3D Microtissues för injicerbara regenerativ terapi och hög genomströmning drogkontroll

Summary

Det här protokollet beskriver tillverkning av elastisk 3D får microcryogels genom att integrera mikrofabrikation med cryogelation teknik. Vid lastning med celler, genereras 3D microtissues, som kan vara lätt injiceras i vivo att underlätta regenerativ behandling eller sammansatt till matriser för in vitro- hög genomströmning drogkontroll.

Abstract

För att uppgradera traditionella 2D cellkultur till 3D cellkultur, har vi integrerat mikrofabrikation med cryogelation teknik för att producera avdunsta hur provtagningsutrustningen skall cryogels (microcryogels), som kan laddas med en mängd celltyper att bilda 3D microtissues. Häri, presenterar vi protokollet för att fabricera mångsidig 3D microtissues och deras tillämpningar i regenerativ terapi- och drogkontroll. Storlek och form-kontrollerbara microcryogels kan fabriceras på en array-krets, som kan skördas off-chip som enskilda cell-loaded bärare för injicerbara regenerativ behandling eller ytterligare vara monterade på chip till 3D microtissue arrayer för hög genomströmning drogkontroll. På grund av hög elastisk hur dessa hur provtagningsutrustningen skall cryogels uppvisar de 3D microtissues stor inmatningskapacitet för minimalinvasiv cellterapi genom att skydda celler från mekaniska tvärkraften under injektionen. Detta säkerställer förbättrad cellöverlevnad och terapeutisk effekt i musmodell lem ischemi. Samtidigt underlättar montering av 3D microtissue matriser i ett standardformat för 384-multi-bra användning av gemensamma laboratorier och utrustning, möjliggör hög genomströmning drug screening på denna mångsidiga 3D cell kultur plattform.

Introduction

Traditionella cellkultur på tillplattad tvådimensionell (2D) ytor, såsom en kultur maträtt eller plattor med flera, kan knappast framkalla cell beteenden nära deras infödda stater. Korrekt rekapitulation av infödda cellulära mikromiljö, som består av olika celltyper, extracellulära matriser och bioaktiva lösliga faktorer i tredimensionella (3D) arkitekturer^{1,2,3 ,4}, är nödvändigt att konstruera biomimicking vävnader i vitro för applikationer inom tissue engineering, regenerativ medicin, grundläggande biologi forskning och drug discovery^{5,6,7 ,8,9}.

I stället för 2D cellkultur, 3D cellkultur används ofta att avancera biomimetiska mikro-arkitektoniska och funktionella egenskaper hos celler odlade i vitro. En populär 3D cell kultur metod är att aggregera celler i spheroids^7,8,9,10. Cellulära spheroids kunde injiceras till skadade vävnader med ökad cellulär bevarande och överlevnad jämfört med injektion av spridda celler. Dock leda icke-enhetlig sfäroid storlekar och oundvikliga mekanisk skada ålagts celler av vätska tvärkraften under injektion till dålig cell terapeutiska effekter^11,12,13. Likaså, det inneboende icke-enhetlighet under aggregering av spheroids har gjort deras översättning till 3D cellbaserade hög genomströmning drug screening utmanande¹⁰.

En annan metod för 3D cellkultur uppnås med hjälp av biomaterial, som vanligtvis sammanfattar celler i vattenlösning hydrogels eller porösa ställningar. Det möjliggör större flexibilitet i att bygga 3D arkitekturer. För terapi levereras vanligtvis celler inkapslade i bulk ställningar till djur förkroppsligar via kirurgisk implantation, som är invasiva och traumatisk, därav begränsa dess brett översättning till säng. Å andra aktivera vattenhaltiga hydrogels minimalinvasiv terapi genom att injicera celler upphängd i hydrogel föregångare lösning i djurens kroppar, så att i situ gelation via thermo-, kemiska eller enzymatisk crosslinking¹¹. Dock som cellerna levereras samtidigt hydrogel prekursorer är fortfarande i en vattenlösning tillstånd, är de också utsatta för mekanisk skjuvning under injektionen. Inte bara det, kemiska eller enzymatisk crosslinking under i situ gelation av hydrogel skulle också innebära skador på celler inom. För drogkontroll möter biomaterial-assisted cellkulturer problem med jämnhet, manöverbarhet och genomströmning. Använda hydrogels, är celler vanligtvis inblandade under gelation, som processen kan påverka cellernas viabilitet och funktion. Gelation under cell sådd hämmar också användning av utrustning för de flesta hög genomströmning, eftersom hydrogel kan behöva hållas på is för att förhindra gelation innan cellen sådd, och hydrogel kan jam tubens tips, som är vanligtvis mycket tunna att säkerställa noggrannheten för High-throughput screening. Förformad ställningar kunde potentiellt separat biomaterial fabrication förfaranden från cellodling, men de flesta byggnadsställning-baserade produkter är tillgängliga som bulkmaterial med relativt lägre genomströmning¹⁴.

För att övervinna några av bristerna i nuvarande 3D kultur metoder, har vi utvecklat en mikrofabrikation-cryogelation integrerad teknik för att tillverka en off-the-shelf och användarvänlig microcryogel array chip¹⁵. I detta protokoll, är gelatin valt att exemplifiera microcryogel fabrication tekniken eftersom det är biokompatibla, nedbrytbara, kostnadseffektiva, och inga ytterligare ändringar krävs för cell fastsättning. Andra polymerer av naturliga eller syntetiska källor skulle också kunna användas för tillverkning, beroende på applikation. Via denna teknik kan vi tillverka miniatyriserade och mycket elastisk microcryogels med reglerbar storlek, form och layout. När den är lastad med en mängd olika celltyper, kunde 3D microtissues bildas för olika applikationer. Dessa unika funktioner aktivera önskad inmatningskapacitet, cellskydd och webbplats-regisserad lagring efter injektion i vivo för förbättrade terapeutiska effekter. Inte bara det, microcryogels kunde behandlas ytterligare för att bilda 3D microtissue matriser som är kompatibla med vanliga laboratorieutrustning och instrument för att förverkliga hög genomströmning cellodling för mångsidig drogkontroll och andra cellulära analyser. Häri, skall vi detalj tillverkningsprocessen av microcryogels och dess efterbehandling som enskilda 3D microtissues eller 3D microtissue vektorer för två viktiga program, cellterapi och drogkontroll, respektive^10,15 .

Protocol

djurförsök följde strikta protokoll godkänts av djur etikkommittén på Center för biomedicinsk analys, Tsinghua University. Under godkännande av etisk kommitté, mänsklig fettvävnad erhölls från Institutionen för plastikkirurgi i Peking Union Hospital med informerat samtycke från patienterna. 1. tillverkning av 3D Microcryogels konstruktion och tillverkning av microstencil array marker använda en kommersiell programvara till design matriser av…

Representative Results

Tillverkning och karakterisering av microcryogels för 3D microtissue bildas. Enligt detta protokoll, microcryogels var fabricerade form 3D microtissues och enskilda microcryogels eller microcryogel matriser och tillämpades på regenerativ behandling och drug screening, respektive (figur 1). Microstencil array chips tillverkade av PMMA tillämpades som micromolds för microcryogel …

Discussion

Regenerativ medicin och in vitro- modeller för drogkontroll är två viktiga användningsområden för tissue engineering^5,6,7,8,9. Medan dessa två program har väldigt olika behov, ligger ett ostridigt mellan dem i behovet av en mer biomimetiska odlingsskålar villkoret att förbättra cell funktioner¹⁹. Endast med förbätt…

Materials

Gelatin	sigma	G7041	All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde	J&K	902042	Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm)	CITOGLASS, China	10212450C	To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar	asperts, China	VC8130	To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets	Sunjin Electronics Co., Ltd, China		Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system	Rayjet, Australia	Rayjet 50 C30	To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner	Mycro Technologies, USA	PDC-32G	To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer	Boyikang, China	SC21CL	To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%)	Zhongkekeao, China	DA0065	To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)	CS01-10	To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue	Promega (Wisconsin, USA).	G8080	To test cell viability.
Cell strainer	BD Biosciences, USA	352360	To collect microgels.
D-Luciferin	SYNCHEM (Germany)	s039	To tack cells.
Scanning electron microscope	FEI, USA	Quanta 200	To characterize microgel morphology.
Mechanical testing machine	Bose, USA	3230	To measure mechanical features.
Programmable syringe pump	World Precision Instruments, USA	ALADINI 1000	To test injactabiliy.
Digital force gauge	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China	H-50	To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader	Molecular Devices,USA	M5	To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope	Nikon, Japan	A1Rsi	To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system	Caliper Life Sciences, USA	IVIS	To track cell in animals.
Liquid work stataion	Apricot design,USA	S-pipette	To load medium or cell suspension high-throuputly.