Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

Published: October 4, 2017 doi: 10.3791/55982
Automatic Translation
*1,2, *1, *1, 1,3, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של microcryogels אלסטית macroporous תלת-ממד על-ידי שילוב מיקרו-מלאכותית עם טכנולוגיית cryogelation. בעת טעינת עם תאים, נוצרים 3D microtissues, אשר יכול להיות מוזרק בקלות בתוך vivo כדי להקל על הטיפול משובי או לצרפן מערכים להקרנה תפוקה גבוהה סמים ' במבחנה .

Abstract

לשדרג תרבית תאים דו-ממדית מסורתית תרבית תאים תלת-ממד, לנו יש משולב מיקרו-מלאכותית עם cryogelation טכנולוגיה כדי לייצר cryogels microscale macroporous (microcryogels), אשר ניתן לטעון עם מגוון רחב של סוגי תאים כדי ליצור microtissues תלת-ממד. במסמך זה, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לפברק microtissues תלת-ממד תכליתי ושימושיהם לטיפול רגנרטיבית ו והתרופות הקרנה. הגודל של צורה-הקמת microcryogels יכול להיות מפוברק על שבב מערך, אשר יכול להיות שנקטפו את שבב כמו ספקים יחידים שנטענו תא לטיפול משובי להזרקה או להיות בהמשך שהורכבו על שבב לתוך מערכי microtissue תלת-ממד עבור תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה. בשל אופיו אלסטי גבוהה של אלה cryogels microscale, microtissues 3D התערוכה injectability נהדר לטיפול פולשנית תא על-ידי הגנה על תאים מכוח מכני הטיה במהלך ההזרקה. פעולה זו מבטיחה הישרדות cell משופרת, האפקט הטיפולי במודל איסכמיה איבר העכבר. בינתיים, הרכבה של מערכים 3D microtissue בתבנית תקנית 384-multi-ובכן מקלה את השימוש נפוץ למתקני המעבדה וציוד, הפיכת סמים תפוקה גבוהה הקרנת בפלטפורמה זו תרבות תא תלת-ממד תכליתי.

Introduction

תרבית תאים מסורתי על משטחים (2D) דו מימדי שעברו שיטוח, כגון לצלחת תרבות או צלחות רב טוב, בקושי יכול להפיק תא התנהגויות קרוב מדינות מקורי שלהם. החוק הביוגנטי מדויק של יליד microenvironments הסלולר, המהווים תא מסוגים שונים, מטריצה חוץ-תאית וכן גורמים מסיסים ביואקטיביות ארכיטקטורות תלת מימדי (3D)1,2,3 ,4, חיוני לבניית biomimicking רקמות במבחנה עבור יישומים ב רפואה הנדסי, רגנרטיבית רקמות, ביולוגיה היסוד למחקר, סמים גילוי5,6,7 8, ,9.

במקום תרבית תאים 2D, תרבית תאים 3D נעשה שימוש נרחב כדי לקדם את המיקרו-ארכיטקטוני ביונים ותרבותית פונקציונלי תכונות של תאים במבחנה. שיטה תרבות פופולרית תא 3D הוא התאים צבירה spheroids7,8,9,10. Spheroids הסלולר יכול להיות מוזרק לרקמות פצוע עם שימור הסלולר משופרת של הישרדות לעומת הזרקה של התאים התפזרו. עם זאת, לא אחידה ספרואיד וגדלים נמנע פגיעה מכנית המוטלות על תאים בכוח גזירה נוזלים במהלך ההזרקה להוביל תא המסכן השפעות טיפוליות11,12,13. באופן דומה, הלא-ריינולדס במהלך צבירה של spheroids הפך שלהם תרגום 3D מבוססת תא תפוקה גבוהה סמים הקרנת מאתגר10.

שיטה נוספת עבור תרבית תאים תלת-ממד מושגת בסיוע biomaterials, המכנסת בדרך כלל התאים hydrogels מימית או פיגומים נקבובי. היא מאפשרת וגמישויות גדול לבניית ארכיטקטורות תלת-ממד. לטיפול, תאים במארז בצובר פיגומים מועברות בדרך כלל הגוף החי באמצעות השרשה כירורגי, אשר פולשנית וטראומטית, ומכאן הגבלת שלה תרגום רחב אל מיטתה. מצד שני, hydrogels מימית מאפשרים טיפול פולשנית באמצעות הזרקת תאים מושעה בפתרון קודמן הידרוג לתוך גופים בעלי חיים, ומאפשר בחיי עיר gelation ויה תרמו-כימיים או אנזימטי crosslinking11. אולם, כמו תאים מועברים בזמן סימנים מקדימים הידרוג נמצאים עדיין במצב מימית, הם גם חשופים מכניים הטיה במהלך ההזרקה. לא רק אז, crosslinking כימי או אנזימטי במהלך בחיי עיר gelation של הידרוג גם עלול לגרום נזק לתאי בתוך. להקרנה סמים, תרביות תאים בסיוע biomaterial מול בעיות עם אחידות, בקירות וצפיות והתפוקה. שימוש hydrogels, תאים בדרך כלל מעורבים במהלך gelation, שבו התהליך עשוי להשפיע על הכדאיות תא ותפקוד. Gelation במהלך תא זריעה גם מקשה שימוש על ידי רוב הציוד תפוקה גבוהה, כיוון הידרוג ייתכן שיהיה עליך לשמור על הקרח כדי למנוע gelation לפני תא זריעה, הידרוג עלול לשבש שחולק עצות, אשר הם בדרך כלל מאוד רזה כדי להבטיח דיוק עבור הקרנת תפוקה גבוהה. פיגומים הקבועים מראש יכול באופן פוטנציאלי להפריד הליכי ייצור biomaterial תרבית תאים, עם זאת רוב מוצרים מבוססי לגרדום זמינים כמו חומרי תפזורת עם תפוקה נמוכה יותר יחסית14.

כדי להתגבר על חלק החסרונות של שיטות התרבות תלת-ממד, פיתחנו טכנולוגיה מיקרו-מלאכותית-cryogelation משולב להמציא שבב של מערך מדף וידידותית microcryogel15. פרוטוקול זה, ג'לטין מסומנת לצורך המחשה טכניקת ייצור microcryogel כפי זה מסתיימים, מתכלה, חסכונית, ללא כל שינוי נוסף נדרש עבור התא מצורף. פולימרים אחרים של מקורות טבעיים או סינתטיים יכול לשמש גם עבור פבריקציה נוספת, בהתאם ליישום. באמצעות טכנולוגיה זו, אנו יכולים לפברק microcryogels קימור קטן וגמיש מאוד לשליטה בגודל, צורה, פריסה. בעת טעינת עם מגוון רחב של סוגי תאים, 3D microtissues יכול להיווצר ליישומים שונים. תכונות ייחודיות אלה מאפשרות injectability הרצויה, הגנה על תאים ושמירה האתר מכוון לאחר הזרקת ויוו לאפקטים טיפולית משופרת. לא רק אז, microcryogels יכולה להיות מעובד יותר כדי ליצור מערכים 3D microtissue התואמים נפוצות מעבדתי וציוד כלים להבין תרבית תאים תפוקה גבוהה רב-תכליתי והתרופות הקרנה, מבחני סלולר אחרות. במסמך זה, שיפורט תהליך ייצור של microcryogels והטיפול שלאחר כמו microtissues 3D בודדים או מערכים microtissue תלת-ממד עבור שני יישומים חשובים, טיפול בתאי והתרופות הקרנה, בהתאמה10,15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים עקב פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה חיה על מרכז של אנליזה ביו-רפואית, באוניברסיטת צינג. תחת אישור של ועדת האתיקה, רקמת שומן אנושי ממנו הושג המחלקה של ניתוחים פלסטיים של פקין האיחוד חולים עם הסכמה מדעת של החולים-

1-ייצור של תלת-ממד Microcryogels

  1. עיצוב, ייצור של שבבים microstencil
    1. שימוש תוכנה מסחרית כדי עיצוב מערכים של גיאומטריות ספציפיים, כגון עיגולים, אליפסות, משולשים או תלתן 14, בהתאם ליישום עוקבות.
      הערה: עיין בסעיף 2 הפרוטוקול עבור רפואה רגנרטיבית ו סעיף 3 פרוטוקול להקרנה סמים עבור פרטי העיצוב.
    2. לייבא את העיצוב הלייזר פיתוחי תוכנה המלווה את מכונת חריטה בלייזר. באמצעות הגדרות לייזר על-פי המלצות היצרן למכונת חריטה בלייזר, לייזר-חריטה את העיצוב מיובאים פוליפוני (methymethacrylate) (PMMA) גליונות.
    3. לרחוץ את microstencil שבבים במים יונים כדי לנקות פסולת חריטת לייזר. יבש המערך microstencil שבבי בחנות 60 מעלות צלזיוס בתוך שקית אטומה בטמפרטורת החדר במשך חודשים.
  2. ייצור של שבבים microcryogel
    1. microstencil מקום 4 מערך שבבי על המגש מדגם ולהוסיפה הפלזמה מנקה. . סגור את הדלת של שואב האבק, להפעיל את משאבת ואקום למשך 2 דקות ולאחר מכן להפעיל את הכוח המקסימלי RF (18 W) לטיפול microstencil מערך השבבים הפלזמה מנקה במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להגדיל את hydrophilicity.
    2. הוסף 0.06 גרם ג'לטין יונים 1 מ"ל מים טופס 6% (wt/כרך) ג'לטין קודמן פתרון (מספיק כדי להפוך את שבבי 5). חם ב 60 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים כדי להמיס במידה מספקת. דגירה על קרח במשך 5 דק
    3. להוסיף 3 µL של גלוטראלדהיד לתוך הג'לטין קודמן לפתרון הסופי בריכוז 0.3%. לערבב ביסודיות.
    4. פיפטה 200 µL קודמן פתרון עם גלוטראלדהיד על גבי המשטח העליון של השבב מערך microstencil.
      הערה: 200 µL מספיקה עבור שבב 75 מ מ × 25 מ מ ללא קשר לעיצוב. להגדיל את הסכום באופן פרופורציונלי כאשר גדל שטח הפנים של השבב.
    5. ידנית פזר את הפתרון באופן שווה על השבב על ידי גירוד הגב הלוך עם מוט זכוכית כיפוף פי 2 עד פי 3.
      הערה: כל מיקרו-ובכן על השבב microstencil יכול להיות מלא עם פתרון קודמן בשל טבעם הידרופילית לאחר טיפול פלזמה.
    6. מיד למקם את השבב מערך קודמן-פתרון-מלא במקפיא-20 ° C עבור ה 16 עבור cryogelation.
    7. התאם איזה שהוא לופילייזר-40 מעלות במשך 30 דקות למקם את מערך שבבי לאחר cryogelation בתוך איזה שהוא לופילייזר ואת lyophilize של השבבים עבור 2 h בואקום.
      הערה: ג'לטין microcryogels עם macropores מחוברים נוצרות בגלל הקרח יצרו במהלך cryogelation sublimes, איזה שהוא לופילייזר.
    8. להמשיך לסעיף 2 לטיפול של איסכמיה איבר חיוני (CLI) ואת סעיף 3 עבור תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה.

2. קציר Microcryogels בודדים כדי טופס להזרקה Microtissues תלת-ממד עבור טיפול של CLI

  1. microcryogels בודדים קציר
    1. עיצוב מערכים (75 מ"מ × 25 מ"מ) חוגים 600, כל אחד עם קוטר 400 מיקרומטר, ב תוכנה מסחרית לבנייה להזרקה microtissue תלת-ממד. השתמש PMMA של 300 עובי מיקרומטר להרכבת microstencil מערך השבבים בדברי ההסבר בסעיף 1.1.
    2. לפברק שבבים microcryogel כמו בסעיף 1.2.
    3. לפברק מערך PDMS מפליט Pin עם אותו עיצוב כמו צעד ליתוגרפיה רך תקן 16 , 2.1.1 17.
    4. מכסים את השבב מערך microcryogel על המערך PDMS מפליט Pin, יישור כל microcryogel עם הפין מפליט במערך. הקש את השבב מערך microcryogel לקראת המערך pin מפליט לדחוף את microcryogels החוצה microwells עם הסיכות בולטות על המערך pin מפלט PDMS למסוק microcryogels בודדים.
    5. לקצור את microcryogel לתוך המים ולאסוף אותם בעזרת תא strainers. השתמש מסננת אחת כדי לאסוף microcryogels של שבב אחד (כלומר, 600 microcryogels).
    6. שטיפת microcryogels עם NaBH 0.1 M 4 על קרח במשך 20 דקות להרוות את שאריות אלדהיד uncross-מקושר. השתמש 5 מ של 0.1 M NaBH 4 לכל שבב. התעלם NaBH 4. ולשטוף עם יונים 5 מ"ל מים למשך 3 עד 5 פעמים, 15 דקות בכל פעם.
    7. למחוק את המים מסננת התא, לאסוף את microcryogels לתוך אשכול אחד לכל תא מסננת ומניחים אשכול אחד אחד צלחת פטרי של 35 מ מ, באמצעות פינצטה מעוקל. להוסיף 50-70 µL יונים מים לאשכול בכל ולכסות את מכסה צלחת פטרי. טפח בעדינות על צלחת פטרי על פלטת שולחן לשלב את כל microcryogels, כך microcryogels לא משקרים על גבי microcryogel נוספת כדי ליצור של טפט של microcryogels על פני הפטרי.
    8. להקפיא את microcryogels שנקטפו ב-20 ° C עבור 4 עד 16 שעות לפני lyophilizing אותם עבור 2 h (ראה שלב 1.2.7). לאחסן microcryogels בוואקום בטמפרטורת החדר עד שימוש נוסף.
  2. אפיון של microcryogels
    1. להעריך את נקבוביות microcryogels על-ידי סריקת הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM).
      1. Immobilize microcryogels שנקטפו, lyophilized על גבי בעל מדגם על ידי דבק דו-צדדי והמעיל עם זהב עם coater לרעוד. להוציא עבור 90 s, לפני הדמיה ב SEM 11. להעריך ולנתח את ההפצה של קטרים של הנקבוביות ב microcryogel של שבע תמונות SEM שונות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.
    2. שוקל אשכול אחד של 600 lyophilized microcryogels בצלוחית 35 מ מ למשקל של ג'לטין יבשים microcryogels (גרמים). להוסיף מים µL יונים 60 מקבץ של lyophilized microcryogels ולחכות 30 s עבור microcryogels לספוג את המים באופן מלא להתנפח. לשקול את microcryogels נפוחות. יחס נפיחות
      1. לקבוע האיזון ואת נקבוביות microcryogels, כמו היחס בין המשקל של microcryogels נפוחות של ג'לטין יבשים microcryogels, היחס בין משקל של מים שנערך ב microcryogels לזה של microcryogels רטוב, בהתאמה 13.
    3. Injectability מידה של microcryogels באמצעות משאבה מזרק לתכנות משולב עם כוח דיגיטלי מד 14.
      1. כתם 600 חתיכות של microcryogels על ידי Trypan כחול ו להשעות בפתרון 600 µL 15% ג'לטין כדי להשיג תפוצה הומוגנית. לטעון את הבולם microcryogel 1 מ"ל במזרק 1 מ"ל. להזריק את התערובת דרך מחט 27-מד המצורפת את המזרק 1 מ"ל באמצעות משאבה מזרק לתכנות בקצב הזרימה של 1 מ"ל לדקה
      2. הזרקת בזמן אמת צג כוח בכוח דיגיטלי מד בדיקות, התווה את עקומת כוח-זמן. לאחר ההזרקה, לבחון את תקינות microcryogels תחת מיקרוסקופ.
        הערה: סקאוטרים מושעה בפתרון ג'לטין 15% (wt/כרך) יכול להיות בצורה חלקה מוזרק, נשארה לאחר ההזרקה-
    4. לאפיין את degradability של microcryogels.
      1. ראשית, למדוד את המשקל של אשכול אחד של 600 microcryogels lyophilized בצלוחית 35 מ מ כמו משקל יבש. לאחר מכן, לטבול microcryogels lyophilized 600% 0.025 מ ל 2 (vol/כרך) טריפסין/EDTA.
        2. Microcryogels
      2. לאסוף מן הפתרון באמצעות מסננת תא בנקודות זמן שונות (כלומר, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 דקות). הפתיל פתרון עודף משם עם טישו. למדוד את המשקל של microcryogels בנקודות זמן שונות ולחשב למידת השפלה, כמו היחס בין המשקל של microcryogel בנקודת זמן מסוימת לזה של microcryogel בזמן אפס.
  3. Autoloading של תאים לתוך microcryogels כדי microtissues 3D טופס
    1. לחטא microcryogels מ שלב 2.1.8 תגובה על אתילן אוקסיד מערכת עיקור בחשיפה גז 12 שעות ולאחריו 12 שעות degassing תחת vacuum.
    2. לבחור שומן, נגזר mesenchymal סטרומה תאים אנושיים (hMSCs) לטיפול של העכבר איסכמי hindlimb. תאים ולבודד שגרות בעקבות דיווח כאמור 18.
    3. HMSCs תרבות בבית הגידול בינוני המכיל 2% סרום שור עוברית (FBS) 10 ננוגרם למ"ל גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 10 ננוגרם למ"ל נגזר טסית פקטורי גדילה bb (PDGF-bb), 1 X אינסולין transferrin סלניום (ITS), דקסמטסון 10 -8 מ', 10 -4 M חומצה אסקורבית 2-פוספט, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100 ב- DMEM/F12. המעבר את התאים על היחס של 1:3 כאשר confluent. להשתמש בתאים של המעבר 3 עד 5 הניסויים הבאים.
    4. למסוק hMSCs עם טריפסין, לכמת את מספר הטלפון באמצעות חדר הספירה פוקס-רוזנטל, resuspend על צפיפות של 8 x 10 6 תאים/מ ל מדיום הגידול hMSCs.
    5. פיפטה 60 µL hMSCs השעיה על גבי טפט של 600 microcryogels בקוטר של 400 מיקרומטר בקערה 35 מ מ מ סעיף 2.1. תאים נספגים באופן אוטומטי לתוך נקבוביות המיקרו-מבנים microcryogels.
    6. תחזוקה בתוך תא humidified דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לאפשר תאים לצרף. לאחר שעתיים של דגירה, להוסיף 2 מ"ל תרבות בינוני. לשנות את המדיום כל יומיים. תרבות טעונים hMSCs microcryogels 2 ימים ליצור 3D microtissues.
    7. לאחר 2 ימים culturing, פיפטה microcryogels נטען hMSCs 100 לכל טוב על צלחת 96-ובכן, להוסיף µL 120 של הפתרון עובד resazurin המוכנים לפי היצרן ' s ההוראה בכל טוב. תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. קרינה פלואורסצנטית
      1. זיהוי של resazurin מטבוליזם על ידי תאים קיימא קורא microplate עם אורך גל האור עירור של 560 nm ו פליטת אור גל של 590 ננומטר. ליצור עיקול רגיל של מספר הטלפון הנייד נגד קרינה פלואורסצנטית שימוש hMSCs כדי לבצע אינטרפולציה מספר הטלפון הנייד של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לניסוי בעתיד על פי פרוטוקול ערכת 13.
    8. להעריך את מספר hMSCs ב microcryogels מיום 0 ליום 4 שימוש resazurin כפי שמתואר צעד 2.3.7 מיום 0 יום 4-
    9. כתם תאים microcryogels עם שבערך דילול של Calcein AM, לדילול 1:250 Propidium יודיד (המכונה חיים/מתים מכתים) בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) ולצפות תחת מיקרוסקופ זריחה או מיקרוסקופ קונפוקלי קרינה פלואורסצנטית.
  4. הזרקה של תלת-ממד microtissues ויוו לטיפול של CLI במודל עכבר
    1. להקים hindlimb קריטי איסכמיה של עכברים העירום הנשי BALB/c כמו שדווח 11 , 19 כדי לקבוע את האפקט הטיפולי של טיפול מבוסס-microtissue 3D.
    2. להעביר את microtissues צעד 2.3.6 באמצעות פיפטה 5-mL לתוך מסננת תא ולסנן משם המדיום תרבות.
    3. Resuspend microtissues 3D טעונים hMSCs ב- 15% ג'לטין פתרון, צפיפות של microcryogels 100 לכל 100 פתרון µL.
    4. לפני הניתוח, לחטא כלי ניתוח על ידי תא לחץ ולבצע ניתוח בחדר ניתוח בעלי חיים במרכז המתקן חיה.
    5. הנח את העכבר אל החדר אינדוקציה הרדמה המכיל 1-3% איזופלוריין 100% חמצן בספיקה של 1 ליטר לדקה אריתרומיצין החל על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות. דרך חתך בעור 1-ס מארוך, מאתרים ומפסיקים את עורק הירך ואת סניפיה בתפרים משי 5-10, בלו 19.
    6. הכנס indocyanine ירוק (ICG) (0.1 מ"ל של µg 100/mL) דרך הווריד הזנב של זריקה כדי לפקח על זרימת הדם. לבצע הדמיה פלורסצנטיות ICG באמצעות פלורסצנטיות מערכת הדמיה (כאן, מערכת תוצרת בית) הגיאומטריה של השתקפות 11.
    7. Intramuscularly להזריק microtissues לתוך שלושת האתרים של השריר העדין סביב החתך בעורק באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 23-מד-
    8. לאחר הניתוח, לחמם את העכבר עם כרית מחוממת לכלוב. שחזור. מזריקים subcutaneously meloxicam כדי להקל על הכאב ולנטר ברציפות עד ער.
    9. לאחר 28 ימים, לנטר את היעילות הטיפולית של האיבר שטופלו microtissue תלת-ממד על-ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה 11.
      הערה: להזריק subcutaneously meloxicam כדי להקל על הכאב כאשר העכבר הראה גפה ספונטנית.
    10. Euthanize עכברים עם פחמן דו חמצני לאחר השלמת הניסויים.
      הערה: כאן, המתת חסד עם פחמן דו חמצני בוצעה לפי פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה חיה על מרכז של אנליזה ביו-רפואית, באוניברסיטת צינג.

3. הרכבה של Microtissue מערך השבבים לסינון סמים תפוקה גבוהה

  1. הרכבה של מערך microcryogel לתרבות בשבב תא
    1. שינוי העיצוב בסעיף 1.1 על-פי ממדי הצלחת רב היטב קונבנציונלי, כלומר, עבור תבנית 384-multi-ובכן, עיצוב מערך × 24 16 בארות (שורה לפי עמודה), כל אחד בקוטר 2 מ מ מרכז למרכז ריווח 4.5 מ מ.
    2. לייזר חריטה על גבי גיליון PMMA עבה מיקרומטר 500 כמתואר בסעיף 1.1.
      3. Microcryogels
    3. Fabricate כמתואר בסעיף 1.2 באמצעות שהשבב 384-multi-ובכן מערך המתקבל שלב 3.1.2. זה מערך המכיל microcryogel מיועדת כמו השבב מערך microcryogel.
    4. לרחוץ את השבב מערך microcryogel עם 50 מ ל- 0.1 M-NaBH-4 כדי להרוות את כל אלדהיד שיורית uncross-מקושרים, ואז שוב ושוב לשטוף עם יונים 50 מ"ל מים כבר 3 פעמים, שעתיים בכל פעם.
    5. למחוק את המים, להקפיא את השבב מערך microcryogel ב-20 ° C עבור 4 עד 16 שעות לפני lyophilizing על פי שלב 1.2.7.
    6. עיצוב מערך שינוי 384-multi-הבאר בשלב 3.1.1 להכיל 16 × 24 בארות, כל אחד בקוטר 3 מ מ מרכז למרכז ריווח 4.5 מ מ.
    7. להסיר צד אחד של הגיבוי של גיליון של דקים (10 מיקרומטר) מסתיימים דו-צדדית דבק סלוטייפ ולהדביק אותו לצד אחד של פיסת גיליון PMMA 3-מ מעבה. לייזר חריטה העיצוב משלב 3.1.4 על גבי גיליון PMMA זה 3-מ מעבה לפי סעיף 1.1. מערך זה הוא יועד המערך מאגר.
    8. יישור המערך microcryogel שבב עם השבב מערך מאגר וציות יחד בחוזקה כדי להרכיב את השבב מערך microcryogel תלת-ממד עבור תרבית תאים על שבב. לחטא לקרינה אולטרה סגול עבור ה 1
    9. חנות microcryogel תלת-ממד מערך שבבי בואקום בטמפרטורת החדר לניסויים נוספים-
  2. סמים הקרנת במערכים 3D microtissue
    1. למלא תיבה רטוב עם 25 מ ל מים מיוננים סטרילי כדי לשמש תא לחות על תרבית תאים. קדם הלוהט % 5 humidified חממה 2 CO ל- 37 מעלות צלזיוס.
    2. לקצור תאי סרטן ריאות שאינם קטנים התא (NCI-H460), תאי קרצינומה hepatocellular (HepG2) מן הלוחות תרביות רקמה על פי הנוהל המקובל, להשעות מחדש ב תרבות המדיה צפיפות הסופי של 1.0 x 10 6 תאים למ"ל. לערבב ביסודיות.
      הערה: RPM1640 עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100 µg 100/mL סטרפטומיצין משמש NCI-H460. להשתמש DMEM עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100 µg 100/mL סטרפטומיצין HepG2.
    3. להסיר תא לחות חממה. השתמש פינצטה בזהירות המקום 3D שהורכב microcryogel מערך שבב מ שלב 3.1.9 בבית הבליעה לחות. קח זהירות לא להרטיב את microcryogels עם מים בתא.
    4. לערבב התליה תא ביסודיות, ואז aliquot µL 3 של השעיה תא ישירות על גבי microcryogel כל טוב.
      הערה: הטיפ פיפטה יגע בקלילות את פני השטח של microcryogel לפני גירוש תא ההשעיה. תאים הם נטען אוטומטית microcryogel על ידי ספיגה. זרע לא התאים הבארות היקפיים.
    5. להוסיף 10 μL של מדיה מכל קידוח לאחר תאים הם נזרע לתוך microcryogel באמצעות פיפטה רב ערוצית, כגון מלווה נוזלי 96-ערוץ. בינוני מתווסף גם בארות היקפיים.
      הערה: שימוש RPM1640 מדיה עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100 streptomyci 100 µg/mLn עבור תאים H460. להשתמש במדיה DMEM עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100 µg 100/mL סטרפטומיצין עבור תאים HepaG2.
    6. תרבות המערך microcryogel טעון תא םרות תא לחות במשך 24 שעות ביממה ב- 5% humidified חממה 2 CO ב 37 מעלות צלזיוס למערך 3D microtissue טופס.
    7. התמוססות דוקסורוביצין, IMMLG-8439 9 ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי ליצור פתרון מניות של 10 מ מ. לדלל סמים עם תרבות בינוני כדי ליצור מעבר הדרגתי ריכוז דילול 10-fold 2 ננומטר מיקרומטר 200.
    8. µL להוסיף 10 פתרונות סמים לתוך כל טוב. השתמש 0.1% דימתיל סולפוקסיד (מדולל בינוני) של הפקד. דגירה המערך microtissue 3D טעון סמים ב- 5% humidified חממה 2 CO ב 37 ° C עבור ה 24
    9. להוסיף 4 µL resazurin פתרון מלאי כל טוב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למערך ה 2 מקום 3D microtissue בקורא ה-microplate ולגלות זריחה של resazurin מטבוליזם על ידי התאים קיימא-גל אור עירור של 560 nm ו פליטת אור גל של 590 nm.
    10. להחסיר את האות הבסיסית resazurin בארות כל לפני עיבוד נתונים נוספים. חישוב השבר הכדאיות התא של כל טוב על-ידי חלוקת האות פלורסצנטיות ע י האות הממוצע פלורסצנטיות הבארות שליטה.
    11. התווה את עקומת מנה-תגובה ההתוויה תוכנה עם השבר הכדאיות תא ציר ה-y, את הלוגריתם בסיס 10 של ריכוז התרופה כמו ציר ה-x. אינטרפולציה הריכוז עיכוב 50% (IC50)-השבר הכדאיות תא של 0.5-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ייצור ואפיון של microcryogels עבור microtissue תלת-ממד מערך.

על פי פרוטוקול זה, microcryogels זוייפו. טופס 3D microtissues ו microcryogels בודדים או מערכים microcryogel, הוחלו על טיפול משובי וסמים הקרנה, בהתאמה (איור 1). Microstencil שבבים מפוברק מן PMMA הוחלו כמו micromolds עבור microcryogel שבבים. יכול להיות מוכנים גיאומטריים משתנה השבב מערך microstencil. בחרנו נציג 45 מ מ x 14 מ מ microstencil מערך השבבים כדוגמה, אשר הכיל צורות שונות (כלומרמעגל, אליפסה, משולש, תלתן) ו שבב מערך microstencil בצורת עיגול בגדלים שונים (קטרים = 100, 200, 400, 800? m). כדי לשפר את הנראות של micromolds עם הצ'יפס מערך, אפינפרין אור-תאורה תמונות נצפו (איור 2 א, ב'). Microcryogels שנקטפו האסימונים המערך הציג הרצוי צורות וגדלים (איור 2C, יח). אולי יכול להיות מיושם כזה microcryogels בתכונות הגיאומטריות הרצוי כתבניות כדי ליצור יחידות סלולר שונות המחקות מסוימים ארכיטקטורות של רקמות מקורית. סקאוטרים שנקטפו (ג'לטין microcryogels) היה מוגדר מראש צורות וגדלים (איור 3 א). SEM תצפית הראו כי microcryogels כולל מבנים מחוברים macroporous עם גודל הנקבוביות בטווח של 30-80 מיקרומטר (איור 3B).

Injectability משופרת של עמוס hMSCs microtissues בשביל להציל איבר איסכמי משופר

באמצעות המשאבה מזרק לתכנות משולב עם מד כוח דיגיטלי14, injectability של סקאוטרים הוערכה באופן כמותי. בספיקה של 1 מ"ל/min, גרמים עם צפיפות של microcryogels 1,000 לכל mL הוזרקו מתחת לגיל 6 N, שהיה נמוך יותר הכוח קליני מקובל של N 1020 (איור 3F). מבסס על הגנה על תאים זמינה על-ידי גרמים, hMSCs ב סקאוטרים הייתה גבוהה הכדאיות ומתוחזק קיבולת proliferative נהדר לאחר ההזרקה במהלך 5 ימים של תרבות (איור 3 H).

המודל איסכמיה איבר העכבר נבחר כדי להעריך את היעילות הטיפולית של microtissues נטען hMSC להזרקה. מצב פיזיולוגי של הגפיים איסכמי נבחנה 28 ימים לאחר הניתוח (איור 4A). להציל איבר לא נצפתה המזויפים בקבוצה או קבוצת הביקורת גרמים. בקבוצה 105 נצרכו לטיפול, קטיעה הבוהן סה כ 50%, 25% הבוהן חלקית קטיעה ו חלקי 25% גפה נצפו תוך 7 ימים, והתוצאה היא 80% אובדן איבר או קטיעה הבוהן סה כ 20% לאחר 28 יום. לעומת זאת, טיפול microtissues עם 105 hMSCs מושגת להציל איבר משופרת (75%) עם רק 25% עכברים הראה קטיעה הבוהן ספונטנית לאחר 28 ימים. 106 hMSCs, המספר המינימלי תא יעילה בשימוש ברוב המחקרים הקודמים, היה נבחר לשמש בקרה חיובית21. רק 2 של העכברים 4 הראה להציל איבר, אבל לכולם היה נמק משנית.

הדם זלוף פיקוח, העריך ב לעזרת indocyanine ירוק (ICG), סוכן ה-FDA אישר חדות angiographic. התוצאה הראתה כי קרינה פלואורסצנטית אותות הופיע בהעכברים שטופלו microtissue וב -106 חינם שטופלו hMSCs העכברים. יש אין אות פלורסצנטיות ניכר hindlimbs איסכמי דמה או בקבוצה GM עד ליום 28 (איור 4B).

תוצאות אלו עוד יותר אישר כי טיפול hMSCs בסיוע microtissue תלת-ממד מושגת אפקטים מעולים טיפולית לטיפול CLI אשר מייצג את המינון המינימלי יעיל לטיפול מבוססת תא במודל עכבר עד כה.

תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה cytotoxicity microtissue תלת-ממד מערך השבב

מערך microcryogel 3D מוכנים לשימוש עבור תרבית תאים על שבב יכול להיות מפוברק בקלות על ידי שמירה על microcryogels על השבב PMMA לאחר lyophilization ושילוב עם שבב טוב-המערך המתאים עם פלסטרים מסתיימים (איור 1 ו- 5A איור). במערך תרבות זה שני חלקים לתא, השבב בראש טוב-מערך שימש מאגרים עבור התרבות בינוני, סמים פתרונות assay ריאגנטים, בעוד התאים היו תרבותי ב microcryogel 3D ותשמרו על השבב מערך התחתון. דבק דו-צדדי בין השבב מערך העליון והתחתון מותר הדור של 384 בארות בודדים עבור תרבית תאים 3D תפוקה גבוהה (איור 5B), ומכאן מתן כלי מעשי לגילוי סמים.

כמפורט בפרוטוקול, מערך 3D microtissue נוצרה על ידי ישירות זריעה תאים לתוך microcryogels לפני הוספת בינוני המאגרים. באמצעות תאים 3T3-NIH התווית על-ידי RFP, הפגנו כי התאים הופצו בצורה אחידה עם שכבות מרובות בתוך הארכיטקטורה תלת-ממד של microcryogels (איור 5C, יח). תמונות SEM הראה כי תאים דבקה בחוזקה הקירות של הנקבוביות, אפילו הציג filopodia ממושכת לאורך או לרוחב קירות סמוכים של macropores, microcryogels (איור 5E).

אז הראינו את הכדאיות של החלת את מערך microtissue תלת-ממד עבור בדיקות באמצעות שתי שורות תאים סרטן שתי תרכובות סמים תפוקה גבוהה. תאי קרצינומה Hepatocellular (HepG2) טופלו דוקסורוביצין ואילו תאי סרטן ריאות שאינם קטנים התא (NCI-H460) שטופלו IMMLG-8439, מעכב גידול חדש. חמש עד תשע ריכוזים דיסקרטית של כל תרופה נוהלו שש בארות סמוכים כמו משכפל, עם 0.1% דימתיל סולפוקסיד במדיום תרבות של הפקד שלילי. Cytotoxicity assay בוצעה באופן דומה עבור תאים תרבותי ב מסורתי צלחות רב טוב 2D. לאחר 24 שעות של דגירה, וזמינותו הכדאיות תא שימש כדי להעריך את התגובות סמים של התאים בשתי 2D and 3D. עקומות תגובת סמים שורטטו באמצעות תא מנורמל הכדאיות המחירים בריכוזים שונים בסמים, IC50 היה אז אינטרפולציה של עקומות אלה. ערך גבוה יותר IC50 מצביע על כי תאים הם יותר עמידים לתרופות. איור 5F , 5I, נצפו עלייה משמעותית בתרופתיים כאשר התאים היו תרבותי על מערך תלת-ממד microtissue מאשר ב- 2D. IC50 של דוקסורוביצין נגד תאים HepG2 הגיעו 165.959 מיקרומטר, יחסית 18.239 nM ב- 2D; IC50 של IMMLG-8439 בתאי NCI-H460 באופן דומה והועלה לדרגת 331.894 nM ב- 3D תוך רק דרישת 1.294 nM ב- 2D. התבוננות כזו היה קונקורדנציה עם דוחות של עמידות לתרופות מוגברת בתרבות 3D על תרבות 2D על ידי חוקרים אחרים,22,23.

יחסנו כזה עלייה בתרופתיים למורכבות microenvironment 3D לעומתתצורת מישוריים של תרבות 2D. תמונות SEM חשפו תאים HepG2 התאספו כמו spheroids לקשט המשטחים של macropores, microcryogel. תאים אלה מקובצים בחוזקה, אינטראקציה משופרת תא תא כזה יכול להיות מקור של עמידות לתרופות HepG222. היה גם מעניין לציין כי אשכולות תא אלו לא היו spheroids מושעה באופן חופשי כפי שהם עדיין שמר כמה אדהזיה אל המטריקס (איור 5G, H). לעומת זאת, אפיתל-mesenchymal-המעבר (החובשים) היה העריך התרחשו כאשר תאי סרטן ריאות שאינם קטנים, NCI-H460, היו תרבותי-microcryogels תלת-ממד. תאים NCJ-H460 מתפרסת כמו fibroblasts (איור 5J, K) במקום קיבוץ באשכולות כמו HepG2. לפיכך, אנחנו משערים כי עליית תרופתיים יכול להיות תוצאה של מעבר לתאי האפיתל של NCI-H460 מהעטלפים המדינה18,19,20,21,22 ,23.

Figure 1
איור 1 : סכימטי של ייצור Microtissue תלת-ממד יישום טיפול רגנרטיבית ו והתרופות הקרנה. בקצרה, microcryogel גודל, צורה-לשליטה השבב היה מפוברק של השבב PMMA מערך מאת cryogelation של ג'לטין. האסימונים microcryogel יכול להיות שנקטפו את שבב כמו microcryogels בודדים, microcryogels עוד, בודדים ניתן נטען אוטומטית עם תאים בתרבית כדי ליצור 3D microtissues לטיפול משובי להזרקה. יישום אחר של שבבי microcryogel היא להרכיב עם שבב מערך המאגר ולאחר מכן עוד יותר, טעינה תאים ותרבות לתוך מערכי microtissue תלת-ממד עבור תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2:Microstencil מערך שבבי. (A, B) תמונות של שני שבבי microstencil PMMA, המכיל מסודרים בשורות microwells עם צורות שונות (קרי, מעגל, אליפסה, משולש, תלתן), הצורה המעגלית עם גדלים שונים (קוטר: 100, 200, 400, 800 מיקרומטר), בהתאמה (A), שני המקביל microcryogel מערך שבבי (B). (C, D) תמונות מיקרוסקופיות של microcryogels בודדים שנקטפו את microcryogels שני השבבים. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. דמות זו שונתה באישור אסמכתא14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : אפיון של תלת-ממד להזרקה Microtissues. (א) תמונות של microcryogels שנקטפו. (B) סריקת אלקטרונים micrograph (SEM) תמונות של microcryogels מראה מחוברים ומבנים macroporous. (C, D) קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיים ו 3D שיחזר תמונות קונאפוקלית של עמוס hMSCs microtissues מוכתמת חיים/מתים, rhodamine phalloidin. (E) כימות של hMSCs autoloading והתפשטות של גרמים עם צפיפויות שונות טעינה ראשונית. הזרקת בזמן אמת (F) כוח מדידה עקומות לזריקות משולשת של 1,000 גרם ב 1 מ"ל של 15% (wt/כרך) פתרון ג'לטין בקצב ההזרקה 1 mL/min (1,000-1-15%). (G) חי/מת תא הכדאיות וזמינותו של עמוס hMSCs microtissues הזרקת מראש, שלאחר הזרקת. התפשטות (H) hMSCs טעון סקאוטרים שלאחר הזרקת לאחר 1, 3 ו- 5 ימי תרבות (n = 3). * p < 0.05, חד-כיווני אנובה לעומת יום 1. הנתונים מוצגים אומר ± ב- SEM... דמות זו שונתה באישור הפניה11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4:שיפור הניצולת ואת משופרת אנגיוגנזה Hindlimbs איסכמי שטופלו Microtissues להזרקה 3D. תצלומי שאם נציג (A) (n = 4), ריק microcryogels (n = 4), חינם hMSCs (105) (n = 8), hMSCs (105)-טעון microtissues (n = 8), חינם hMSCs (106) (n = 4) ב- 0, 3, 7 ו 28 יום לאחר הטיפול. קרינה פלואורסצנטית (B) תמונות 100 שהושג s לאחר ההזרקה ICG ביום 28. דמות זו שונתה באישור הפניה11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : מערך Microtissue תלת-ממד עבור תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה. (א) תצלום של מערך תלת-ממד microtissue בתבנית 384-multi-טוב לאחר הרכבה, ו- (B) resazurin תא הכדאיות assay מתבצע על המערך. (ג) RFP-3T3 תאים בתוך microcryogel פוסט-זריעה (סולם בר = מיקרומטר 200). (ד) שחזור תלת-ממד של גרעינים מכתים המתארים הומוגנית חלוקת התאים בשכבות מרובות ב- microcryogel. (E) סריקה תמונה אלקטרון micrograph של תאים RFP-3T3 מתפשט באופן נרחב על macroporous חומות microcryogels (סולם בר = 20 מיקרומטר). Cytotoxicity בדיקה של דוקסורוביצין (F) על HepG2 תאים ותאים (אני) IMMLG-8439-NCI-H460 במערך 3D microtissue מציג גדל IC50 משווה המקבילים 2D. הנתונים מוצגים אומר ± SD. (G) spheroids קטן של תאים HepG2 microcryogel (סולם בר = 100 מיקרומטר), עם הדבקות חלקי (כוכביות ב- H) על הקיר microcryogel (סולם בר = 20 מיקרומטר). NCI (J)-H460 תאים מודבקת, להפיץ בתוך microcryogel (סולם בר = 100 מיקרומטר). NCI (K)-H460 תאים fibr תערוכתמורפולוגיה oblastic (סולם בר = 20 מיקרומטר). דמות זו שונתה באישור הפניה9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הרגנרציה לרפואה במבחנה דגמים להקרנה סמים הם שני יישומים חשובים בשביל לרקמות הנדסה5,6,7,8,9. בעוד שני יישומים לצרכים שונה לחלוטין, מכנה משותף ביניהם טמון בצורך ביונים יותר culturing תנאי כדי לשפר את התא פונקציות19. רק עם פונקציות משופרות תא במחקר אפשר לטפל טוב יותר מחלות20,21, אם תאים בתרבית לשקף באופן מדויק יותר תגובות לסמים יכול להאיץ סמים גילוי6,7. תא ההישרדות לאחר engraftment ויוו היא דרישה חיונית עבור רפואה רגנרטיבית, בעוד התפוקה חשוב עבור והתרופות הקרנה לטפל אלפי תרכובות בבת אחת. אלה שתי דרישות ספציפיות ליישומים בהתאמה שלהם, לעיתים רחוקות יכול אחת הטכנולוגיות בדרישות שני. לפיכך, יש לנו באופן ייחודי משולבת טכנולוגיה מיקרו-מלאכותית עם הכנה cryogel כדי לייצר macroporous microcryogels, אשר יכול להיות שנקטפו את שבב כמו ספקים יחידים שנטענו תא לטיפול משובי, או שמר על שבב עבור עוד יותר הרכבה למערך להקרנה סמים תפוקה גבוהה. Microscale ואת macroporosity של microcryogels רומן אלה מאפשרים אוטומטי, הומוגניות טעינה של תאים על-ידי ספיגת פשוטה. באמצעות הרומן microstencil ייצור של שבבים microcryogel, מאות ואלפי microscale cryogels עם תכונות גיאומטרי אחיד לשחזור בקלות וביעילות נוצר. Microcryogels יכול להיות מוכן, המאוחסן על-ידי ואקום אריזה כמוצר מדף, מוכן לשימוש כדי להקל על הכנת microtissues תלת-ממד משותף מעבדות עבור יישומים עוקבות. בעזרת טכניקה זו פבריקציה נוספת, היינו צריכים לפגוש מכנה משותף (תנאי התרבות תלת-ממד עבור ביומימטיקה יותר) והן דרישות ספציפיות עבור יישומים שונים שני (גמישות כדי להגן על התאים במהלך זריקה עבור רפואה רגנרטיבית ו תפוקה גבוהה בתבנית המערך להקרנה סמים).

תרפיה מבוססת תא טומן בחובו הבטחה גדולה לתיקון של רקמות שנפגעו או איברים24שונים. עם זאת, תא השמירה, הישרדות cell הפארמצבטית של הטיפול הן עדיין ענייה בשל נזק מכני במהלך זריקה, זליגת גבוהה, הרקמות הסובבות, איסכמיה, דלקת בסביבת ויוו בתוך הנגע רקמות25. יש חוקרים השתמשו preformed אגרגטים הסלולר כדי לשפר את התא חינם הזרקה. עם זאת, זה דורש כמות גדולה של תאים טופס תא אגרגטים, מה שמוביל עלות גבוהה, בגודל לא אחידה מספרים צבירה בלתי נשלט26. יתר על כן, פגיעה מכנית, מוות של תאים בלתי נמנעים עדיין במהלך ההזרקה. לחלופין, טיפול בתאי בסיוע biomaterial פותחה שבו מגיבים biomaterials (למשל, תרמית או רגיש pH הידרוג) ניתן לערבב עם תאים, gelation בחיי עיר להבין תא השמירה27. עם זאת, בחיי עיר biomaterials צולבים אינם מאפשרים לקרקע של תאים במבחנה , התוצאה בחשיפה מיידית של תאים microenvironment איסכמי, דלקתיות באתר הנגע. זה דחוף כדי לפתור את הבעיות האלה כדי לשפר את היעילות הטיפולית. היתרון העיקרי של microcryogels מפוברק באמצעות פרוטוקול זה הוא injectability הרצוי שלהם כתוצאה שלהם בגודל מיניאטורי, גמישות יוצאת דופן, הקלת היישום שלהם במשלוח התא. Injectability של microcryogels מאפשרת הגנה על תאים במהלך הלידה תא, ומכאן הם יכולים להיות היוו לתוך 3D microtissues להזרקה לאחר במבחנה לקרקע של תאים ב- microcryogel כדי לשפר את שני חלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM) התצהיר, כמו גם תאים תאים אינטראקציות. Microtissues להזרקה 3D לגרום microscale רקמות כמו הרכבים המייצג אסטרטגיית אספקה אופטימלים כדי להקל על הגנה על תאים, engraftment, הישרדות, ומכאן לשפר את ההשפעות הטיפוליות האולטימטיבי באתר הנגע.

מלבד השפעות טיפוליות משופרת עבור טיפול בתאי, התוצאות שלנו היו גם מעידה על השפעת microenvironment 3D על סמים הסלולר תגובות מורכבות. ניצול תנאי התרבות biomimicking, שזה יהיה אפשרי להפיק במבחנה סמים הסלולר תגובות יותר ייצוגית ויוו תגובות, ומכאן האצת סמים גילוי6,7, 28. Spheroids הבחירה הפופולרית של תצורת תרבות תלת התא, פותחו טכניקות רבות כדי לסייע לחוקרים ליצור spheroids. תרביות רקמה נמוך-דבק צלחות29 צלחת משטחים או ששונו עם ננו-שמירות8 שימשו גם זוגתו תאים להפעיל עליה פונקציית צבירה על-ידי מניעת הידבקות תאים-מטריקס. טכניקות אלה אמנם פשוטה יחסית לשימוש, בעיות כגון אובדן spheroids במהלך חילופי בינוני ופעולות אחרות, כמו גם גודל השתנות של spheroids הן בעיות הפרעה בקנה מידה גדול אימוץ טכנולוגיה כזו6. Spheroids הומוגנית יכול להיווצר באמצעות תלוי ושחרר30,31,32,33, אולם זה עמל רב, אם לא באמצעות לוחיות הרישוי. באמצעות מתמחה רב טוב תלוי טיפה צלחות, ושילוב עם נוזל אוטומטיות טיפול מערכות6,31, תפוקה גבוהה ההקרנה יכול להתממש. החיסרון הגדול ביותר של תרבות ספרואיד הוא המחסור ECM, אשר זוהה לשחק תפקיד חיוני רקמות פיזיולוגיים ופתולוגיים כל ההתפתחויות34. מחקר מודל המוח עולה כי spheroids תרבותי בתוך לגרדום ECM, בהשוואה spheroids טהור, היה גדל עמידות לתרופות, משופרת חמצת עקב ייצור לקטאט גבוה יותר ומשופר אנגיוגנזה עם הגדלת ביטוי קשורים גורמים34. מחקרים אחרים הראו גם כי נוכחות של מטריקס יכולה לספק צורך איתות mechano כדי לקדם את החוק הביוגנטי החובשים ותומך של הגידול תכונות כגון פלישת גרורות3,35,36 , 37.

עם הגברת ההבנה של החשיבות של ECM בפיתוח פתולוגי, אין שום ספק כי שילוב ECM שיטות 3D יכול לסייע לחקות ויוו מצבים יותר טוב6. Hydrogels של חומרים טבעיים או סינתטיים הוחלו כדי להפיק מספר במבחנה הגידול תלת-ממד מודלים הערכה של chemotherapeutics בשל גמישותם, בקירות וצפיות של מאפייני biophysical (כגון קשיחות)38 , 39 , 40 , 41 , 42. בעוד hydrogels עם מאפיינים biophysical tunable אכן היה המודל תכונות ביולוגיות חשובות של תאים סרטניים כדי להקל על מדויק יותר והתרופות הקרנה, מספר חסרונות של שיטה זו יש הפריע השימוש הנרחב שלה גמילה מסמים ההקרנה. Crosslinking של פולימרים בנוכחות תאים יש צורך לתמצת תאים בתוך הידרוג מטריקס, אשר עלולים להזיק לתאים. לא רק אז, hydrogels של נכסים biophysical שונים מציגים אתגרים שונים אנקפסולציה בתוך התאים. ב- hydrogels רך, תכולת מים גבוהה תכולת יכול לתמוך צמיחת תאים אך כזה hydrogels לבזות במהירות, נותנת תמיכה לטווח קצר עבור תרבית תאים תלת-ממד. מצד שני, hydrogels נוקשה עם cross-linking גבוהה יכולה להאט את השפלה אבל התוכן מים נמוכה יכול תומך צמיחת תאים ומשרה ריכוז גבוה crosslinker בדרך כלל cytotoxicit גבוההy43,44. לא רק אז, הכנת תרבית תאים 3D עם hydrogels הוא מהגידולים ואינו תואם עם רוב הנוזל תפוקה גבוהה טיפול מערכות בקרת טמפרטורה של הידרוג קודמן פתרון חשוב, חסימה של טיפים שחולק דק יכול לגרום מ gelation של הידרוג בתוך הטיפים. חסרונות אלה עוררו ולכן החיפוש אחר חלופי ECM ממלאי מקום, קרי, מבוסס לגרדום ECM34.

באמצעות פיגומים הקבועים מראש, התאים יכולים לקבל פטור על תהליך ייצור מפות biomaterial, ומכאן מספקים את האפשרות עבור שליטה רבה יותר על ייצור לגרדום כמו תנאים חריפות יותר ניתן להשתמש ללא חשש של פגיעה בתאים. מספר חקירות הראו כי בתאי הגידול תרבותי ב- 3D פיגומים להציג תרופתיים גבוה יותר לעומת תאים תרבותי בדו מימד בשל ממאירות מוגברת תא משופרת-ECM אינטראקציה45,46, 47. תצפיות כאלה עקביים עם התוצאות שלנו המוצג כאן. ביצירות אחרות שלנו, אנחנו הראו עוד יותר צדדיות של המערך microtissue תלת-ממד והיתרונות על פני טכניקות אחרות שהוזכרו לעיל. בעבודתו שנערך, הצלחנו לשפר את תפקוד הכבד על ידי קידום של פנוטיפ אפיתל של תאים HepaRG על ידי culturing על מערך microtissue תלת-ממד, מערך כזה היה מוחל על סמים hepatotoxicity הערכה47. בשל אחידות נקבובית הגדלים בתוך פיגומים macroporous תלת-ממד, הצלחנו לשלוט על הגודל של תאים בכבד spheroids ליפול בתוך 50-80 מיקרומטר, ללא קשר צפיפות זורעות תא הראשונית. זה מספק יתרון משמעותי על פני חינם להיוות spheroids עם גדלים לא אחידה. לא רק לעשות spheroids לגדול בצורה אחידה בתוך כל לגרדום, תאים בין בארות בצורה אחידה גם הם נזרע, נותן מקדם של וריאציה (CV) דומה עם תאים זריעה בדו מימד (קרי, CV = 0.09 microtissue תלת-ממד מערך, CV = 0.05 בצלחת מסחרי 2D ; נתונים לא מוצג). בעבודה נוספת, הראו כי הצלחנו להקים microtumor הכבד על מערך microtissue תלת-ממד כדי לסכם אינטראקציות הגידול-סטרומה להקרנה מחדש משתית בטיפול קומבינטורית48. Microtumors כבד נוצרו על ידי תרבות משותפת לטווח הארוך (5 ימים) fibroblasts עם תאים סרטניים-צפיפות גבוהה. . הבחנו מחסומים כלפי סמים דיפוזיה עקב סלולרי קומפקטי ומבנה ECM שהוקמה ב microtumor הכבד, אשר באופן דומה נצפתה ויוו32... באמצעות תאים סרטניים התווית על-ידי לוציפראז מכנית-איפה זה מונח סטרומה תאים, בשילוב עם הפריה חוץ גופית של luciferin כמו read-out ספציפיים עבור תאים סרטניים, הקרנת הסרט הרומן סוכני טיפולית או שילובים נגד גידול-סטרומה תפוקה גבוהה האינטראקציה התאפשר.

למרות היתרונות הרבים ייחודי של הטכניקה שלנו, חיסרון של microcryogels הנוכחי הוא הלא-שקיפות, הפרעה מפורט אופטי התבוננות בתאים microcryogels. שיפורים נוספים עבור אלה microcryogels יכלול כוונון התכונות האופטיות שלהם כדי לשפר את ההדמיה של תאים ב- microcryogels להשגחה. בנוסף, חשוב מאפיינים biophysical, כגון קשיחות לא נחקרו בטכניקה שלנו, אשר היה צריך להתייחס אם נרצה לחקות טוב יותר רקמות פיזיולוגיים ופתולוגיים של מאפיינים שונים ביופיזיקלי.

בעוד הטכניקה שלנו מאפשר לדור פשוטה של microtissues תלת-ממד, ואזהרות כמה חייב להילקח עבור ניסויים מוצלחים. כאשר בדיית microcryogels 3D microstencil מערך השבב, חשוב להבטיח microcryogels יישארו קפואים כאשר איזה שהוא לופילייזר. לפיכך חיוני להתקרר מראש על איזה שהוא לופילייזר וכדי להעביר microcryogels מהמקפיא-20 ° C איזה שהוא לופילייזר במהירות. המסת microcryogels לפני lyophilizing או במהלך lyophilizing יגרום הנקבוביות לכווץ או להשפיע את נקבוביות microcryogels מפוברק. כאשר culturing microtissues 3D בתבנית המערך, תשומת לב דרוש על מנת להבטיח ש-adhesiveness בין המערכים מספיקה למניעת זיהום צולב בין בארות. בנוסף, בעוד miniaturizing תרבית תאים יש יתרונה בהגברת התפוקה הפחתת צריכת ריאגנט, החיסרון שלה הוא האחסון תרבות נמוכה יכול תומך תרבית תאים לטווח ארוך ללא חידוש מלאי מדיה בתדירות גבוהה. לא רק אז, זה קריטי לשמור על הלחות של הסביבה תרבות כדי למנוע השפעה על התא הכדאיות עקב התאדות מדיה, מאז רק כמה microliters של התא השעיה או הוספת מדיה. אידוי ישפיעו גם על הכדאיות של תאים הבארות היקפיים, ולכן הוא חיוני כדי למנוע culturing בתאים הבארות הללו.

בכל מקרה, הטכניקה החזקה שלנו מספקת אפשרות ליצירת 3D microtissues באופן קל לשימוש, אשר יכול באופן פוטנציאלי לעשות תרבות 3D שיטה נפוצה של מניפולציה תא עבור רוב מעבדות, כדי להאיץ את מדע בסיסי והן translational החידושים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מבחינה כלכלית נתמך על ידי קרן מדעי הטבע הלאומי של סין (מענקים: 81522022, 51461165302). המחברים רוצה להודות לכל חברי המעבדה Du לסיוע כללי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin sigma G7041 All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde  J&K 902042 Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24 x 50 mm) CITOGLASS, China 10212450C To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4 Beijing Chemical Works 116-8 To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar asperts, China VC8130 To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets  Sunjin Electronics Co., Ltd, China Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system Rayjet, Australia Rayjet 50 C30 To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner Mycro Technologies, USA PDC-32G To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer Boyikang, China SC21CL To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%) Zhongkekeao, China DA0065 To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride ENERGY CHEMICAL, China A01E0801360010 To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) CS01-10 To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue Promega (Wisconsin, USA). G8080 To test cell viability.
Cell strainer BD Biosciences, USA 352360 To collect microgels.
D-Luciferin SYNCHEM (Germany) s039 To tack cells.
Scanning electron microscope FEI, USA Quanta 200 To characterize microgel morphology.
 Mechanical testing machine Bose, USA 3230 To measure mechanical features.
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA ALADINI 1000 To test injactabiliy.
Digital force gauge HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China H-50  To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC AN74i To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader Molecular Devices,USA M5 To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope Nikon, Japan A1Rsi To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system Caliper Life Sciences, USA IVIS To track cell in animals.
Liquid work stataion Apricot design,USA S-pipette To load medium or cell suspension high-throuputly.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179 (2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141 (2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581 (2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056 (2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Tags

טיפול בתאי בביו-הנדסה גיליון 128 תפוקה גבוהה סמים הקרנת זריקות פולשנית microcryogels microtissue
Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Yan, X., Liu, W., Zhou, L.,… More

Li, Y., Yan, X., Liu, W., Zhou, L., You, Z., Du, Y. 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening. J. Vis. Exp. (128), e55982, doi:10.3791/55982 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter