van Raman reporter gebonden aan het oppervlak AuNP onbekend was, werd de kalibratiecurve gebaseerd op AuNP concentratie. Volgens de hierboven beschreven vergelijkingen, werd de LLOD bepaald 1:07 van AuNP zijn.
Figuur 1. Illustratie van de directe en indirecte immuno-analyse. Illustratie van de indirecte (A) en direct (B) detectie regelingen voor immunoassays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Nanodeeltjes sonde fabricage illustratie. Proces van functionaliseren Raman / UV-Vis probes voor immunoassays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. Klik hier om een veel grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Prepared immunoassay plaat. Afbeelding van een voorbereide immunoassay plaat. Rijen A tot en met E zijn testen monsters terwijl rijen F tot en met H zijn controlemonsters. Kolom 1 bevat de verdunde nanodeeltjes en elke volgende kolom halve concentratievan AuNP sondes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. UV-Vis ijkkromme voor immunoassay met nanodeeltjes probes. Logaritmische ijkcurve voor de UV-Vis piekoppervlakken nanodeeltjes concentratie. De gemonteerde lijn is een 4-parameter logistiek (4PL) curve. Fout balken geven de piek gebied standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. Klik hier om een veel grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Raman calibratie curve voor immunoassay met nanodeeltjes probes. IJkcurve correleren Raman reporter piekoppervlak om goud nanodeeltjes concentratie. De gemonteerde lijn is een 4-parameter logistiek (4PL) curve. Fout balken geven de piek gebied standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. Klik hier om een veel grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de gedetailleerde protocol, zijn er verschillende kritische punten aan te pakken. Een probleem is de keuze van Raman reporter en gouden nanodeeltjes. Hoewel het protocol worden aangepast voor individueel gebruik werd geschreven, werd het Raman reporter DTTC als voorbeeld. DTTC is een positief geladen reporter en bindt aan negatief geladen oppervlakken zoals citraat bedekte AuNPs. Dit protocol kan worden aangepast voor negatief geladen reporters met gouden nanodeeltjes met een positieve oppervlaktelading. Bijvoorbeeld, polyethyleenimine (PEI) afgedekt AuNPs een positieve oppervlaktelading en een betere binding met negatief geladen verslaggevers.
Behoud van het evenwicht tussen eiwitten en nanodeeltjes is een cruciale stap van dit protocol. Dit evenwicht wordt bereikt door het toevoegen gepegyleerde antilichamen tegen een antilichaam tegen geoptimaliseerd gouden nanodeeltjes verhouding van 200: 1. Als de gepegyleerde antilichamen worden toegevoegd aan de gouden nanodeeltjes oplossing bij een aanzienlijk hogere verhouding dan this, kan-ion geïnduceerde deeltje aggregatie optreden. Als alternatief, bij een te kleine van een verhouding, eiwit aggregatie en onoplosbaarheid zou optreden. Deze verhouding moet worden bepaald in elk individueel geval.
Een andere belangrijke stap protocol is de conjugatie van OPSS-PEG-NHS aan het antilichaam. Deze stap wordt voorafgegaan door suspenderen OPSS-PEG-NHS in natriumbicarbonaat waar de NHS groep bindt aan het antilichaam. Deze conjugatie stap concurreert met de ongunstige hydrolysereactie zoals eerder 7 beschreven. De hydrolysereactie meer waarschijnlijk tijd, en als zodanig moet de OPSS-PEG-NHS antilichaambinding onmiddellijk worden uitgevoerd.
Het eindproduct van het protocol is een immunoassay die kunnen worden getest op gevoeligheid met de bouw van een ijkcurve door UV-Vis en Raman spectroscopie. De resultaten geven aan dat de immunoassay is vergelijkbaar met andere bioassays 13-17 die detectiegrenzen o hebbenf 13:00. Niet alleen is het Raman immunoassay gevoeligheid concurrerend met andere bioassays, heeft het potentieel voor een verbeterde gevoeligheid door middel van Raman spectroscopie (SERS). SERS omvat het gebruik van goud nanodeeltjes of een geruwd goudoppervlak de Raman emissie te verbeteren. Aangezien dit protocol al omvat het gebruik van goud-nanodeeltjes probes, is het zeer geschikt voor de ontwikkeling tot een SERS immunoassay. In de toekomst kan deze techniek worden gebruikt voor de ontwikkeling van een lichtverstrooiing immunoassay die kunnen worden gebruikt om vele analyten tegelijk te detecteren eiwit. Als biomarker profilering steeds belangrijker voor de diagnose en behandeling van diverse ziekten, kan deze techniek grondige klinische toepassingen.
Algemene problemen van deze protocollen zijn aggregatie van goud nanodeeltjes, onvoldoende bindende eiwitten blokkeren binding van niet-specifieke eiwitten en een zwakke Raman-signaal. Deze problemen zijnopgesomd in Tabel 2 samen met de mogelijke oorzaak van het probleem en actiestappen elk probleem. Andere problemen kunnen ontstaan als gevolg van beperkingen van het protocol. Eerst Dit protocol wordt beperkt tot AuNP concentraties tot 5 x 10 12 deeltjes / ml hogere concentraties vaak aggregatie veroorzaken. De techniek is gebaseerd op een stabiele, niet-geaggregeerde nanodeeltjes voor het schatten van de nanodeeltjes concentraties. Als er aggregatie, zal de schatting van nanodeeltjes concentratie een vertekend beeld geven. Het protocol is eveneens beperkt tot Raman reporters met pieken sterk genoeg om de polystyreen achtergrond overwinnen en zijn uniek van polystyreen. Tenslotte het gebruik van traditionele 96-putjesplaten beperken het protocol voor het gebruik van een omgekeerde microscoop Raman vanwege de hoogte van de platen. Anders moet een lage vergrotingsfactor voor de microscoopobjectief Raman de plaathoogte 96 putjes tegemoet.
| Symptoom | Mogelijke oorzaak | Mogelijke oplossing |
| Gouden nanodeeltjes aggregeren na centrifugatie en resuspensie. | De Raman reporter concentratie te hoog. | Test een reeks Raman reporter concentraties zoals gespecificeerd in paragraaf 2.2 of dit protocol. |
| Het antilichaam aan AuNP verhouding te hoog. | Verminder het aantal gePEGyleerde antilichamen gebonden aan de nanodeeltjes oppervlak deeltje stabiliteit te verhogen. | |
| Het mPEG-SH blokkeringsmiddel bindt aan de AuNP oppervlak. | Bereid mPEG-SH verse oplossing voorafgaand aan nanodeeltjes blokkeren. | |
| Niet-specifieke binding aan de immunoassay plaatoppervlak | De immunoassay plaat wordt onvoldoende geblokkeerd. | Bereid het blokkeren oplossing verse voorafgaand aan de plaat plezierctionalization. |
| Het molecuulgewicht van mPEG-SH is niet groot genoeg is. | Controleer of de mPEG-SH-molecuul voor blokkering een molecuulgewicht van 5000 kDa of groter. | |
| Zwakke of afwezige Raman signaal | De Raman reporter bindt aan het deeltjesoppervlak. | Zorgen de Raman reporter mag binden gedurende tenminste 30 minuten voorafgaand aan toevoeging van het gepegyleerde antilichaam. |
| Het molecuulgewicht van mPEG-SH is niet groot genoeg is. | Zorg ervoor dat de nanodeeltjes aftopping agent de juiste kosten voor ionische Raman reporter bindend. |
Tabel 2. probleemoplossing voor veelvoorkomende problemen. Lijst van de meest voorkomende problemen die zich tijdens het protocol met de bijbehorende oorzaken en corrigerende maatregelen items.
In dit manuscript, hebben we voorgesteld apROTOCOL voor aangepaste vervaardiging van een nanodeeltje-probe immunoassay voor analyse met behulp van UV-Vis / Raman spectroscopie. Het protocol bevat functionalisering van goud nanodeeltjes met Raman reporters en immunoglobulinen voor de directe detectie van antigenen gebonden aan een polystyreen plaat. Het protocol kan worden aangepast aan een specifieke Raman reporter en bijbehorende excitatiegolflengte passen. Gouden nanodeeltjes vorm en grootte kunnen ook worden gewijzigd. Echter, oplossing verhoudingen adequate binding zal afhangen van de Raman reporter gebruikt, alsmede het nanodeeltje grootte, vorm en fabrikant. Het protocol is geschreven om onderzoekers van toen oplossing ratio's moeten worden bepaald voor elke unieke arrangement cue en daarmee zorgen voor aangepaste fabricage volgens onderzoek behoeften. In tegenstelling tot de typische fluorescerende / colorimetrische immunoassay protocollen dit protocol heeft het potentieel grotere multiplexing vermogens daarbij optimaal op een reeds bestaande infrastructuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 ml | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 | |
| In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/ (2004).
- ELISA development guide. , [Accessed: 28-Mar-2016] https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.effemm2.de/spekwin/ (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
