Summary
Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.
Abstract
Para obtener cultivos celulares 2D tradicional cultivo celular 3D, hemos integrado microfabricación con tecnología cryogelation para producir macroporoso microescala cryogels (microcryogels), que puede ser cargado con una variedad de tipos de la célula para formar microtissues 3D. Adjunto, presentamos el protocolo para fabricar microtissues 3D versátil y sus aplicaciones en la terapia regenerativa y la investigación de la droga. Tamaño y microcryogels forma controlable puede ser fabricado en un chip de la matriz, que puede ser cosechada de chip como portadores cargados de células individuales para terapia regenerativa inyectable o ser más montado en un chip en arreglos de discos de microtissue 3D de alto rendimiento detección de drogas. Debido a la alta naturaleza elástico de estos cryogels de microescala, microtissues 3D exhiben gran inyectabilidad de terapia mínimamente invasiva celular protegiendo a las células de la fuerza de esquileo mecánico durante la inyección. Esto asegura la supervivencia realzada de la célula y el efecto terapéutico en el modelo murino de isquemia del miembro. Mientras tanto, conjunto de matrices de microtissue 3D en un formato estándar de 384-multi-well facilita el uso de instalaciones comunes de laboratorio y equipo, lo que permite la detección en esta plataforma de cultura celular 3D versátil de alto rendimiento drogas.
Introduction
Cultura tradicional de la célula en aplanado superficies de dos dimensiones (2D), como una placa de cultivo o placas de varios pocillos, apenas puede provocar comportamientos celulares cerca de sus Estados nativos. Precisa recapitulación de microambientes celulares nativos, que forman parte de diversos tipos de células, matrices extracelulares y factores solubles bioactivos en arquitecturas (3D) tridimensional1,2,3 ,4, es esencial para construir biomimicking tejidos en vitro para aplicaciones en medicina regenerativa, ingeniería de tejidos, biología fundamental de investigación y drogas descubrimiento5,6,7 ,8,9.
En lugar de cultivo celular 2D, cultivo celular 3D es ampliamente utilizado para avanzar la micro arquitectura biomimética y características funcionales de las células cultivan en vitro. Es un método de cultura popular celular 3D agregadas células en esferoides7,8,9,10. Esferoides celulares podrían ser inyectados a los tejidos lesionados con mayor retención celular y la supervivencia en comparación con la inyección de células dispersas. Sin embargo, inevitable lesión mecánica impuesta en las células por la fuerza de esquileo flúida durante la inyección y tamaños no uniformes esferoide llevan al pobre celular efectos terapéuticos11,12,13. Del mismo modo, la inherente falta de uniformidad durante la agregación de esferoides ha hecho su traducción a 3D celular alto rendimiento de detección de drogas difíciles10.
Otro método para el cultivo celular 3D se logra con la ayuda de biomateriales, que por lo general encapsula las células en acuosos hidrogeles o andamios porosos. Permite una mayor flexibilidad en la construcción de arquitecturas 3D. Para la terapia, las células encapsuladas en andamios a granel se entregan generalmente al cuerpo animal a través de implantes quirúrgicos, invasivos y traumáticos, por lo tanto restringiendo su traducción amplia al paciente. Por otro lado, acuosos hidrogeles permiten terapia mínimamente invasiva mediante la inyección de células suspendidas en solución precursora de hidrogel en cuerpos de animales, lo que en situ la gelificación a través de termo-, reticulación química o enzimática11. Sin embargo, como las células se entregan mientras que los precursores de hidrogel son todavía en un estado acuoso, están también expuestos a esquileo mecánico durante la inyección. No sólo esto, reticulación química o enzimática durante la gelación en situ de hidrogel también podría imponer daño a las células dentro de. Para la detección de drogas, cultivos celulares asistida biomaterial problemas con uniformidad, capacidad de control y rendimiento. Utilizando hidrogeles, las células normalmente participan durante la gelificación, por el cual el proceso puede afectar la función y viabilidad de las células. Congelación durante la siembra de células también impide el uso por la mayoría de equipos de alto rendimiento, puesto que el hidrogel deba conservarse en hielo para evitar la congelación antes de la siembra de la célula, y el hidrogel puede atasc dispensadora de puntas, que son generalmente muy delgadas para asegurar la exactitud de proyección de alto rendimiento. Andamios de formados potencialmente podrían separar procedimientos de fabricación del biomaterial de cultivo celular, sin embargo la mayoría están disponibles como materiales a granel con relativamente bajo rendimiento14productos a base de andamio.
Para superar algunas de las deficiencias de los actuales métodos de cultura 3D, hemos desarrollado una tecnología de microfabricación-cryogelation integrado para fabricar un microcryogel estándar y fácil de usar array chip15. En este protocolo, gelatina es seleccionada para ejemplificar la técnica de fabricación de microcryogel ya que es biocompatible, degradable, rentable, y ninguna modificación adicional se requiere para la fijación de la célula. Otros polímeros de fuentes naturales o sintéticas también podrían utilizarse para la fabricación, dependiendo de la aplicación. Mediante esta tecnología, podemos fabricar microcryogels miniatura y muy elástico con controlable tamaño, forma y diseño. Cuando está cargado con una variedad de tipos de la célula, microtissues 3D podría formado para diversas aplicaciones. Estas características únicas permiten inyectabilidad deseado, protección celular y retención dirigida después de la inyección en vivo para mayor efectos terapéuticos. No sólo esto, la microcryogels podría ser procesado más lejos para formar matrices de microtissue 3D que son compatibles con el equipo común de laboratorio e instrumentos para realizar el cultivo celular de alto rendimiento para detección de drogas versátil y otros ensayos celulares. Aquí, vamos detallamos el proceso de fabricación de microcryogels y su posterior tratamiento como microtissues 3D individuales o conjuntos de microtissue 3D para dos aplicaciones importantes, terapia celular y detección de drogas, respectivamente10,15 .
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Protocol
experimentos con animales seguido estricto protocolo aprobado por el Comité de ética Animal en el centro de análisis biomédico de la Universidad de Tsinghua. Bajo aprobación del Comité de ética, el tejido adiposo humano se obtuvo del Departamento de cirugía plástica de Pekín Unión Hospital con consentimiento informado de los pacientes.
1. fabricación de 3D Microcryogels
- diseño y fabricación de chips de gama microstencil
- uso un software comercial para diseño de matrices de geometrías específicas, tales como círculos, elipses, triángulos o tréboles 14, dependiendo de la aplicación subsecuente.
Nota: Consulte la sección 2 del protocolo para la medicina regenerativa y artículo 3 del protocolo para la detección de drogas para detalles de diseño. - Importar el diseño en el software que acompaña a la máquina de grabado láser de grabado del laser. Utilizando la configuración de láser según las recomendaciones de la fábrica de la máquina de grabado láser, láser-grabado el diseño importado a Poly (methymethacrylate) (PMMA) hojas de.
- Lavar las fichas de microstencil arsenal con agua desionizada para limpiar residuos del grabado del laser. Seca la matriz microstencil virutas a 60 ° C. tienda en una bolsa sellada a temperatura ambiente durante meses.
- uso un software comercial para diseño de matrices de geometrías específicas, tales como círculos, elipses, triángulos o tréboles 14, dependiendo de la aplicación subsecuente.
- Fabricación de fichas de microcryogel arsenal
- 4 lugar microstencil array de chips en la bandeja de muestra e introducir en el plasma limpiador. Cierre la puerta de la máquina y encienda la bomba de vacío durante 2 min., girar en la potencia de RF máxima (18 W) para el tratamiento de las virutas de la matriz de microstencil en el plasma limpiador por 3 min a temperatura ambiente para incrementar la hidrofilicidad.
- Gelatina de 0,06 g añadir a 1 mL de agua desionizada para formar 6% (peso/vol) gelatina solución precursora (suficiente para hacer 5 chips). Caliente a 60 ° C en un baño de agua para disolver adecuadamente. Incubar en hielo por 5 min
- Agregar 3 μl de glutaraldehido en la solución precursora de gelatina a una concentración final de 0.3%. Mezclar muy bien.
- Solución de precursora pipeta de 200 μL con glutaraldehido en la superficie superior de la viruta de la matriz de microstencil.
Nota: 200 μL es suficiente para un chip de 75 x 25 mm independientemente del diseño. Aumentar la cantidad proporcionalmente cuando se incrementa la superficie de la viruta de. - Manualmente se distribuya la solución sobre el chip raspando la parte posterior y hacia atrás con una varilla de vidrio doblada 2 a 3 veces.
Nota: Cada micro pozo en el chip de microstencil puede ser llenada con solución precursora debido a su naturaleza hidrofílica después del tratamiento de plasma. - Inmediatamente Coloque el chip de la matriz llena de solución precursora en un congelador de-20 ° C por 16 h de cryogelation.
- Ajustar el liofilizador a-40 ° C durante 30 minutos colocar los chips de gama después de cryogelation en el liofilizador y liofilizar las virutas de la matriz por 2 h en vacío.
Nota: La gelatina microcryogels con macroporos interconectados se forman porque el hielo formado durante cryogelation sublimes en el liofilizador. - Proceder a 2 para el tratamiento de la isquemia crítica del miembro (CLI) de la sección y la sección 3 para proyección de alto rendimiento drogas.
2. Cosecha Microcryogels Individual para Microtissues 3D forma inyectable para el tratamiento de CLI
- cosecha individual microcryogels
- diseño de matrices (75 mm × 25 mm) de 600 círculos, cada uno con 400 μm de diámetro, en software comercial para la construcción de microtissue 3D inyectable. Uso de PMMA de 300 μm de espesor para la fabricación de chip de microstencil matriz como indica en la sección 1.1.
- Fabricar chips de matriz de microcryogel como en la sección 1.2.
- Fabricar una matriz de PDMS perno del eyector con el mismo diseño como en el paso 2.1.1 por litografía blanda estándar 16 , 17.
- El recubrimiento del chip de matriz microcryogel en la parte superior del conjunto de perno del eyector de PDMS, alineando cada microcryogel con un perno del eyector en la matriz. Presione el chip de la matriz de microcryogel hacia la matriz de pin eyector para empujar el microcryogels de los micropocillos con las clavijas que sobresalen en la matriz de pin eyector PDMS cosecha individual microcryogels.
- El microcryogel la cosecha en el agua y recoger con la ayuda de los filtros de la célula. Use un colador para recoger microcryogels de un chip (es decir, 600 microcryogels).
- Microcryogels de lavado con 0,1 M NaBH 4 en hielo por 20 min calmar cualquier residuo de aldehído uncross-enlazados. Utilizar 5 mL de 0.1 M NaBH 4 por chip. Descarte de NaBH 4 y lavar con 5 mL de agua desionizada durante 15 min de 3 a 5 veces, cada vez.
- Tirar el agua de la coladera de la célula y reunir microcryogels en un clúster por colador celular y un clúster en un plato de Petri de 35 mm con una pinza curva. Añadir 50-70 μl desionizada agua a cada cluster y cubre la tapa de la caja Petri. Golpear suavemente la placa de Petri en la mesa de nivelar todos los microcryogels, para que no microcryogels son mentira en la parte superior otro microcryogel para formar una monocapa de microcryogels en la superficie de la placa de Petri.
- Congelar las microcryogels cosechadas a-20 ° C por 4 a las 16 h antes de lyophilizing de 2 h (ver paso 1.2.7). Almacenar microcryogels en el vacío a temperatura ambiente hasta su utilización más.
- Caracterización de microcryogels
- evaluar los poros de la microcryogels mediante la exploración de la proyección de imagen de microscopia electrónica (SEM).
- Inmovilizar la microcryogels cosechada y liofilizado en un portamuestras por cinta adhesiva de doble cara y escudo de oro con un recubridor sputter por 90 s, antes de la proyección de imagen por SEM 11. Evaluar y analizar la distribución de diámetros de poros en el microcryogel de siete diferentes imágenes de SEM utilizando software de análisis de imagen.
- Peso un grupo de 600 microcryogels liofilizados en un plato de Petri de 35 mm para el peso de la gelatina seca microcryogels (GMs). Añadir agua desionizada μl 60 a la agrupación de microcryogels liofilizado y esperar 30 s para microcryogels absorben el agua y se hinchan. Pesar el microcryogels hinchado.
Relación hinchazón
- Determine el equilibrio y la porosidad del microcryogels, como el cociente del peso de la hinchada microcryogels de microcryogels de la gelatina seca y la relación de peso del agua celebrada en microcryogels al de microcryogels hidratada, respectivamente 13.
- Inyectabilidad de medida de microcryogels con una bomba de jeringa programable integrada con una fuerza digital calibre 14.
- 600 mancha microcryogels por Trypan azul y suspender en 600 μl 15% gelatina solución para lograr una distribución homogénea. Carga de suspensión de microcryogel de 1 mL en jeringa de 1 mL. Inyectar la mezcla a través de una aguja de calibre 27 a la jeringa de 1 mL con una bomba de jeringa programable en velocidad de flujo de 1 mL/min
- Inyección en tiempo real monitor fuerza por fuerza digital calibrador de prueba y trazar la curva fuerza-tiempo. Después de la inyección, observar la integridad de microcryogels bajo el microscopio.
Nota: GMs suspendidos en solución al 15% (peso/vol) gelatina pueden ser suavemente inyectados y permaneció intactas después de la inyección.
- Caracterizan la degradabilidad de microcryogels.
- En primer lugar, medir el peso de un grupo de 600 microcryogels liofilizados en un plato de Petri de 35 mm como el peso seco. Luego, sumerja 600 microcryogels liofilizados en 2 mL 0,025% (vol/vol) tripsina/EDTA.
- Recoge microcryogels de la solución utilizando un colador de células en diferentes puntos temporales (es decir, 10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70 min). Mecha lejos exceso de solución con un pañuelo. Medir el peso de microcryogels en diferentes puntos temporales y calcular el grado de degradación, como el cociente del peso de microcryogel en un determinado momento de tiempo a la de microcryogel al tiempo cero.
- evaluar los poros de la microcryogels mediante la exploración de la proyección de imagen de microscopia electrónica (SEM).
- Autoloading de células en microcryogels a forma microtissues 3D
- esterilizar microcryogels de paso 2.1.8 por sistema de esterilización de óxido de etileno con la exposición de gas 12 h seguido de 12 h de desgasificación bajo vacuum.
- Eligen humanas derivados del adiposo stromal células mesenquimales (hMSCs) para el tratamiento de ratón trasera isquémica. Aisladas células por los procedimientos siguientes según lo divulgado previamente 18.
- Cultura hMSCs en el crecimiento medio que contiene 2% de suero bovino fetal (FBS), ng/mL 10 factor de crecimiento epidérmico (EGF), 10 bb ng/mL de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-bb), 1 X selenio de transferrina de insulina (ITS), 10 -8 M dexametasona, 10 -4 M ácido ascórbico 2-fosfato, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL de DMEM/F12. Paso de las células en la proporción de 1:3 cuando confluente. De células de pasaje 3 a 5 en los experimentos siguientes.
- Cosecha de hMSCs con tripsina y cuantificar el número de celular con una cámara de conteo de Fuchs-Rosenthal y suspender a una densidad de 8 x 10 6 células/mL en un medio de hMSCs.
- Suspensión de hMSCs μl de pipeta 60 en la monocapa de 600 microcryogels con diámetro de 400 μm en un plato de 35 mm de la sección 2.1. Las células son absorbidas automáticamente en las estructuras de micro porosas de la microcryogels.
- Mantener en una cámara humidificada y se incuba a 37 ° C por 2 h permitir que las células a conectar. Después de 2 h de incubación, agregar 2 mL medio de cultivo. Cambiar el medio cada 2 días. Cultura microcryogels cargado de hMSCs durante 2 días formar 3D microtissues.
- Después de 2 días de cultivo, Pipetear 100 microcryogels cargado de hMSCs por pozo en una placa de 96 pocillos, agregar 120 μl de solución de resazurina trabajo preparada según el fabricante ' instrucción de s en cada pozo. Incubar por 2 h a 37 ° C.
- Detectar fluorescencia de resazurina metabolizado por las células viables en un lector de microplacas con una longitud de onda ligera excitación de 560 nm y emisión de luz longitud de onda de 590 nm. Establecer una curva estándar del número de célula vs fluorescencia usando hMSCs para interpolar el número de células de intensidad de fluorescencia para futuro experimento según el kit protocolo 13.
- Evaluar número de hMSCs en microcryogels desde el día 0 a día 4 con resazurina como se describe en paso 2.3.7 desde el día 0 al día 4.
- Tinción de células en microcryogels con dilución 1: 500 de calceína AM y la dilución de 1: 250 de yoduro de propidio (conocida como tinción de live/dead) en tampón fosfato salino (PBS) y observar en microscopio de fluorescencia o microscopio de fluorescencia confocal.
- Inyección de microtissues 3D en vivo para el tratamiento de CLI en modelo de ratón
- establecer isquemia crítica trasera de hembras BALB/c nude ratones reportados 11 , 19 para determinar el efecto terapéutico de la terapia basada en microtissue 3D.
- Transferencia de la microtissues de paso 2.3.6 usando una pipeta de 5 mL en un colador de la célula y a filtrar el medio de cultivo.
- Suspender el microtissues 3D cargado de hMSCs en solución de gelatina 15%, con una densidad de 100 microcryogels por 100 solución μl.
- Antes de la cirugía, esterilizar instrumentos quirúrgicos por autoclave y realizar la cirugía en un quirófano de animales en un centro de instalaciones animales.
- Coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100% con un caudal de 1 L/min eritromicina aplicar sobre los ojos del ratón para evitar que se sequen. A través de una incisión en la piel de 1 cm de largo, ligar la arteria femoral y sus ramas con las suturas de seda de 5-10 y suprimir 19.
- Inyectar del verde del indocyanine (ICG) (0.1 mL de 100 μg/mL) a través de la vena de la cola de inyección para monitorear el flujo de sangre. Realizar la proyección de imagen de fluorescencia ICG con una sistema de imagen de la fluorescencia (aquí, sistema casero) en la geometría de reflexión 11.
- Intramuscular inyectar microtissues en tres sitios del músculo gracilis alrededor de la incisión de la arteria utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de calibre 23.
- Después de la cirugía, mantener el ratón caliente con una almohadilla de calefacción en la jaula de recuperación. Inyectar en forma subcutánea meloxicam para aliviar el dolor y controlar continuamente hasta que despierto.
- Después de 28 días, controlar la eficacia terapéutica de la extremidad tratada con microtissue 3D por fluorescencia imágenes 11.
Nota: Inyectar en forma subcutánea meloxicam para aliviar el dolor cuando el ratón mostró amputación espontánea. - Euthanize ratones con dióxido de carbono después de la terminación de los experimentos.
Nota: Aquí, eutanasia con dióxido de carbono se realizó según estricto protocolo aprobado por el Comité de ética Animal en el centro de análisis biomédico de la Universidad de Tsinghua.
3. Asamblea de Microtissue Array Chip para la detección de drogas de alto rendimiento
- montaje de matriz de microcryogel para el cultivo de la en-viruta celular
- modificar el diseño en el punto 1.1, según dimensiones de placa multi-bien convencional, es decir, para el formato 384-multi-well, diseñar una matriz de 16 × 24 pozos (fila por columna), cada uno de separación de 2 mm de diámetro y 4,5 mm de centro a centro.
- Laser graba sobre una hoja PMMA espesor de 500 μm, como se describe en la sección 1.1.
- Fabricar microcryogels como se describe en la sección 1.2 uso de que el chip de 384-multi-well matriz obtenido paso 3.1.2. Esta matriz que contiene microcryogel es señalada como el chip de la matriz de microcryogel.
- El chip de la matriz de microcryogel de lavado con 50 mL 0.1 M NaBH 4 saciar cualquier aldehído residual uncross-ligado, luego repetidamente enjuague con 50 mL de agua desionizada para h 2 3 veces, cada vez.
- Deseche el agua, la congelación de la viruta de la matriz de microcryogel a-20 ° C por 4 a las 16 h antes de 1.llenar según paso 1.2.7.
- Diseño de matriz de modificar 384-multi-well en paso 3.1.1 para contener 16 × 24 pozos, cada uno de separación de 3 mm de diámetro y 4,5 mm de centro a centro.
- Quitar un lado de la base de una hoja de ultra finas (10 μm) biocompatible doble cara cinta adhesiva y pegarlo a un lado de un pedazo de hoja de PMMA de 3 mm de espesor. Laser graba el diseño del paso 3.1.4 en esta hoja PMMA de 3 mm de espesor según el artículo 1.1. Esta matriz ha sido designada como la matriz embalse.
- Alinee el conjunto de microcryogel de la viruta con el chip de depósito matriz y adherirse juntos firmemente para montar el chip de la matriz de microcryogel 3D para el cultivo celular de la en-viruta. Esterilizar por radiación ultravioleta para 1 h.
- Matriz 3D microcryogel tienda fichas en vacío a temperatura ambiente durante experimentos adicionales.
- Drug screening en arreglos de discos de microtissue 3D
- llenar una caja húmeda con 25 mL de agua desionizada estéril para servir como una cámara de humedad para el cultivo celular. Pre-heat en un vapor 5% CO 2 incubadora a 37 ° C.
- Cosecha de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NCI-H460) y las células del carcinoma hepatocelular (HepG2) de las placas de cultivo de tejidos según protocolo estándar y vuelva a suspender en medios de cultivo a una densidad final de 1.0 x 10 6 células/mL. Mezclar muy bien.
Nota: RPM1640 con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL se utiliza para NCI-H460. Uso de DMEM con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL para HepG2. - Extraiga la cámara de humedad de la incubadora. Utilice unas pinzas para cuidadosamente lugar 3D montado microcryogel array chip de paso 3.1.9 de la cámara de humedad. Tener cuidado de no mojar el microcryogels con agua en la cámara de.
- Mezclar la suspensión de células, entonces alícuota 3 μl de suspensión celular directamente en el microcryogel en cada pocillo.
Nota: La punta debe tocar ligeramente la superficie de la microcryogel antes de expulsar de la suspensión celular. Las células son auto cargado en el microcryogel por absorción. No de semilla de las células en los pocillos periféricos. - Añadir 10 μL de los medios de comunicación a cada pocillo después de que las células se siembran en microcryogel con pipeta de varios canales, como un controlador líquido de 96 canales. Medio también se añade a los pocillos periféricos.
Nota: Los medios de uso RPM1640 con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL streptomycin para las células H460. Utilizar medios DMEM con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL para las células de HepaG2. - Cultura la matriz de célula de carga microcryogel de la viruta en la cámara de humedad durante 24 h en un vapor 5% CO 2 incubadora a 37 ° C en forma microtissue 3D array.
- Disolver doxorrubicina y IMMLG-8439 9 en dimetil sulfóxido (DMSO) para formar una solución stock de 10 mM. Diluir medicamentos con medio de cultivo para formar un gradiente de concentración de la dilución de 10 veces de 2 nM a 200 μm.
- Añadir 10 μl de las soluciones de drogas en cada pozo. Usar 0,1% DMSO (diluido en medio) como el control. Incubar la matriz de microtissue 3D cargado de droga en humidificado 5% CO 2 incubadora a 37 ° C por 24 h.
- Añadir 4 μL de solución madre de resazurina en cada pocillo. Incubar a 37 ° C para la matriz de microtissue lugar el 3D de 2 h. en el lector de microplacas y detectar la fluorescencia de resazurina metabolizado por las células viables en una longitud de onda ligera excitación de 560 nm y emisión de luz longitud de onda de 590 nm.
- Restar la señal de referencia de resazurina de todos los pozos antes de procesamiento de datos más. Calcular la fracción de viabilidad celular de cada pocillo dividiendo la señal de fluorescencia por la señal de fluorescencia promedio de los pocillos control.
- Trazar la curva de dosis-respuesta en software de trazado con la fracción de viabilidad celular como el de las ordenadas y el logaritmo base 10 de la concentración de la droga como el eje x. Interpolar la concentración de inhibición del 50% (IC50) en la fracción de viabilidad de células de 0.5.
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Representative Results
Fabricación y caracterización de microcryogels para la formación del microtissue 3D.
Según este protocolo, microcryogels fueron fabricados para forma el 3D microtissues y microcryogels individuales o conjuntos de microcryogel y fueron aplicados a la terapia regenerativa y de la droga detección, respectivamente (figura 1). Microstencil fichas de matriz de PMMA fueron aplicados como micromolds para arreglos de microcryogel. Variables geométricas podrían prepararse para el chip de la matriz de microstencil. Elegimos un representante de 45 x 14 mm microstencil array chip como por ejemplo, que contenía varias formas (es decir, círculo, elipse, triángulo y trébol) y un chip de matriz microstencil circular con diferentes tamaños (diámetro = 100, 200, 400 y 800 μ m). para mejorar la visibilidad de micromolds en las fichas de arreglo de discos, imágenes de epi-iluminación ligera fueron observados (figura 2A, B). Microcryogels de los chips de gama exhibieron formas deseadas y tamaños (figura 2, D). Tales microcryogels con las características geométricas deseadas podría aplicarse posiblemente como plantillas para formar diferentes unidades celulares que imitan ciertas arquitecturas de tejidos indígenas. El GMs cosechados (gelatina microcryogels) tenían formas predefinidas y tamaños (Figura 3A). Observación de SEM demostró que microcryogels contiene estructuras interconectadas macroporoso con tamaños de poro en el rango de 30-80 μm (figura 3B).
Inyectabilidad mejorada de microtissues cargado de hMSCs para salvar la extremidad isquémica mejora
Usando la bomba de jeringa programable integrado con un medidor de fuerza digital14, la inyectabilidad de GMs se evaluó cuantitativamente. Con un caudal de 1 mL/min, el GMs con una densidad de 1.000 microcryogels por mL se inyectaron menores de 6 años N, que era más baja que la clínicamente aceptable fuerza de 10 N20 (figura 3F). Basándose en la protección celular activado por GMs, hMSCs en GMs tenían alta viabilidad y mantuvo gran capacidad proliferativa después de la inyección durante 5 días de cultivo (figura 3 H).
El modelo murino de isquemia del miembro fue elegido para evaluar la eficacia terapéutica de la microtissues cargado de hMSC inyectable. Estado fisiológico de las extremidades isquémicas examinaron 28 días después de la cirugía (Figura 4A). No salvar la extremidad se observó en el grupo de simulacro o grupo de control de GMs. En el grupo de tratamiento de células de5 10 50% total del dedo del pie amputación, amputación parcial del dedo del pie de 25% y 25% amputación parcial fueron observados dentro de 7 días, dando por resultado la pérdida de una extremidad el 80% y 20% total del dedo del pie amputación después de 28 días. En cambio, microtissues el tratamiento con 105 hMSCs logró salvar la extremidad mejorados (75%) con sólo 25% ratones mostraron la amputación espontánea del dedo del pie después de 28 días. 10 hMSCs6 , el número de celular eficaz mínimo utilizado en la mayoría de los estudios anterior, fue elegido como el control positivo de21. Sólo 2 de los 4 ratones mostraron recuperación de la extremidad, pero todos tenían necrosis menor.
Perfusión de la sangre fue monitoreada y evaluada en la ayuda del verde del indocyanine (ICG), un agente de contraste angiográfico aprobado por la FDA. El resultado demostró que las señales de fluorescencia aparecieron en los ratones tratados con microtissue y en los 106 gratis hMSCs ratones tratados. No hay ninguna señal de fluorescencia evidente en los miembros posteriores isquémicos en el farsa o el grupo de GM hasta el día 28 (Figura 4B).
Estos resultados confirmaron más que terapia de hMSCs 3D asistido por microtissue conseguido superiores efectos terapéuticos para el tratamiento de CLI que representa hasta ahora la mínima dosis eficaz para la terapia celular en el modelo murino.
Proyección de alto rendimiento drogas citotoxicidad en chip de matriz 3D microtissue
Una matriz de microcryogel 3D listos para usar para el cultivo celular de la en-viruta podría ser fácilmente fabricada por microcryogels en el chip PMMA de retención después de la liofilización y la combinación con el correspondiente chip bien arreglos con cintas adhesivas biocompatibles (figura 1 y figura 5A). En esta matriz de la cultura de dos partes de la célula, el chip bien matriz superior sirve como reservorios para el medio de cultivo, soluciones de drogas y reactivos de análisis, mientras que las células fueron cultivadas en el 3D microcryogel inmovilizada en el chip de gama inferior. Las cintas adhesivas entre el chip de gama superior e inferior permitido generación de 384 pocillos individuales para el cultivo de alto rendimiento 3D celular (figura 5B), por lo tanto, proporcionar una herramienta práctica para el descubrimiento de medicamentos.
Como se describe en el protocolo, microtissue 3D arsenal estaba formado por siembra directamente células en microcryogels antes de agregar el medio a los embalses. Utilizando células NIH-3T3 etiqueta RFP, demostramos que las células se distribuyeron uniformemente con varias capas dentro de la arquitectura 3D de microcryogels (figura 5, D). Imágenes SEM demostraban que las células se adhirieron firmemente a las paredes de los poros e incluso exhibieron filopodia extendida a lo largo o a través de las paredes adyacentes de macroporos en el microcryogels (figura 5E).
A continuación mostramos la viabilidad de la aplicación de esta matriz microtissue 3D para prueba usando dos líneas celulares de cáncer y dos compuestos de la droga de alto rendimiento. Las células del carcinoma hepatocelular (HepG2) fueron tratadas con doxorrubicina, mientras que las células de cáncer no microcítico de pulmón (NCI-H460) fueron tratadas con IMMLG-8439, un nuevo inhibidor de tumor. Se administraron concentraciones discretas de cinco a nueve de cada droga a seis pozos adyacentes como repeticiones, con 0,1% de DMSO en medio de cultivo como el control negativo. Semejantemente se realizó un ensayo de citotoxicidad para las células cultivadas en placas de varios pocillos 2D tradicionales. Después de 24 h de incubación, el ensayo de viabilidad celular se utilizó para evaluar las respuestas de la droga de las células tanto en 2D como en 3D. Curvas de respuesta de la droga se trazaron utilizando las tasas de viabilidad celular normalizado en las concentraciones de fármaco diferente, y la IC50 luego se interpolan de estas curvas. Un valor de IC50 indicaría que las células son más resistentes a las drogas. De figura 5F y 5I, observamos un aumento significativo en la resistencia a las drogas cuando las células fueron cultivadas en matriz microtissue 3D que en 2D. El IC50 de doxorubicina contra las células HepG2 alcanzó 165.959 μm, en relación con 18.239 nM en 2D; el IC50 de IMMLG-8439 en las células NCI-H460 semejantemente fue elevado a 331.894 nM en 3D mientras que sólo requieren 1.294 nM en 2D. Tal observación terminó en concordancia con reportes de la creciente farmacorresistencia en cultura 3D 2D cultura por otros investigadores22,23.
Atribuye este incremento en resistencia a los medicamentos a la complejidad del microambiente 3D en comparación con elconfiguración planar de cultura 2D. Imágenes SEM revelaron que las células HepG2 se reunieron como esferoides decorar las superficies de macroporos en el microcryogel. Estas células se agrupan apretadamente y tal interacción realzada de la célula podría ser una fuente de resistencia a los medicamentos en HepG222. También es interesante notar que estos racimos de célula no fueron esferoides suspendidas libremente como que todavía mantuvieran cierta adhesión a la matriz (figura 5, H). Por el contrario, epitelial-mesenquimales-transición (EMT) se especula que se han producido cuando las células de cáncer de pulmón no pequeñas, NCI-H460, fueron cultivadas en 3D microcryogels. CNJ-H460 células repartidas como fibroblastos (figura 5J, K) en vez de clustering como HepG2. Por lo tanto, especula que el aumento en la resistencia a los medicamentos podría ser el resultado de una transición de epiteliales células NCI-H460 a un más maligno estado18,19,20,21,22 ,23.
Figura 1 : Esquema de 3D Microtissue fabricación y aplicación en terapia regenerativa y detección de drogas. Brevemente, chip de microcryogel tamaño y forma controlable fue fabricado en un chip PMMA de la matriz por cryogelation de gelatina. Las fichas de microcryogel pueden ser cosechada de chip como microcryogels individual y microcryogels más, que los puede auto cargado con células cultivadas para formar microtissues 3D para terapia regenerativa inyectable. Otra aplicación de fichas de microcryogel es de montar con un chip de depósito matriz y luego cargar aún más, las células y la cultura en arreglos de discos de microtissue 3D para la detección de drogas de alto rendimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:fichas de Microstencil arsenal. (A, B) Fotografías de dos fichas de microstencil PMMA que contienen v. pocillos con diferentes formas (es decir, círculo, elipse, triángulo y trébol) y forma circular de diferentes tamaños (diámetro: 100, 200, 400 y 800 μm), respectivamente (A), y dos fichas correspondientes de matriz microcryogel (B). (C, D) Imágenes microscópicas de la microcryogels individual de las fichas de la matriz de dos microcryogels. Barra de escala = 500 μm. Esta figura se ha modificado con la autorización de referencia14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Caracterización de 3D inyectable Microtissues. (A) fotografías de microcryogels cosechadas. (B) micrografía electrónica (SEM) imágenes de microcryogels mostrando interconectados y estructuras macroporoso. (C, D) Fluorescencia microscópica y 3D reconstruido imágenes confocales de microtissues cargado de hMSCs manchados por live/dead y rodamina phalloidin. (E) cuantificación de hMSCs semiautomáticas y proliferación en GMs con carga inicial de diferentes densidades. Fuerza de inyección en tiempo real (F) las curvas de medición para inyecciones triple de 1.000 GMs en 1 mL de solución de 15% (peso/vol) gelatina en tasa de inyección de 1 mL/min (1.000-1-15%). Live/dead (G) análisis de viabilidad de microtissues cargado de hMSCs inyección previa y posterior a la inyección de la célula. (H) proliferación de hMSCs cargado en después de la inyección GMs después de 1, 3 y 5 días de cultivo (n = 3). * p < 0.05, ANOVA unidireccional en comparación con el día 1. Los datos se presentan como media ± SEM. Esta figura se ha modificado con la autorización de referencia11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:mejorado salvamento y mayor angiogénesis en posteriores isquémico tratados con los Microtissues inyectables 3D. Fotografías representativas (A) de sham (n = 4), en blanco microcryogels (n = 4), libre de hMSCs (105) (n = 8), hMSCs (105)-carga microtissues (n = 8) y libre de hMSCs (106) (n = 4) en 0, 3, 7 y 28 días después del tratamiento. Imágenes de fluorescencia (B) 100 obtenidos s después de la inyección de ICG en el día 28. Esta figura se ha modificado con la autorización de referencia11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Matriz de Microtissue 3D para la detección de drogas de alto rendimiento. (A) fotografía de matriz microtissue 3D en formato 384-multi-well después de Asamblea y análisis de viabilidad de la célula de (B) resazurina en la matriz. (C) solicitud de propuestas-3T3 células dentro de microcryogel post siembra (barra de escala = 200 μm). (D) reconstrucción 3D de núcleos de coloración que muestran una distribución homogénea de las células en múltiples capas de microcryogel. (E) imagen de micrografía electrónica exploración de RFP-3T3 células separarse extensamente en macroporoso paredes en microcryogels (barra de escala = 20 μm). Pruebas de citotoxicidad de doxorrubicina (F) en las células HepG2 y () IMMLG-8439 en NCI-H460 células de matriz 3D microtissue mostrando mayor IC50 en comparación con sus contrapartes 2D. Datos se muestran como promedio ± pequeños esferoides SD (G) de las células HepG2 en microcryogel (barra de escala = 100 μm), con adherencia parcial (asteriscos en H) en la pared del microcryogel (barra de escala = 20 μm). (J) NCI-H460 células adheridas y extensión dentro de la microcryogel (barra de escala = 100 μm). NCI-H460 (K) las células que exhiben fibrmorfología oblastic (barra de escala = 20 μm). Esta figura se ha modificado con la autorización de referencia9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Regenerativos modelos de medicina y en vitro para la detección de drogas son dos aplicaciones importantes de tejido ingeniería5,6,7,8,9. Mientras que estas dos aplicaciones tienen necesidades muy diferentes, una tierra común entre ellos radica en la necesidad de una más biomiméticos condición de cultivo para mejorar las funciones de la célula19. Solamente con funciones mejoradas de la célula en la investigación podemos tratar enfermedades mejor20,21, y si las células cultivadas reflejan las respuestas de la droga con mayor precisión podemos acelerar droga descubrimiento6,7. Supervivencia de la célula después de engraftment en vivo es un requisito crucial para la medicina regenerativa, mientras que el rendimiento es importante para la detección de drogas para soportar miles de compuestos a la vez. Estos dos requisitos son específicos para sus aplicaciones respectivas, y rara vez una tecnología puede cumplir ambos requisitos. Así, únicamente hemos integrado tecnología de microfabricación con preparación de cryogel para producir microcryogels macroporoso, que podría ser cosechado off-chip como portadores cargados de células individuales para terapia regenerativa o retenidos en el chip para más Asamblea en conjunto para la detección de drogas de alto rendimiento. La microescala y la macroporosidad de estos microcryogels novela permiten automático y homogéneo de células de carga por absorción simple. Usando el nuevo microstencil fabricación de fichas de microcryogel arsenal, cientos y miles de cryogels de microescala con uniforme y reproducibles las características geométricas se pudieran fácilmente y eficientemente generar. El microcryogels podría preparado y almacenado por el vacío de empaquetado como un producto estándar, listo para su uso para facilitar la preparación de microtissues 3D en común laboratorios para las solicitudes posteriores. Usando esta técnica de fabricación, hemos sido capaces de cumplir con los puntos en común (condición de cultura 3D para mejor biomimética) y requisitos específicos para las diferentes dos aplicaciones (elasticidad para proteger las células durante la inyección para la medicina regenerativa y alto rendimiento en un formato de matriz para la detección de drogas).
La terapia celular es muy prometedor para la reparación de diversos tejidos dañados u órganos24. Sin embargo, la retención celular, supervivencia celular y reproducibilidad del tratamiento son todavía pobres debido a daño mecánico durante la inyección, alta salida a los tejidos circundantes y la isquemia y la inflamación en el ambiente en vivo dentro de la lesión los tejidos25. Algunos investigadores han utilizado agregados celulares preformados para mejorar la inyección de células. Sin embargo, requiere una gran cantidad de células para formar agregados de células, que conduce a alto costo, tamaño no uniforme e incontrolable números agregados26. Por otra parte, lesión mecánica y la muerte celular están todavía inevitables durante la inyección. Alternativamente, terapia celular asistida biomaterial ha sido desarrollada en que biomateriales sensibles (p. ej., termal o sensibles al pH del hidrogel) pueden ser mezcladas con células y gelificación en situ para realizar la célula retención27. Sin embargo, en situ reticulado biomateriales no permite el cebado de las células en vitro y resultado inmediata exposición de células a un microambiente isquémica e inflamatoria en el sitio de la lesión. Es urgente solucionar estos problemas para mejorar la eficacia terapéutica. Una ventaja de microcryogels fabricados mediante este protocolo es su inyectabilidad deseado debido a su tamaño miniaturizado y excepcional elasticidad, facilitando su aplicación en la entrega de la célula. La inyectabilidad de microcryogels permite la protección de la célula durante la entrega de la célula, por lo tanto podría ser constituidos en 3D microtissues inyectables después de cebado en vitro de las células en el microcryogel para mejorar ambos proteínas de matriz extracelular (ECM) deposición, así como las interacciones célula-célula. El 3D microtissues inyectables como resultado conjuntos de tejido-como microescala que representa una estrategia de entrega óptima para facilitar la protección celular, engraftment, supervivencia y por lo tanto, mejorar los efectos terapéuticos de última en el sitio de la lesión.
Además de efectos terapéuticos mejorados para la terapia celular, nuestros resultados también fueron indicativos del impacto complejo microambiente 3D en las respuestas celulares de drogas. Utilizando las condiciones de cultivo de biomimicking, es posible provocar en vitro celular droga las respuestas más representativas de en vivo las respuestas, por lo tanto acelerar la droga descubrimiento6,7, 28. Esferoides son popular elección de configuración de cultura celular 3D y se han desarrollado muchas técnicas para ayudar a los investigadores generan esferoides. Cultivo de tejido adhesivo de baja placas29 o placa de superficies que se modifican con huellas de nano8 también fueron utilizadas para obligar a las células a agregado por prevenir la adherencia de la célula-matriz. Mientras que estas técnicas son relativamente simples de usar, problemas tales como pérdida de esferoides durante el intercambio medio y otras operaciones así como la variabilidad de tamaño de los esferoides son problemas que obstaculizan la adopción a gran escala de tal tecnología6. Esferoides más homogéneas podrían formarse colgante gota30,31,32,33, sin embargo es laborioso si no usando especializan placas. Utilizando especializada múltiples bien placas de gota colgantes e integración con sistemas6,31para manejo de líquidos automática, podría realizarse cribado de alto rendimiento. El inconveniente más grande de la cultura del esferoide es la falta de ECM, que se ha identificado a desempeñan un papel vital en los tejidos fisiológicos y patológicos evolución34. Un estudio de modelo de cerebro reveló que esferoides cultivadas dentro de un andamio de ECM, en comparación con esferoides puros, tenían mayor resistencia a los medicamentos, mejora la acidosis debido a la mayor producción de lactato y mejora la angiogénesis con el aumento de expresión de relacionados factores de34. Otros estudios también han demostrado que la presencia de matriz podría proporcionar mechano-señalización necesaria para promover la EMT y soportes de recapitulación de las características del tumor como invasión y metástasis3,35,36 , 37.
Con el aumento de comprensión de la importancia de ECM en desarrollo patológico, no hay duda que el ECM incorporar métodos de cultivo 3D podría ayudar a imitar en vivo situaciones mejor6. Hidrogeles de materiales naturales o sintéticos se han aplicado para generar varios en vitro tumor 3D modelos para evaluación de quimioterapia debido a su flexibilidad y capacidad de control de propiedades biofísicas (tales como rigidez)38 , 39 , 40 , 41 , 42. mientras que los hidrogeles con propiedades biofísicas ajustables de hecho habían modelado importantes características biológicas de las células del tumor para facilitar la detección de drogas más exacto, varias desventajas de este método han impedido su uso generalizado de drogas proyección. Reticulación de polímeros en la presencia de las células es necesario encapsular células dentro de la matriz hidrogel, que potencialmente podría dañar las células. No sólo esto, hidrogeles de propiedades biofísicas diferentes presentan retos diferentes a las células encapsuladas dentro. En los hidrogeles suaves, alto contenido de agua podría apoyar el crecimiento de la célula pero estos hidrogeles se degradan rápidamente, dando soporte a corto plazo para el cultivo celular 3D. Por otro lado, más rígidos hidrogeles con cross-linking alta podrían frenar degradación pero contenido de agua baja no puede apoyar el crecimiento de la célula y crosslinker alta concentración induce generalmente alto cytotoxicitde43,y44. No sólo por lo tanto, preparar el cultivo de celular 3D con hidrogeles requiere mano de obra y no es compatible con la mayoría líquido de alto rendimiento sistemas de manejo y control de la temperatura de la solución precursora de hidrogel es importante atasco de puntas de dosificación finas podría resultar de gelificación de hidrogel en las puntas. Estas desventajas han llevado así a la búsqueda de alternativas ECM sustitutos, es decir, basado en el andamio ECM34.
Utilizando andamios preformados, las células podrían estar exentos del proceso de fabricación de biomaterial y por lo tanto brinda la posibilidad de más control sobre la fabricación de andamios, como condiciones más duras podrían utilizarse sin temor a dañar las células. Varias investigaciones han demostrado que las células tumorales cultivadas en andamios 3D muestran mayor resistencia a los medicamentos en comparación con las células cultivadas en 2D debido a malignidad creciente y mejorado celular-ECM interacción45,46, 47. tales observaciones son consistentes con los resultados aquí presentados. En nuestras obras más hemos demostrado la versatilidad de la matriz de microtissue 3D y sus ventajas sobre las otras técnicas mencionadas. En un reciente trabajo, fuimos capaces de mejorar la función hepática mediante la promoción del fenotipo epitelial de células HepaRG por cultivo de una variedad de microtissue 3D y tal matriz se aplicó a drogas hepatotoxicidad evaluación47. Debido a la uniformidad de los tamaños de poro en los andamios macroporosos 3D, hemos sido capaces de controlar el tamaño de esferoides de célula del hígado para caer dentro de 50-80 μm, independientemente de la densidad inicial de siembra de células. Esto proporciona una ventaja significativa sobre la formación libre de esferoides con tamaños no uniformes. No sólo esferoides crecen uniformemente dentro de cada andamio, también uniformemente se siembran las células entre pozos, dando el coeficiente de variación (CV) comparables con las células siembra en 2D (es decir, CV = 0.09 en 3D microtissue arsenal y CV = 0.05 en 2D placa comercial ; datos no mostrados). En otro trabajo, hemos demostrado que éramos capaces de formar microtumor hígado en microtissue 3D arsenal para recapitular tumor stromal interacciones para la detección de la terapia combinatoria reprogramado estroma48. Microtumors hígados fueron generados por la cultura de cooperación a largo plazo (5 días) de fibroblastos con células tumorales en alta densidad. Observamos las barreras hacia la difusión de la droga debido a la celda compacta y estructura de la ECM formada en el hígado microtumor, que de manera similar se observó en vivo32. Usando células cancerosas etiquetado luciferase y células estromales preparado mecánicamente, combinadas con la luminiscencia de luciferin como la lectura específica para las células de cáncer, detección de nuevos agentes terapéuticos o combinaciones contra tumor stromal de alto rendimiento interacción es posible.
A pesar de las ventajas únicas de nuestra técnica, un inconveniente de microcryogels actual es falta de transparencia, obstaculizando toda observación óptica de células en microcryogels. Otras mejoras para estos microcryogels incluye ajuste sus propiedades ópticas para mejorar la proyección de imagen de células en microcryogels para la observación. Además, importantes propiedades biofísicas tales como rigidez no han sido exploradas en nuestra técnica, que tendría que abordarse si queremos imitar mejor los tejidos fisiológicos y patológicos de las propiedades biofísicas diferentes.
Mientras que nuestra técnica permite la simple generación de microtissues 3D, deben tomarse algunas precauciones para experimentos exitosos. Cuando fabricación 3D microcryogels en microstencil chip de matriz, es importante asegurarse de que los microcryogels mantienen congeladas en el liofilizador. Por lo tanto, es esencial para pre-enfriar el liofilizador y transferir microcryogels del congelador de-20 ° C para el liofilizador rápidamente. La fusión de microcryogels antes de 1.llenar o durante 1.llenar hará que los poros y por lo tanto afectan la porosidad de microcryogels fabricados. Cuando cultivo microtissues 3D en el formato de la matriz, se requiere atención para asegurar que la adherencia entre las dos matrices es suficiente para evitar la contaminación cruzada entre pozos. También, mientras que miniaturizar cultivo celular tiene su ventaja para aumentar el rendimiento y reducir el consumo de reactivo, su inconveniente es que el volumen de la cultura no puede apoyar a largo plazo cultivo celular sin reposición de los medios de comunicación frecuente. No sólo por lo tanto, es fundamental para mantener la humedad del ambiente de cultivo para evitar la influencia sobre la viabilidad de las células debido a la evaporación de los medios de comunicación, desde sólo unos pocos microlitros de la suspensión celular o los medios de comunicación se añade. Evaporación también afectarán a la viabilidad de las células en los pocillos periféricos, por lo tanto, es vital para evitar el cultivo de células en estos pozos.
Sin embargo, nuestra técnica robusta proporciona una opción para generar microtissues 3D de una manera fácil de usar, que potencialmente podría hacer cultura 3D un método común de manipulación de células para la mayoría de los laboratorios, para acelerar la ciencia básica y aplicada avances.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (subvenciones: 81522022, 51461165302). Los autores desean reconocer a todos los miembros de laboratorio de Du de asistencia general.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | sigma | G7041 | All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated. |
| Glutaraldehyde | J&K | 902042 | Used as crosslinker in preparation of material. |
| Glass cover slip (24 x 50 mm) | CITOGLASS, China | 10212450C | To scrape prcursor solution onto microstencils array chips. |
| Sodium borohydride, NaBH4 | Beijing Chemical Works | 116-8 | To wash remaining glutaraldehyde away after gelation. |
| Vacuum jar | asperts, China | VC8130 | To preserve microgels under vacuum. |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets | Sunjin Electronics Co., Ltd, China | Ordinary PMMA sheets. | |
| Rayjet laser system | Rayjet, Australia | Rayjet 50 C30 | To engrave PMMA sheets to form wells. |
| Plasma Cleaner | Mycro Technologies, USA | PDC-32G | To make PMMA hyphophilic. |
| Lyophilizer | Boyikang, China | SC21CL | To lyophilize materials. |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Zhongkekeao, China | DA0065 | To dye microgels. |
| Doxorubicin hydrochloride | ENERGY CHEMICAL, China | A01E0801360010 | To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel. |
| Live/dead assay | Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) | CS01-10 | To distinguish alive and dead cells. |
| Cell Titer-Blue | Promega (Wisconsin, USA). | G8080 | To test cell viability. |
| Cell strainer | BD Biosciences, USA | 352360 | To collect microgels. |
| D-Luciferin | SYNCHEM (Germany) | s039 | To tack cells. |
| Scanning electron microscope | FEI, USA | Quanta 200 | To characterize microgel morphology. |
| Mechanical testing machine | Bose, USA | 3230 | To measure mechanical features. |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | ALADINI 1000 | To test injactabiliy. |
| Digital force gauge | HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China | H-50 | To test injactabiliy. |
| Ethylene oxide sterilization system | Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC | AN74i | To sterilize microgels with ethylene oxide gas. |
| Microplate reader | Molecular Devices,USA | M5 | To measure fluorescence intensity in micro-array. |
| Confocal microscope | Nikon, Japan | A1Rsi | To observe cell distribution in 3D. |
| Xenogen Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences, USA | IVIS | To track cell in animals. |
| Liquid work stataion | Apricot design,USA | S-pipette | To load medium or cell suspension high-throuputly. |
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