La fabricación de un UV-Vis y espectroscopia Raman Plataforma de Inmunoensayo

Resumen

Las sondas ópticas basadas en nanopartículas han sido diseñadas como un vehículo para la detección de antígenos utilizando espectroscopía Raman y UV-Vis. Aquí describimos un protocolo para preparar dichas sondas para un inmunoensayo de espectroscopía UV-Vis/Raman de tal manera que incorporen futuras capacidades de multiplexación.

Resumen

Los inmunoensayos se usan para detectar proteínas en base a la presencia de anticuerpos asociados. Debido a su amplio uso en la investigación y la práctica clínica, una gran infraestructura de los instrumentos y materiales de inmunoensayo se puede encontrar. Por ejemplo, 96 y 384 pocillos placas de poliestireno están disponibles comercialmente y tienen un diseño estándar para acomodar máquinas espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) de diferentes fabricantes. Además, una amplia variedad de inmunoglobulinas, etiquetas de detección, y agentes de bloqueo para diseños personalizados de inmunoensayos tales como ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) están disponibles.

A pesar de la infraestructura existente, kits de ELISA estándar no cumplen todas las necesidades de investigación, lo que requiere el desarrollo de inmunoensayo individualizado, que puede ser costoso y consume mucho tiempo. Por ejemplo, kits de ELISA tienen baja multiplexación (detección de más de un analito a la vez) capacidades, ya que por lo general dependen de la fluorescencia o la colmétodos orimetric para la detección. Colorimétricos y análisis basados ​​fluorescentes tienen una capacidad limitada de multiplexación debido a picos anchos espectrales. Por el contrario, los métodos basados ​​en la espectroscopia Raman tienen una capacidad mucho mayor para la multiplexación debido a picos de emisión estrechos. Otra de las ventajas de la espectroscopia Raman es que los reporteros Raman experimentan significativamente menos photobleaching que las etiquetas fluorescentes ^1. A pesar de las ventajas que tienen sobre la prensa Raman etiquetas fluorescentes y colorimétricos, protocolos para fabricar los inmunoensayos basados ​​en Raman son limitadas. El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo para preparar sondas funcionalizadas para utilizar en conjunción con placas de poliestireno para la detección directa de analitos por análisis UV-Vis y espectroscopía Raman. Este protocolo permitirá a los investigadores a adoptar un enfoque do-it-yourself para la futura detección de múltiples análisis al mismo tiempo aprovechar la infraestructura ya establecida.

Introducción

inmunoensayos de tipo sándwich típicos detectar indirectamente la presencia de un antígeno usando dos anticuerpos. El anticuerpo de captura se une a una superficie sólida y forma un complejo anticuerpo-antígeno cuando en la proximidad de un antígeno apropiado. Un anticuerpo de detección se presentó a continuación y se une al antígeno. Después del lavado, el anticuerpo / antígeno / restos complejo de anticuerpo y se detecta por el anticuerpo de detección marcado tal como se demuestra en la Figura 1A. Detección típica se realiza por un detector fluorescente o colorimétrico, lo que limita la multiplexación a 10 analitos debido a picos anchos espectrales....

Protocolo

1. Preparación de tampones

1. Phosphate Buffered Saline (PBS)
   1. Diluir 50 ml de 10x PBS con 450 ml de agua de grado HPLC para hacer una concentración de 1 x PBS. Filtro estéril la solución con un filtro de 0,22 micras.
   2. Conserve la solución a temperatura ambiente.
2. Preparación de solución salina tamponada con Tris + Tween 20 (TBST)
   1. Diluir 50 ml de solución salina tamponada con Tris 10x (TBS) con 450 ml de agua de grado HPLC para hacer una concentración 1x. Añadir 250 l de Tween-20 para un 0,05% (v / v) de Tween-20. Filtro estéril la solución con un filtro de 0,22 micras.
   2. A....

Resultados

En este estudio, se utilizaron 60 partículas de oro nm para espectroscopía UV-Vis. UV-Vis espectros de absorción de 400 a 700 nm fueron recogidos y las áreas de los picos correspondientes a cada concentración AuNP se determinaron usando un software de análisis espectral de código abierto ^8. Antes de pico de integración, los espectros recogidos se sometió a corrección de línea base usando un ajuste polinómico de tres puntos. Áreas de los picos se utilizaron para generar una curva de calibración logarítmica com.......

Discusión

En el protocolo detallado, hay varios puntos críticos para abordar. Una cuestión es la elección del reportero Raman y nanopartículas de oro. Aunque el protocolo fue escrito para ser adaptado para su uso individual, el Raman reportero DCTC fue utilizado como un ejemplo. DCTC es un reportero de carga positiva y se une a superficies tales como citrato AuNPs capsulado cargado negativamente. Este protocolo puede ser adaptado para la prensa de carga negativa mediante el uso de nanopartículas de oro con una carga superficial p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nanopartícula de oro de 60 nm	Ted Pella, Inc.	15708-6	Se trata de nanopartículas de oro recubiertas de citrato. Por favor, consulte la discusión para conocer la relación entre el reportero Raman y la carga superficial de AuNP y su importancia para la selección adecuada del reportero AuNP y/o Raman.
Bicarbonato de sodio	Fisher Scientific	S233-500
Metanol	Pharmco-Aaper	339000000
Tris Solución salina tamponada (10x) pH 7.5	Scy Tek	TBD999
Unidad de filtración de tapa de botella	VWR	97066-202
Tween 20 (polisorbato 20)	Scy Tek	TWN500	Se utiliza como agente emulsionante para las etapas de lavado.
Solución salina tamponada con fosfato 10x concentrado, pH 7.4	Scy Tek	PBD999
Protein LoBind Tube 2.0  ml	Los tubos Eppendorf 22431102		tubos LoBind evitan la unión de proteínas y AuNPs a las superficies de los tubos.
Tubo LoBind de proteínas 0.5  ml	Los tubos Eppendorf 22431064		tubos LoBind evitan la unión de proteínas y AuNPs a las superficies de los tubos.
Dispositivos de microplacas UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	Se utiliza para sellar y almacenar placas funcionalizadas.
Placa de ensayo, con tapa de baja evaporación, fondo plano de 96 pocillos	Costar	3370
Agua de grado HPLC	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3′-yoduro de dietiltiatricarbocianina (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Raman reportero
mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gramo	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1  gramo	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA tiene un extremo NHS.
IgG de ratón, control de molécula entera	Thermo Fisher Scientific	31903	Antígeno
cabra anti-IgG de ratón (H + L) Anticuerpo secundario adsorbido cruzado	Thermo Fisher Scientific	31164	Anticuerpo
Solución de bloqueo de albúmina sérica humana	Sigma Aldrich	A1887-1G	su lugar, se puede utilizar albúmina de suero bovino.
Mini centrífuga	Fisher Schientific	12-006-900
Espectrofotómetro UV-Vis	Thermo Scientific	Nanodrop 2000c
Espectrofotómetro UV-Vis	BioTek	Synergy 2
Columnas de desalinización	Thermor Scientific	87766
Fabricación propia 785  Unidad de microscopio Raman invertido	N/A	N/A	Un microscopio Raman invertido es el mejor para enfocar correctamente la superficie de la placa de pocillo. De lo contrario, se utilizará un aumento muy bajo debido a la altura de la placa de 96 pocillos. Se utilizó un sistema construido internamente, ya que era más barato que comprar a un proveedor. Sin embargo, se puede utilizar cualquier sistema de microscopio Raman invertido disponible en el mercado.

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