Summary
Det här protokollet beskriver tillverkning av elastisk 3D får microcryogels genom att integrera mikrofabrikation med cryogelation teknik. Vid lastning med celler, genereras 3D microtissues, som kan vara lätt injiceras i vivo att underlätta regenerativ behandling eller sammansatt till matriser för in vitro- hög genomströmning drogkontroll.
Abstract
För att uppgradera traditionella 2D cellkultur till 3D cellkultur, har vi integrerat mikrofabrikation med cryogelation teknik för att producera avdunsta hur provtagningsutrustningen skall cryogels (microcryogels), som kan laddas med en mängd celltyper att bilda 3D microtissues. Häri, presenterar vi protokollet för att fabricera mångsidig 3D microtissues och deras tillämpningar i regenerativ terapi- och drogkontroll. Storlek och form-kontrollerbara microcryogels kan fabriceras på en array-krets, som kan skördas off-chip som enskilda cell-loaded bärare för injicerbara regenerativ behandling eller ytterligare vara monterade på chip till 3D microtissue arrayer för hög genomströmning drogkontroll. På grund av hög elastisk hur dessa hur provtagningsutrustningen skall cryogels uppvisar de 3D microtissues stor inmatningskapacitet för minimalinvasiv cellterapi genom att skydda celler från mekaniska tvärkraften under injektionen. Detta säkerställer förbättrad cellöverlevnad och terapeutisk effekt i musmodell lem ischemi. Samtidigt underlättar montering av 3D microtissue matriser i ett standardformat för 384-multi-bra användning av gemensamma laboratorier och utrustning, möjliggör hög genomströmning drug screening på denna mångsidiga 3D cell kultur plattform.
Introduction
Traditionella cellkultur på tillplattad tvådimensionell (2D) ytor, såsom en kultur maträtt eller plattor med flera, kan knappast framkalla cell beteenden nära deras infödda stater. Korrekt rekapitulation av infödda cellulära mikromiljö, som består av olika celltyper, extracellulära matriser och bioaktiva lösliga faktorer i tredimensionella (3D) arkitekturer1,2,3 ,4, är nödvändigt att konstruera biomimicking vävnader i vitro för applikationer inom tissue engineering, regenerativ medicin, grundläggande biologi forskning och drug discovery5,6,7 ,8,9.
I stället för 2D cellkultur, 3D cellkultur används ofta att avancera biomimetiska mikro-arkitektoniska och funktionella egenskaper hos celler odlade i vitro. En populär 3D cell kultur metod är att aggregera celler i spheroids7,8,9,10. Cellulära spheroids kunde injiceras till skadade vävnader med ökad cellulär bevarande och överlevnad jämfört med injektion av spridda celler. Dock leda icke-enhetlig sfäroid storlekar och oundvikliga mekanisk skada ålagts celler av vätska tvärkraften under injektion till dålig cell terapeutiska effekter11,12,13. Likaså, det inneboende icke-enhetlighet under aggregering av spheroids har gjort deras översättning till 3D cellbaserade hög genomströmning drug screening utmanande10.
En annan metod för 3D cellkultur uppnås med hjälp av biomaterial, som vanligtvis sammanfattar celler i vattenlösning hydrogels eller porösa ställningar. Det möjliggör större flexibilitet i att bygga 3D arkitekturer. För terapi levereras vanligtvis celler inkapslade i bulk ställningar till djur förkroppsligar via kirurgisk implantation, som är invasiva och traumatisk, därav begränsa dess brett översättning till säng. Å andra aktivera vattenhaltiga hydrogels minimalinvasiv terapi genom att injicera celler upphängd i hydrogel föregångare lösning i djurens kroppar, så att i situ gelation via thermo-, kemiska eller enzymatisk crosslinking11. Dock som cellerna levereras samtidigt hydrogel prekursorer är fortfarande i en vattenlösning tillstånd, är de också utsatta för mekanisk skjuvning under injektionen. Inte bara det, kemiska eller enzymatisk crosslinking under i situ gelation av hydrogel skulle också innebära skador på celler inom. För drogkontroll möter biomaterial-assisted cellkulturer problem med jämnhet, manöverbarhet och genomströmning. Använda hydrogels, är celler vanligtvis inblandade under gelation, som processen kan påverka cellernas viabilitet och funktion. Gelation under cell sådd hämmar också användning av utrustning för de flesta hög genomströmning, eftersom hydrogel kan behöva hållas på is för att förhindra gelation innan cellen sådd, och hydrogel kan jam tubens tips, som är vanligtvis mycket tunna att säkerställa noggrannheten för High-throughput screening. Förformad ställningar kunde potentiellt separat biomaterial fabrication förfaranden från cellodling, men de flesta byggnadsställning-baserade produkter är tillgängliga som bulkmaterial med relativt lägre genomströmning14.
För att övervinna några av bristerna i nuvarande 3D kultur metoder, har vi utvecklat en mikrofabrikation-cryogelation integrerad teknik för att tillverka en off-the-shelf och användarvänlig microcryogel array chip15. I detta protokoll, är gelatin valt att exemplifiera microcryogel fabrication tekniken eftersom det är biokompatibla, nedbrytbara, kostnadseffektiva, och inga ytterligare ändringar krävs för cell fastsättning. Andra polymerer av naturliga eller syntetiska källor skulle också kunna användas för tillverkning, beroende på applikation. Via denna teknik kan vi tillverka miniatyriserade och mycket elastisk microcryogels med reglerbar storlek, form och layout. När den är lastad med en mängd olika celltyper, kunde 3D microtissues bildas för olika applikationer. Dessa unika funktioner aktivera önskad inmatningskapacitet, cellskydd och webbplats-regisserad lagring efter injektion i vivo för förbättrade terapeutiska effekter. Inte bara det, microcryogels kunde behandlas ytterligare för att bilda 3D microtissue matriser som är kompatibla med vanliga laboratorieutrustning och instrument för att förverkliga hög genomströmning cellodling för mångsidig drogkontroll och andra cellulära analyser. Häri, skall vi detalj tillverkningsprocessen av microcryogels och dess efterbehandling som enskilda 3D microtissues eller 3D microtissue vektorer för två viktiga program, cellterapi och drogkontroll, respektive10,15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
djurförsök följde strikta protokoll godkänts av djur etikkommittén på Center för biomedicinsk analys, Tsinghua University. Under godkännande av etisk kommitté, mänsklig fettvävnad erhölls från Institutionen för plastikkirurgi i Peking Union Hospital med informerat samtycke från patienterna.
1. tillverkning av 3D Microcryogels
- konstruktion och tillverkning av microstencil array marker
- använda en kommersiell programvara till design matriser av specifika geometrier, såsom cirklar, ellipser, trianglar eller klöver 14, beroende på efterföljande ansökan.
Obs: Se avsnitt 2 för protokollet för regenerativ medicin och avsnitt 3 i protokollet för drogkontroll för designdetaljer. - Importera designen till den programvara som medföljer den laser gravyr maskinen för lasergravering. Med hjälp av laser inställningarna enligt fabriken rekommendationer för laser gravyr maskin, laser-gravera den importerade designen på Poly (methymethacrylate) (PMMA) ark.
- Tvätta microstencil array marker med avjoniserat vatten för att rengöra skräp från lasergravyr. Torr microstencil matrisen chips vid 60 ° C. förvaras i en försluten påse i rumstemperatur i månader.
- använda en kommersiell programvara till design matriser av specifika geometrier, såsom cirklar, ellipser, trianglar eller klöver 14, beroende på efterföljande ansökan.
- Tillverkning av microcryogel array marker
- Place 4 microstencil array chips på prov facket och sätt in i plasma renare. Stäng dörren till renare och slå på vakuumpumpen i 2 min, sedan slå på den högsta RF-effekten (18 W) för att behandla microstencil array marker i plasma renare för 3 min i rumstemperatur att öka hydrophilicitet.
- Lägg till 0,06 g gelatin till 1 mL avjoniserat vatten och bildar 6% (wt/vol) gelatin föregångare lösning (tillräckligt för att göra 5 marker). Varm vid 60 ° C i ett vattenbad att upplösa tillräckligt. Inkubera på is för 5 min.
- Add 3 µL av glutaraldehyd i gelatin föregångare lösning till en slutlig koncentration på 0,3%. Blanda omsorgsfullt.
- Pipett 200 µL föregångare lösning med glutaraldehyd på den övre ytan av microstencil array chip.
Obs: 200 µL räcker för en 75 mm × 25 mm chip oavsett design. Öka beloppet proportionellt när ytan av chip ökas. - Manuellt distribuera lösningen jämnt över chip genom skrapning tillbaka och tillbaka med en böjd glasstav 2 till 3 gånger.
Obs: Varje mikro-brunn på microstencil chip kan fyllas med föregångaren lösning på grund av sin hydrofila karaktär efter plasmabehandling. - Placera omedelbart föregångare-lösning-fylld matris chip i frys-20 ° C i 16 h för cryogelation.
- Justera lyophilizer till-40 ° C i 30 min. placera matris marker efter cryogelation i lyophilizer och lyophilize array marker för 2 h i vakuum.
Obs: Gelatin microcryogels med sammankopplade macropores bildas eftersom isen bildas under cryogelation sublimes i lyophilizer. - Gå vidare till avsnitt 2 för behandling av kritiska lem ischemi (CLI) och avsnitt 3 för hög genomströmning drogkontroll.
2. Skörd enskilda Microcryogels till injicerbara Form 3D Microtissues för behandling av CLI
- skörd enskilda microcryogels
- Design-kedjor (75 mm × 25 mm) av 600 cirklar, med 400 µm i diameter, i kommersiell programvara för injicerbara 3D microtissue konstruktion. Använda PMMA 300 µm tjocklek för tillverkning av microstencil array chip som beskrivs i avsnitt 1.1.
- Fabricera microcryogel array marker som i avsnitt 1.2.
- Fabricera en PDMS ejektor Pin-matris med samma design som i steg 2.1.1 av standard mjuk litografi 16 , 17.
- Overlay microcryogel array chip ovanpå PDMS ejektor Pin arrayen, justera varje microcryogel med en ejektor pin på matrisen. Tryck på microcryogel array chipet mot arrayen ejektor pin att driva microcryogels av mikrobrunnarna med utskjutande stiften på PDMS ejektor pin matrisen att skörda individuella microcryogels.
- Skörd i microcryogel i vattnet och samla dem med hjälp av cell silar. Använd en sil för att samla in microcryogels från ett chip (dvs, 600 microcryogels).
- Tvätta microcryogels med 0,1 M NaBH 4 på is för 20 min att släcka alla uncross-länkade aldehyd rester. Använd 5 mL av 0,1 M NaBH 4 per chip. Ignorera NaBH 4 och tvätta med 5 mL avjoniserat vatten för 3 till 5 gånger, 15 min varje gång.
- Kasta vatten från cell silen och samla in microcryogels i ett kluster per cell sil och placera ett kluster i en 35 mm petriskål med en böjd pincett. Lägga till 50-70 µL avjoniserat vatten till varje kluster och täck locket på petriskål. Knacka försiktigt på petriskål på JoiceBoxen jämna ut alla microcryogels, så att ingen microcryogels blir liggande ovanpå en annan microcryogel att bilda en enskiktslager av microcryogels på ytan av petriskål.
- Frysa den skördade microcryogels vid-20 ° C för 4 till 16 h före frystorkning dem för 2 h (se steg 1.2.7). Förvara microcryogels i ett vakuum i rumstemperatur tills vidare användning.
- Karakterisering av microcryogels
- utvärdera porerna i microcryogels genom scanning electron microscopy (SEM) imaging.
- Orörlig den skördade och frystorkade microcryogels på en provhållare med dubbelsidig tejp och kappa med guld med ett fräsande bestrykare för 90 s, innan imaging av SEM 11. Utvärdera och analysera fördelningen av diametrar av porer i microcryogel från sju olika SEM-bilder med bild analys programvara.
- Väger ett kluster av 600 frystorkade microcryogels i en 35 mm petriskål för vikten av torkad gelatin microcryogels (GMs). Lägga till 60 µL avjoniserat vatten i klustret av frystorkade microcryogels och vänta 30 s för microcryogels till fullo absorberar vatten och sväller. Väg den svullna microcryogels.
- Bestämma equilibriumen svullnad baserat och porositet av microcryogels, som förhållandet mellan vikten av svullna microcryogels som torkad gelatin microcryogels och förhållandet mellan vikt hålls vatten i microcryogels som hydratiserade microcryogels, respektive 13.
- Åtgärd inmatningskapacitet för microcryogels med hjälp av en programmerbar sprutpumpen integrerat med en digital kraft spårvidd 14.
- Stain 600 bitar av microcryogels av Trypan blå och suspendera i 600 µL 15% gelatin lösningen att uppnå homogen fördelning. Ladda 1 mL microcryogel suspension i 1 mL spruta. Injicera blandningen genom en 27-gauge injektionsnål till 1 mL sprutan använder en programmerbar sprutpumpen med flödeshastighet av 1 mL/min.
- Monitor realtid injektion kraft vid digital styrka spårvidd testning och rita kraft-tidskurvan. Efter injektionen, respektera integriteten av microcryogels under ett mikroskop.
Obs: GMs upphängd i 15% (wt/vol) gelatin lösningen kan smidigt injiceras och förblev intakt efter injektion.
- Kännetecknar nedbrytningen av microcryogels.
- Först mäta vikten av ett kluster av 600 frystorkade microcryogels i en 35 mm petriskål som torr vikt. Sedan fördjupa 600 frystorkade microcryogels i 2 mL 0,025% (vol/vol) Trypsin/EDTA.
- Samla microcryogels från lösningen med en cell-SIL vid olika tidpunkter (dvs. 10, 20, 30, 40, 50, 60 och 70 min). Wick bort överflödig lösning med en vävnad. Mäta vikten på microcryogels vid olika tidpunkter och beräkna nedbrytning graden, som förhållandet mellan vikten av microcryogel vid en viss tidpunkt som microcryogel på tiden noll.
- utvärdera porerna i microcryogels genom scanning electron microscopy (SEM) imaging.
- Autoloading av celler i microcryogels till formuläret 3D microtissues
- sterilisera microcryogels från steg 2.1.8 av eten oxid steriliseringssystem med 12 h gas exponering följt av 12 h avgasning enligt vacKuum.
- Välja mänskliga adipose-derived mesenkymala stromaceller (hMSCs) för behandling av mus ischemisk bakbenet. Isolera cellerna genom att följa procedurer som tidigare rapporterats 18.
- Kultur hMSCs i tillväxten medium innehållande 2% fetalt bovint serum (FBS), 10 ng/mL epidermal tillväxtfaktor (EGF), 10 ng/mL trombocyt-härrör tillväxtfaktor bb (PDGF-bb), 1 X insulin transferrin selen (ITS), 10 -8 M dexametason, 10 -4 M askorbinsyra 2-fosfat, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin i DMEM/F12. Passagen cellerna i förhållandet 1:3 när konfluenta. Använda celler av passagen 3 till 5 i följande experimenten.
- Skörda hMSCs med trypsin och kvantifiera antalet cell använder en Fuchs-Rosenthal räknande kammare och resuspendera till en densitet på 8 x 10 6 celler/mL i hMSCs odlingsmedium.
- Pipett 60 µL hMSCs fjädring på enskiktslager av 600 microcryogels med diameter på 400 µm i en 35 mm maträtt från avsnitt 2.1. Celler automatiskt absorberas i porösa mikro-strukturer i microcryogels.
- Underhåll i en fuktig kammare och inkubera vid 37 ° C i 2 h att tillåta celler att fästa. Efter 2 h inkubation, tillsätt 2 mL odlingsmedium. Ändra mediet varannan dag. Kultur hMSCs-laddat microcryogels för 2 dagar att bilda 3D microtissues.
- Efter 2 dagar odling, Pipettera 100 hMSCs-loaded microcryogels per brunn på en plattan med 96 brunnar, tillsätt 120 µL av resazurin fungerande lösning beredd enligt tillverkaren ' s instruktion i varje brunn. Inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
- Identifiera fluorescens av resazurin metaboliseras av viabla celler i en microplate reader med en magnetisering ljus våglängd av 560 nm och utsläpp ljus våglängd av 590 nm. Upprätta en standardkurva i cell nummer vs. fluorescens med hMSCs för att interpolera mobilnummer från fluorescensintensiteten för framtida experiment enligt kit protokoll 13.
- Bedöma antalet hMSCs i microcryogels från dag 0 till dag 4 med resazurin som beskrivs i steg 2.3.7 från dag 0 till dag 4.
- Färga cellerna i microcryogels med 1: 500 utspädning av Calcein AM och 1: 250 utspädning av Propidium jodid (känd som live/dead färgning) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och observera under fluorescens Mikroskop eller confocal fluorescens Mikroskop.
- Injektion av 3D microtissues i vivo för behandling av CLI i musmodell
- fastställa kritiska bakbenet ischemi av kvinnliga BALB/c naken möss som rapporterade 11 , 19 att avgöra den terapeutiska effekten av 3D microtissue-baserad terapi.
- Överför microtissues från steg 2.3.6 med 5 mL pipett i en cell sil och filtrera bort odlingssubstratet.
- Återsuspendera den hMSCs-loaded 3D microtissues i 15% gelatin lösningen, till en densitet på 100 microcryogels per 100 µL lösning.
- Före operation, sterilisera kirurgiska verktyg av autoklav och operera i ett djurs operationssalen i ett djur anläggning centrum.
- Placera musen in i kammaren för induktion av anestesi som innehåller 1-3% isofluran i 100% syre vid ett flöde på 1 L/min. Använd erytromycin på ögonen på musen för att förhindra uttorkning. Genom en 1 cm lång huden snitt, ligera femoralartären och dess grenar med 5-10 silk suturer och punktskatt 19.
- Injicera indocyaningrönt (ICG) (0,1 mL av 100 µg/mL) genom svansen ven injektion att övervaka blodflödet. Utföra ICG fluorescens bildåtergivning med en fluorescens imaging system (här, Hemmagjord system) i reflektans geometri 11.
- Intramuskulärt injicera tre platser av gracilis muskeln runt artär snittet med en 1 mL spruta med en 23-gauge nål microtissues.
- Efter operation, håll musen varm med en uppvärmd pad i återhämtning buren. Injicera subkutant meloxikam för att lindra smärtan och övervaka kontinuerligt tills vaken.
- Efter 28 dagar, övervaka den terapeutiska effekten av 3D microtissue-behandlade lem genom fluorescens imaging 11.
Obs: Injicera subkutant meloxikam för att lindra smärtan när musen visade spontana lem amputation. - Euthanize möss med koldioxid efter avslutad experiment.
Obs: Här, dödshjälp med koldioxid utfördes enligt strikta protokoll godkänts av djur etikkommittén på Center för biomedicinsk analys, Tsinghua University.
3. Montering av Microtissue Array Chip för High-throughput Drug Screening
- montering av microcryogel matris för på-chip cellkultur
- ändra designen i avsnitt 1.1 enligt konventionella flera platta dimensioner, dvs, för 384-multi-bra format, utforma en rad 16 × 24 brunnar (raden av kolumnen), var och en av 2 mm diameter och 4,5 mm center till mitten avståndet.
- Laser gravera på 500 µm tjock PMMA ark som beskrivs i avsnitt 1.1.
- Fabricate microcryogels som beskrivs i avsnitt 1.2 använda 384-multi-väl array chip erhållits från steg 3.1.2. Denna microcryogel-innehållande matris betecknas som microcryogel array chip.
- Tvätta microcryogel array chip med 50 mL 0,1 M NaBH 4 uncross-kopplad släcka eventuella kvarvarande aldehyd, upprepade gånger och skölj sedan med 50 mL avjoniserat vatten för 3 gånger, 2 h varje gång.
- Släng vattnet, frysa microcryogel array chip vid-20 ° C för 4 till 16 h före frystorkning enligt steg 1.2.7.
- Ändra 384-multi-brunnen array design i steg 3.1.1 att innehålla 16 × 24 brunnar, var och en av 3 mm diameter och 4,5 mm center till mitten avståndet.
- Ta bort ena sidan av stöd från ett ark med Ultra-tunn (10 µm) biokompatibla dubbelhäftande tejp och klistra in den på ena sidan av en bit av 3 mm tjock PMMA ark. Laser gravera designen från steg 3.1.4 på denna 3 mm tjock PMMA ark enligt avsnitt 1.1. Denna matris betecknas som reservoar matrisen.
- Justera arrayen microcryogel chip med reservoar array chip och följa ihop tätt att montera 3D microcryogel array chip för på-chip cellodling. Sterilisera genom ultraviolett strålning för 1 h.
- Store 3D microcryogel array marker i vakuum vid rumstemperatur för ytterligare experiment.
- Drug screening på 3D microtissue matriser
- fylla upp en våt box med 25 mL sterilt avjoniserat vatten att fungera som en fuktkammare för cellodling. Förvärmning i en fuktad 5% CO 2 inkubator till 37 ° C.
- Skörd icke-småcellig lungcancerceller (NCI-H460) och hepatocellulära carcinom celler (HepG2) från vävnadsodling plattorna enligt standardprotokoll och resuspendera i kultur media till slutliga densitet av 1,0 x 10 6 celler/mL. Blanda omsorgsfullt.
Obs: RPM1640 med 10% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin används för NCI-H460. Använda DMEM med 10% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin för HepG2. - Ta bort fuktighet kammaren från inkubator. Använd pincett till noga plats monterade 3D microcryogel array chip från steg 3.1.9 i luftfuktighet kammaren. Ta försiktighet inte att blöta microcryogels med vatten i kammaren.
- Blanda cellsuspensionen grundligt, sedan alikvotens 3 µL cellsuspension direkt på microcryogel i varje brunn.
Obs: Pipettspetsen bör nudda ytan av microcryogel innan utvisa cellsuspension. Celler är auto-laddade i microcryogel genom absorption. Inte utsäde celler i perifera brunnarna. - Tillsätt 10 μL av media till varje brunn efter celler är seedade in microcryogel med hjälp av flerkanalig pipett, såsom en 96-kanal flytande hanterare. Medlet läggs också till perifera brunnarna.
Obs: Använd RPM1640 media med 10% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin för H460 celler. Användas HepaG2 celler DMEM media med 10% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin. - Kultur arrayen cell-loaded microcryogel chip i luftfuktighet kammaren för 24 h i en fuktad 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C till formuläret 3D microtissue array.
- Lös doxorubicin och IMMLG-8439 9 i dimetyl sulfoxid (DMSO) att bilda en stamlösning av 10 mM. Späd droger med odlingsmedium att bilda en 10-faldig utspädning koncentrationsgradient från 2 nM till 200 µM.
- Lägg till 10 µL av drogen lösningar till varje brunn. Använd 0,1% DMSO (utspädd i medium) som kontroll. Inkubera drog laddade 3D microtissue matrisen i en fuktad 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C för 24 h.
- Lägga till 4 µL av resazurin stamlösning till varje brunn. Inkubera vid 37 ° C under 2 h. plats 3D microtissue array i microplate reader och upptäcka fluorescens av resazurin metaboliseras av viabla celler vid en magnetisering ljus våglängd av 560 nm och utsläpp ljus våglängd av 590 nm.
- Subtrahera resazurin baslinjen signalen från alla brunnar innan ytterligare databehandling. Beräkna den cell livskraft fraktionen av varje brunn genom att dividera sin fluorescens signal av genomsnittliga fluorescens signalen av kontrollbrunnarna.
- Rita dos-respons kurva plotting programvara med det cell livskraft bråket som y-axeln och bas 10 logaritmen av drogen koncentration som x-axeln. Interpolera 50% hämning koncentrationen (IC50) till den cell livskraft bråkdel av 0,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillverkning och karakterisering av microcryogels för 3D microtissue bildas.
Enligt detta protokoll, microcryogels var fabricerade form 3D microtissues och enskilda microcryogels eller microcryogel matriser och tillämpades på regenerativ behandling och drug screening, respektive (figur 1). Microstencil array chips tillverkade av PMMA tillämpades som micromolds för microcryogel array marker. Variabel geometriska mönster skulle kunna förberedas för microstencil array chip. Vi valde en representativ 45 x 14 mm microstencil array chip som ett exempel, som innehöll olika former (dvs, cirkel, ellips, triangel och klöver) och en cirkelformad microstencil array chip med olika storlekar (diametrar = 100, 200, 400 och 800 µ (m). för att öka synligheten för micromolds på chips som matris, epi-tändning av ljusen bilder observerades (figur 2A, B). Microcryogels skördas från array marker ställde ut önskade former och storlekar (figur 2 c, D). Sådana microcryogels med önskad geometriska funktioner skulle eventuellt kunna tillämpas som mallar för att bilda olika cellulära enheter som efterliknar vissa arkitekturer av infödda vävnader. Skördade GMs (gelatin microcryogels) hade fördefinierade former och storlekar (figur 3A). SEM observation visade att microcryogels innehöll sammankopplade avdunsta strukturer med en porstorlek i intervallet 30-80 µm (figur 3B).
Förbättrad inmatningskapacitet för hMSCs-laddat microtissues för förbättrad ischemisk lem bärgning
Med programmerbara sprutpumpen integrerat med en digital kraft gauge14, inmatningskapacitet av GMs utvärderades kvantitativt. Med en flödeshastighet av 1 mL/min injicerades GMs med en densitet av 1 000 microcryogels per mL under 6 N, vilket var lägre än den kliniskt godtagbar kraften 10 N20 (figur 3F). Basera på cellskydd aktiverat av GMs, hMSCs i GMs hade hög lönsamhet och underhålls bra proliferativ kapacitet efter injektion under 5 dagar av kultur (figur 3 H).
Lem ischemi musmodell valdes för att bedöma den terapeutiska effekten av de injicerbara hMSC-loaded microtissues. Fysiologisk status av ischemisk lemmar undersöktes 28 dagar efter operation (figur 4A). Ingen lem bärgning observerades i sham gruppen eller GMs kontrollgrupp. I behandlingsgruppen 105 gratis cell observerades 50% totalt tå amputation, 25% delvis tå amputation och 25% delvis lem amputation inom 7 dagar, vilket resulterar i 80% lem förlust och 20% totalt tå amputation efter 28 dagar. Däremot microtissues behandling med 105 hMSCs uppnådde förbättrad lem bärgning (75%) med bara 25% möss visade spontana tå amputation efter 28 dagar. 106 hMSCs, den minsta effektiva cell nummer som används i de flesta tidigare studier, var valt som den positiva kontroll21. Bara 2 av de 4 möss visade lem bärgning, men alla hade mindre nekros.
Blodgenomströmning var övervakas och bedömas i hjälp av indocyaningrönt (ICG), en FDA godkänt angiografiska kontrastmedel. Resultatet visade att fluorescens signaler medverkade i microtissue-behandlade möss och 106 gratis hMSCs-behandlade möss. Det finns ingen uppenbar fluorescens signal i ischemisk bakbenen i sham eller GM-gruppen tills dag 28 (figur 4B).
Dessa resultat bekräftat att 3D microtissue-assisted hMSCs terapi uppnås överlägsen terapeutiska effekter för CLI behandling som representerar den minsta effektiva dosen för cell-baserad terapi i musmodell hittills.
Hög genomströmning drogkontroll cytotoxicitet på 3D microtissue array chip
En ready-to-use 3D microcryogel matris för på-chip cellkultur kunde fabriceras enkelt genom att behålla microcryogels på PMMA chip efter frystorka den och kombinera med motsvarande brunn-array chip med biokompatibel tejp (figur 1 och figur 5A). I detta två delar cell kultur utbud, övre brunn-array chip tjänade som reservoarer för odlingsmedium, drog lösningar och analysreagenser, medan cellerna odlades i den 3D microcryogel orörlig på botten array chip. Självhäftande band mellan den övre och nedre array chipet gjort generation av 384 enskilda brunnar för hög genomströmning 3D cellkultur (figur 5B), som därmed ger ett praktiskt verktyg för läkemedelsutveckling.
Som beskrivs i protokollet, bildades 3D microtissue array av direkt sådd celler in i microcryogels innan du lägger till medium behållarna. Använda RFP-märkt NIH-3T3-celler, visat vi att cellerna var jämnt fördelade med flera lager inom 3D arkitekturen av microcryogels (figur 5 c, D). SEM-bilder visade att celler följs ordentligt till väggarna i porerna och ställde även ut utökade filopodia längs eller tvärs över intilliggande väggar av macropores i microcryogels (figur 5E).
Sedan visade vi möjligheterna att tillämpa denna 3D microtissue matris för hög genomströmning drogtester använder två cancer cellinjer och två föreningar. Hepatocellulära carcinom celler (HepG2) behandlades med Doxorubicin medan icke-småcellig lungcancerceller (NCI-H460) behandlades med IMMLG-8439, en ny tumör-hämmare. Fem till nio diskreta koncentrationer av varje läkemedel administrerades till sex intilliggande brunnar som replikat, med 0,1% DMSO i odlingsmedium som negativ kontroll. En cytotoxicitet analys utfördes på samma sätt för celler odlade i traditionella 2D plattor med flera. Efter 24 h inkubation användes cell lönsamhet analysen för att bedöma drog Svaren av celler i både 2D och 3D. Läkemedel-responskurvorna var ritade med normaliserade cell livskraft kurser vid olika läkemedelskoncentrationen och IC50 var sedan interpolerade från dessa kurvor. Ett högre IC50 värde tyder på att cellerna är mer resistenta. Från figur 5F och 5Iobserverat vi en betydande ökning i läkemedelsresistens när celler odlades på 3D microtissue array än i 2D. IC50 för Doxorubicin mot HepG2 celler nådde 165.959 µM, i förhållande till 18.239 nM på 2D; den IC50 för IMMLG-8439 på NCI-H460 celler upphöjdes likaså till 331.894 nM i 3D samtidigt som endast kräver 1.294 nM på 2D. Sådan observation var i överensstämmelse med rapporter om ökad resistens i 3D kultur över 2D kultur av andra forskare22,23.
Vi tillskrivas sådan ökning i läkemedelsresistens komplexiteten i den 3D mikromiljö jämfört med denplanar konfiguration av 2D kultur. SEM-bilder avslöjade att HepG2 celler samlat som spheroids dekorera ytbehandlar av macropores i microcryogel. Dessa celler är tätt grupperade och sådan ökad cell-cell interaktioner kan vara en källa av läkemedelsresistens i HepG222. Det var också intressant att notera att dessa cell kluster inte var fritt svävande spheroids som de ändå behållit vissa vidhäftning till matrisen (figur 5 g, H). Däremot var epitelial-mesenkymala-transition (EMT) spekulerade att ha inträffat när icke-small lungcancerceller, NCI-H460, odlades på 3D microcryogels. NCJ-H460 celler utspridda som fibroblaster (siffra 5J, K) i stället för klustring som HepG2. Därav, spekulerade vi att ökningen av resistens kan vara ett resultat från en övergång av NCI-H460 epitelceller till en mer maligna tillstånd18,19,20,21,22 ,23.
Figur 1 : Schematisk av 3D Microtissue tillverkning och tillämpning i regenerativ terapi- och drogkontroll. Kort, storlek och form-kontrollerbara microcryogel chip var tillverkade på en array PMMA-krets av cryogelation av gelatin. Microcryogel marker kan vara skördade off-chip som enskilda microcryogels och ytterligare, enskilda microcryogels kan vara auto-laddad med celler och odlade att bilda 3D microtissues för injicerbara regenerativ behandling. En annan tillämpning av microcryogel chips är att montera med en reservoar array chip och sedan vidare, läsa in celler och kultur i 3D microtissue arrayer för hög genomströmning drogkontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:Microstencil Array Chips. (A, B) Fotografier av två PMMA microstencil marker som innehåller klädd mikrobrunnar med olika former (dvs, cirkel, ellips, triangel och klöver) och cirkulära form med olika storlekar (diameter: 100, 200, 400 och 800 µm) respektive (A), och två motsvarande microcryogel array chips (B). (C, D) Mikroskopiska bilder av de enskilda microcryogels som skördas från två microcryogels array marker. Skalstapeln = 500 µm. Denna siffra har ändrats med tillstånd från referens14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Karakterisering av 3D injicerbara Microtissues. (A) fotografier av skördade microcryogels. (B) Scanning electron Mikrograf (SEM) bilder av microcryogels visar sammankopplade och avdunsta strukturer. (C, D) Fluorescens mikroskopiska och 3D rekonstruerade confocal bilder av hMSCs-loaded microtissues färgas av live/dead och rodamin phalloidin. (E) kvantifiering av hMSCs autoloading och spridning i GMs med olika inledande beläggningsgrader. (F) realtid injektion tvinga mätning kurvor för trippel injektioner av 1.000 GMs i 1 mL 15% (wt/vol) gelatin lösning vid 1 mL/min injektionshastighet (1 000-1-15%). (G) Live/dead cell livskraft haltbestämning av hMSCs-loaded microtissues före injektion och efter injektion. (H) spridning av hMSCs lastas i GMs efter injektion efter 1, 3 och 5 dagar av kultur (n = 3). * p < 0,05, envägs ANOVA jämfört med dag 1. Data presenteras som menar ± SEM. Denna siffra har ändrats med tillstånd från referens11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:förbättrat bärgning och ökat angiogenes i ischemisk bakbenen behandlas med 3D injicerbara Microtissues. (A) representativa fotografier av sham (n = 4), Tom microcryogels (n = 4), gratis hMSCs (105) (n = 8), hMSCs (105)-lastat microtissues (n = 8), och gratis hMSCs (106) (n = 4) på 0, 3, 7 och 28 dagen efter behandlingen. (B) fluorescens bilder erhållna 100 s efter ICG injektion dag 28. Denna siffra har ändrats med tillstånd från referens11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : 3D Microtissue matris för High-throughput drogkontroll. (A) fotografi av 3D microtissue array i 384-multi-väl format efter montering, och (B) resazurin cell lönsamhet analysen utförs på matrisen. (C) RFP-3T3-celler inom microcryogel efter sådd (skalstapeln = 200 µm). (D) 3D rekonstruktion av atomkärnor färgning föreställande homogen fördelning av celler i flera skikt i microcryogel. (E) Scanning electron Mikrograf bild av RFP-3T3-celler som sprider sig i stor utsträckning på avdunsta väggar i microcryogels (skalstapeln = 20 µm). Cytotoxicitet testning av (F) doxorubicin på HepG2 och (jag) IMMLG-8439 på NCI-H460 celler i 3D microtissue matris visar ökat IC50 jämföra till motsvarigheterna i 2D. Uppgifterna presenteras som menar ± SD. (G) små spheroids av HepG2 celler i microcryogel (skalstapeln = 100 µm), med (asterisker i H) partiell följsamhet på microcryogel väggen (skalstapeln = 20 µm). (J) NCI-H460 celler klibbade och sprids inom microcryogel (skalstapeln = 100 µm). (K) NCI-H460 celler uppvisar fibroblastic morfologi (skalstapeln = 20 µm). Denna siffra har ändrats med tillstånd från referens9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Regenerativ medicin och in vitro- modeller för drogkontroll är två viktiga användningsområden för tissue engineering5,6,7,8,9. Medan dessa två program har väldigt olika behov, ligger ett ostridigt mellan dem i behovet av en mer biomimetiska odlingsskålar villkoret att förbättra cell funktioner19. Endast med förbättrad cellfunktioner i forskning kan vi behandla sjukdomar bättre20,21, och om odlade celler återspeglar drog Svaren mer exakt kan vi påskynda drug discovery6,7. Cellöverlevnad efter engraftment i vivo är ett viktigt krav för regenerativ medicin, medan genomströmning är viktigt för drogkontroll att hantera tusentals föreningar i taget. Dessa två krav är specifika för deras respektive program och sällan kan en teknik uppfyller båda kraven. Således har vi unikt integrerat mikrofabrikation teknik med analyserna förberedelse att producera får microcryogels, som kunde vara skördade off-chip som enskilda cell-loaded bärare för regenerativ terapi, eller kvar på chip för ytterligare montering i matris för hög genomströmning drogkontroll. Den hur provtagningsutrustningen skall och macroporosity av dessa nya microcryogels tillåta automatisk och homogen lastning av celler genom enkel absorption. Med romanen microstencil tillverkning av microcryogel array marker, kan hundratals och tusentals hur provtagningsutrustningen skall cryogels med enhetliga och reproducerbara geometriska funktioner enkelt och effektivt sätt genereras. Microcryogels kunde förberedas och lagras av vakuum förpackning som en off-the-shelf, ready-to-use produkt att underlätta utarbetandet av 3D microtissues gemensamma laboratorier för senare ansökningar. Med denna fabrication teknik, kunde vi möta både utrett (3D kultur tillstånd för bättre Biomimetik) och särskilda krav för två olika applikationer (elasticitet att skydda celler under injektion för regenerativ medicin och hög genomströmning i formatet array för drogkontroll).
Cell-baserad terapi rymmer mycket lovande för reparation av olika skadade vävnader eller organ24. Cell lagring, cellöverlevnad och reproducerbarhet av behandlingen är dock fortfarande dålig på grund av mekaniska skador under injektion, hög läckage till omgivande vävnader, och ischemi och inflammation i i vivo miljön inom lesionen vävnaderna25. Vissa forskare har använt förformade cellulära aggregat för att förbättra fri cell injektionen. Det kräver dock en stor mängd celler form cellen aggregat, vilket leder till höga kostnader, icke-enhetlig storlek och okontrollerbara sammanlagda nummer26. Dessutom är mekanisk skada och celldöd fortfarande oundvikliga under injektionen. Alternativt, biomaterial-assisted cellterapi har utvecklats där responsiv biomaterial (t.ex., termisk eller pH-känsliga hydrogel) kan blandas med celler och gelation i situ inse cell lagring27. I situ tvärbunden biomaterial tillåter dock inte priming av celler in vitro- och resultatet i omedelbar exponering av celler till en ischemisk och inflammatoriska närmiljön på webbplatsen lesion. Det är angeläget att lösa dessa problem för att förbättra terapeutiska effektivitet. En stor fördel med microcryogels tillverkade med hjälp av detta protokoll är deras önskad inmatningskapacitet till följd av deras miniatyriserade storlek och enastående elasticitet, underlätta deras tillämpning i cell leverans. Inmatningskapacitet för microcryogels möjliggör cellskydd under cell leverans, därav de kunde utgöras i 3D injicerbara microtissues efter i vitro priming av celler i microcryogel att förbättra både extracellulär matrix (ECM) protein nedfall samt cell-cell interaktioner. De 3D injicerbara microtissues resultera i hur provtagningsutrustningen skall vävnad-liknande ensembler som representerar en optimal leverans-strategi för att underlätta cellskydd, engraftment, överlevnad, och därmed förbättra de ultimata terapeutiska effekterna på webbplatsen lesion.
Förutom förbättrade terapeutiska effekter för cellterapi var våra resultat också vägledande av komplexa konsekvenserna av 3D närmiljön på cellulära drog svaren. Utnyttja biomimicking odlingsbetingelser, skulle det vara möjligt att framkalla in vitro- cellulära drog Svaren mer representativ i vivo svar, därav accelerera drug discovery6,7, 28. Spheroids populärt val av 3D cell kultur konfiguration och många tekniker har utvecklats för att hjälpa forskare generera spheroids. Låg-självhäftande vävnadsodling plattor29 eller platta ytor som modifieras med nano-avtryck8 användes också till att tvinga celler till samlade genom att förhindra cell-matrix vidhäftning. Medan dessa tekniker är relativt enkel att använda, är problem som förlust av spheroids under utbyte av datamedium och andra operationer samt storlek variabilityen av spheroids problem som hindrar storskaliga antagandet av sådan teknik6. Mer homogena spheroids skapas med hängande droppe30,31,32,33, men det är arbetskrävande om inte använder specialiserade plåtar. Med hjälp av specialiserade flera hängande droppe plattor och integrera med automatiserad vätskehantering system6,31, high-throughput screening kunde realiseras. Den största nackdelen med sfäroid kultur är avsaknaden av ECM, som har identifierats för att spela avgörande roller i alla fysiologiska och patologiska vävnad utvecklingen34. En hjärna modell studie visade att spheroids odlade inuti en ECM schavotten, jämfört med ren spheroids, hade ökad resistens, förbättrad acidos tack vare ökad laktat produktion och förbättrad angiogenes med ökande uttryck för relaterade faktorer34. Andra studier har också visat att förekomsten av matrix kunde ge nödvändiga mechano-signalering för att främja EMT och stöder rekapitulation av tumör funktioner såsom invasion och metastaser3,35,36 , 37.
Med ökande förståelse för vikten av ECM i patologisk utveckling, finns det ingen tvekan om att införliva ECM i 3D kultur metoder kan hjälpa till att efterlikna i vivo situationer bättre6. Hydrogeler av naturliga eller syntetiska material har använts för att generera flera in vitro- 3D tumör modeller för bedömning av kemoterapeutika på grund av sin flexibilitet och manöverbarhet biofysiska egenskaper (till exempel styvhet)38 , 39 , 40 , 41 , 42. medan hydrogels med avstämbara biofysiska egenskaper hade verkligen modelleras viktiga biologiska funktioner av tumörceller att underlätta mer exakt drogkontroll, flera nackdelar med denna metod har hindrat dess utbredda användning i läkemedel screening. Crosslinking av polymerer i närvaro av celler är nödvändigt att kapsla in celler inom hydrogel matris, som kan potentiellt skada celler. Inte bara det, hydrogeler av olika biofysiska egenskaper presenterar olika utmaningar för att celler inkapslade i. Hög vattenhalt kan stöder celltillväxt i mjuk hydrogels, men sådana hydrogels försämras snabbt, ger kortsiktigt stöd för 3D cellodling. Däremot, styvare hydrogels med hög cross-linking kunde bromsa nedbrytningen men låg vattenhalt kunde inte stödja celltillväxt och hög crosslinker koncentrationen inducerar oftast hög cytotoxicity43,44. Inte bara så, förbereda 3D cellodling med hydrogeler är arbetsintensiva och är inte kompatibel med de flesta hög genomströmning vätskehanterande system som temperaturkontroll av hydrogel föregångare lösning är viktigt och störning av tunn tubens tips kan resultera från gelation av hydrogel inom tips. Dessa nackdelar har därmed föranlett sökandet efter alternativa ECM surrogat, dvsbyggnadsställning-baserade ECM34.
Använder redan bildade ställningar, celler kunde undantas från biomaterial tillverkningsprocessen och därmed ge möjlighet för mer kontroll över byggnadsställning fabrication hårdare villkor kunde användas utan rädsla för att skada cellerna. Flera undersökningar har visat att tumörceller odlade i 3D ställningar visar högre resistens jämfört med celler odlade i 2D på grund av ökad malignitet och ökad cell-ECM interaktion45,46, 47. sådana observationer stämmer överens med våra resultat som presenteras här. I vår andra verk, har vi ytterligare visat mångsidighet arrayen 3D microtissue och dess fördelar jämfört med de andra teknikerna som nämns ovan. I en nyligen arbete, vi skulle kunna förbättra nedsatt funktion genom att främja epitelial fenotypen av HepaRG celler genom odling på ett 3D microtissue array och sådan array applicerades drog levertoxicitet utvärdering47. På grund av likformigheten av porstorlek inom de 3D avdunsta ställningar kunde vi styra storleken på leverceller spheroids falla inom 50-80 µm, oavsett det ursprungliga cellen-sådd densitet. Detta ger en betydande fördel över gratis-bilda spheroids med ojämna storlekar. Inte bara göra spheroids växa jämnt inom varje byggnadsställning, celler mellan brunnar är också jämnt seedade, ger variationskoefficient (CV) jämförbara med celler sådd i 2D (dvsCV = 0,09 i 3D microtissue array och CV = 0,05 i 2D kommersiella plattan ; data som inte visas). I ett annat arbete, har vi visat att vi kunde bilda lever microtumor på 3D microtissue array för att sammanfatta tumör-stromal interaktioner för screening av stroma-omprogrammeras kombinatorisk terapi48. Lever microtumors genererades av långsiktiga (5 dagar) samtidig kultur av fibroblaster med tumörceller med hög täthet. Vi observerade hinder mot drogen diffusion på grund av den kompakta cellen och ECM struktur bildas i de lever microtumor, som observerades på samma sätt i vivo32. Med hjälp av luciferas-märkt cancerceller och mekaniskt-primade stromaceller, kombinerat med luminiscens av luciferin som den specifika avläsningssystem för cancerceller, high-throughput screening av nya terapeutiska medel eller kombinationer mot tumör-stromal interaktion är möjlig.
Trots de många unika fördelarna med vår teknik är en nackdel med nuvarande microcryogels icke-öppenhet, hindrar detaljerad optisk observation av celler i microcryogels. Ytterligare förbättringar för dessa microcryogels skulle omfatta finjustera sin optiska egenskaper för att förbättra avbildning av celler i microcryogels för observation. Dessutom har viktiga biofysiska egenskaper såsom styvhet inte undersökts i vår teknik, som skulle behöva tas upp om vi vill att bättre efterlikna fysiologiska och patologiska vävnader av olika biofysiska egenskaper.
Medan vår teknik möjliggör enkel generering av 3D microtissues, måste vissa försiktighetsåtgärder vidtas för framgångsrika experiment. När fabricera 3D microcryogels på microstencil matris chip, är det viktigt att säkerställa att microcryogels förblir fryst när den placeras i lyophilizer. Därför är det viktigt svalna före lyophilizer och överföra microcryogels från-20 ° C frysen till lyophilizer snabbt. Smältning av microcryogels före frystorkning eller under frystorkning kommer att orsaka porer att kollapsa och därmed påverkar porositeten av microcryogels fabricerade. När odling 3D microtissues i formatet array, krävs uppmärksamhet för att säkerställa vidhäftning mellan de två matriserna är tillräckliga för att förhindra korskontamination mellan brunnarna. Också, medan miniaturizing cellkultur har sin fördel öka genomströmningen och minska reagens konsumtion, dess nackdel är att volymen låg kultur kunde inte stödja långsiktiga cellkultur utan täta media påfyllnad. Inte bara så, det är viktigt att bibehålla fuktigheten av den kultur miljön för att förhindra påverkan på cellernas viabilitet genom media avdunstning, sedan bara några mikroliter av cellsuspensionen eller media läggs. Avdunstningen kommer också att påverka lönsamheten för celler i perifera brunnarna, det är därför viktigt att undvika att odla cellerna i dessa brunnar.
Trots ger vår robust teknik en möjlighet att generera 3D microtissues i en lätt-till-använda sätt, som kan potentiellt göra 3D kultur en vanlig cell manipulation metod för de flesta laboratorier, att påskynda både grundläggande och överbryggande vetenskap framsteg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick ekonomiskt stöd av den National Natural Science Foundation Kina (bidrag: 81522022, 51461165302). Författarna vill erkänna alla Du lab medlemmar för allmänt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | sigma | G7041 | All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated. |
| Glutaraldehyde | J&K | 902042 | Used as crosslinker in preparation of material. |
| Glass cover slip (24 x 50 mm) | CITOGLASS, China | 10212450C | To scrape prcursor solution onto microstencils array chips. |
| Sodium borohydride, NaBH4 | Beijing Chemical Works | 116-8 | To wash remaining glutaraldehyde away after gelation. |
| Vacuum jar | asperts, China | VC8130 | To preserve microgels under vacuum. |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets | Sunjin Electronics Co., Ltd, China | Ordinary PMMA sheets. | |
| Rayjet laser system | Rayjet, Australia | Rayjet 50 C30 | To engrave PMMA sheets to form wells. |
| Plasma Cleaner | Mycro Technologies, USA | PDC-32G | To make PMMA hyphophilic. |
| Lyophilizer | Boyikang, China | SC21CL | To lyophilize materials. |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Zhongkekeao, China | DA0065 | To dye microgels. |
| Doxorubicin hydrochloride | ENERGY CHEMICAL, China | A01E0801360010 | To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel. |
| Live/dead assay | Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) | CS01-10 | To distinguish alive and dead cells. |
| Cell Titer-Blue | Promega (Wisconsin, USA). | G8080 | To test cell viability. |
| Cell strainer | BD Biosciences, USA | 352360 | To collect microgels. |
| D-Luciferin | SYNCHEM (Germany) | s039 | To tack cells. |
| Scanning electron microscope | FEI, USA | Quanta 200 | To characterize microgel morphology. |
| Mechanical testing machine | Bose, USA | 3230 | To measure mechanical features. |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | ALADINI 1000 | To test injactabiliy. |
| Digital force gauge | HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China | H-50 | To test injactabiliy. |
| Ethylene oxide sterilization system | Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC | AN74i | To sterilize microgels with ethylene oxide gas. |
| Microplate reader | Molecular Devices,USA | M5 | To measure fluorescence intensity in micro-array. |
| Confocal microscope | Nikon, Japan | A1Rsi | To observe cell distribution in 3D. |
| Xenogen Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences, USA | IVIS | To track cell in animals. |
| Liquid work stataion | Apricot design,USA | S-pipette | To load medium or cell suspension high-throuputly. |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
- Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179 (2013).
- Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
- Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
- Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
- Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
- Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
- Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
- Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
- Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
- Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141 (2012).
- Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
- He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
- Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
- Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
- Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
- Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
- Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
- Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
- Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
- Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
- Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
- Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
- Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
- Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
- Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581 (2016).
- Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
- Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
- Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
- Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
- Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
- Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
- Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
- Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
- Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
- Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
- Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
- Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
- Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056 (2013).
- Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).
