Summary

3D Microtissues för injicerbara regenerativ terapi och hög genomströmning drogkontroll

Published: October 04, 2017
doi:

Summary

Det här protokollet beskriver tillverkning av elastisk 3D får microcryogels genom att integrera mikrofabrikation med cryogelation teknik. Vid lastning med celler, genereras 3D microtissues, som kan vara lätt injiceras i vivo att underlätta regenerativ behandling eller sammansatt till matriser för in vitro- hög genomströmning drogkontroll.

Abstract

För att uppgradera traditionella 2D cellkultur till 3D cellkultur, har vi integrerat mikrofabrikation med cryogelation teknik för att producera avdunsta hur provtagningsutrustningen skall cryogels (microcryogels), som kan laddas med en mängd celltyper att bilda 3D microtissues. Häri, presenterar vi protokollet för att fabricera mångsidig 3D microtissues och deras tillämpningar i regenerativ terapi- och drogkontroll. Storlek och form-kontrollerbara microcryogels kan fabriceras på en array-krets, som kan skördas off-chip som enskilda cell-loaded bärare för injicerbara regenerativ behandling eller ytterligare vara monterade på chip till 3D microtissue arrayer för hög genomströmning drogkontroll. På grund av hög elastisk hur dessa hur provtagningsutrustningen skall cryogels uppvisar de 3D microtissues stor inmatningskapacitet för minimalinvasiv cellterapi genom att skydda celler från mekaniska tvärkraften under injektionen. Detta säkerställer förbättrad cellöverlevnad och terapeutisk effekt i musmodell lem ischemi. Samtidigt underlättar montering av 3D microtissue matriser i ett standardformat för 384-multi-bra användning av gemensamma laboratorier och utrustning, möjliggör hög genomströmning drug screening på denna mångsidiga 3D cell kultur plattform.

Introduction

Traditionella cellkultur på tillplattad tvådimensionell (2D) ytor, såsom en kultur maträtt eller plattor med flera, kan knappast framkalla cell beteenden nära deras infödda stater. Korrekt rekapitulation av infödda cellulära mikromiljö, som består av olika celltyper, extracellulära matriser och bioaktiva lösliga faktorer i tredimensionella (3D) arkitekturer1,2,3 ,4, är nödvändigt att konstruera biomimicking vävnader i vitro för applikationer inom tissue engineering, regenerativ medicin, grundläggande biologi forskning och drug discovery5,6,7 ,8,9.

I stället för 2D cellkultur, 3D cellkultur används ofta att avancera biomimetiska mikro-arkitektoniska och funktionella egenskaper hos celler odlade i vitro. En populär 3D cell kultur metod är att aggregera celler i spheroids7,8,9,10. Cellulära spheroids kunde injiceras till skadade vävnader med ökad cellulär bevarande och överlevnad jämfört med injektion av spridda celler. Dock leda icke-enhetlig sfäroid storlekar och oundvikliga mekanisk skada ålagts celler av vätska tvärkraften under injektion till dålig cell terapeutiska effekter11,12,13. Likaså, det inneboende icke-enhetlighet under aggregering av spheroids har gjort deras översättning till 3D cellbaserade hög genomströmning drug screening utmanande10.

En annan metod för 3D cellkultur uppnås med hjälp av biomaterial, som vanligtvis sammanfattar celler i vattenlösning hydrogels eller porösa ställningar. Det möjliggör större flexibilitet i att bygga 3D arkitekturer. För terapi levereras vanligtvis celler inkapslade i bulk ställningar till djur förkroppsligar via kirurgisk implantation, som är invasiva och traumatisk, därav begränsa dess brett översättning till säng. Å andra aktivera vattenhaltiga hydrogels minimalinvasiv terapi genom att injicera celler upphängd i hydrogel föregångare lösning i djurens kroppar, så att i situ gelation via thermo-, kemiska eller enzymatisk crosslinking11. Dock som cellerna levereras samtidigt hydrogel prekursorer är fortfarande i en vattenlösning tillstånd, är de också utsatta för mekanisk skjuvning under injektionen. Inte bara det, kemiska eller enzymatisk crosslinking under i situ gelation av hydrogel skulle också innebära skador på celler inom. För drogkontroll möter biomaterial-assisted cellkulturer problem med jämnhet, manöverbarhet och genomströmning. Använda hydrogels, är celler vanligtvis inblandade under gelation, som processen kan påverka cellernas viabilitet och funktion. Gelation under cell sådd hämmar också användning av utrustning för de flesta hög genomströmning, eftersom hydrogel kan behöva hållas på is för att förhindra gelation innan cellen sådd, och hydrogel kan jam tubens tips, som är vanligtvis mycket tunna att säkerställa noggrannheten för High-throughput screening. Förformad ställningar kunde potentiellt separat biomaterial fabrication förfaranden från cellodling, men de flesta byggnadsställning-baserade produkter är tillgängliga som bulkmaterial med relativt lägre genomströmning14.

För att övervinna några av bristerna i nuvarande 3D kultur metoder, har vi utvecklat en mikrofabrikation-cryogelation integrerad teknik för att tillverka en off-the-shelf och användarvänlig microcryogel array chip15. I detta protokoll, är gelatin valt att exemplifiera microcryogel fabrication tekniken eftersom det är biokompatibla, nedbrytbara, kostnadseffektiva, och inga ytterligare ändringar krävs för cell fastsättning. Andra polymerer av naturliga eller syntetiska källor skulle också kunna användas för tillverkning, beroende på applikation. Via denna teknik kan vi tillverka miniatyriserade och mycket elastisk microcryogels med reglerbar storlek, form och layout. När den är lastad med en mängd olika celltyper, kunde 3D microtissues bildas för olika applikationer. Dessa unika funktioner aktivera önskad inmatningskapacitet, cellskydd och webbplats-regisserad lagring efter injektion i vivo för förbättrade terapeutiska effekter. Inte bara det, microcryogels kunde behandlas ytterligare för att bilda 3D microtissue matriser som är kompatibla med vanliga laboratorieutrustning och instrument för att förverkliga hög genomströmning cellodling för mångsidig drogkontroll och andra cellulära analyser. Häri, skall vi detalj tillverkningsprocessen av microcryogels och dess efterbehandling som enskilda 3D microtissues eller 3D microtissue vektorer för två viktiga program, cellterapi och drogkontroll, respektive10,15 .

Protocol

djurförsök följde strikta protokoll godkänts av djur etikkommittén på Center för biomedicinsk analys, Tsinghua University. Under godkännande av etisk kommitté, mänsklig fettvävnad erhölls från Institutionen för plastikkirurgi i Peking Union Hospital med informerat samtycke från patienterna. 1. tillverkning av 3D Microcryogels konstruktion och tillverkning av microstencil array marker använda en kommersiell programvara till design matriser av…

Representative Results

Tillverkning och karakterisering av microcryogels för 3D microtissue bildas. Enligt detta protokoll, microcryogels var fabricerade form 3D microtissues och enskilda microcryogels eller microcryogel matriser och tillämpades på regenerativ behandling och drug screening, respektive (figur 1). Microstencil array chips tillverkade av PMMA tillämpades som micromolds för microcryogel …

Discussion

Regenerativ medicin och in vitro- modeller för drogkontroll är två viktiga användningsområden för tissue engineering5,6,7,8,9. Medan dessa två program har väldigt olika behov, ligger ett ostridigt mellan dem i behovet av en mer biomimetiska odlingsskålar villkoret att förbättra cell funktioner19. Endast med förbätt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete fick ekonomiskt stöd av den National Natural Science Foundation Kina (bidrag: 81522022, 51461165302). Författarna vill erkänna alla Du lab medlemmar för allmänt bistånd.

Materials

Gelatin sigma G7041 All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde  J&K 902042 Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm) CITOGLASS, China 10212450C To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4 Beijing Chemical Works 116-8 To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar asperts, China VC8130 To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets  Sunjin Electronics Co., Ltd, China Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system Rayjet, Australia Rayjet 50 C30 To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner Mycro Technologies, USA PDC-32G To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer Boyikang, China SC21CL To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%) Zhongkekeao, China DA0065 To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride ENERGY CHEMICAL, China A01E0801360010 To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) CS01-10 To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue Promega (Wisconsin, USA). G8080 To test cell viability.
Cell strainer BD Biosciences, USA 352360 To collect microgels.
D-Luciferin SYNCHEM (Germany) s039 To tack cells.
Scanning electron microscope FEI, USA Quanta 200 To characterize microgel morphology.
 Mechanical testing machine Bose, USA 3230 To measure mechanical features.
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA ALADINI 1000 To test injactabiliy.
Digital force gauge HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China H-50  To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC AN74i To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader Molecular Devices,USA M5 To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope Nikon, Japan A1Rsi To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system Caliper Life Sciences, USA IVIS To track cell in animals.
Liquid work stataion Apricot design,USA S-pipette To load medium or cell suspension high-throuputly.

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179 (2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141 (2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581 (2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056 (2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Play Video

Cite This Article
Li, Y., Yan, X., Liu, W., Zhou, L., You, Z., Du, Y. 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening. J. Vis. Exp. (128), e55982, doi:10.3791/55982 (2017).

View Video