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Bioengineering

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/55982
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine,Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences,Tsinghua University

Summary

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

Abstract

Per aggiornare coltura cellulare 2D tradizionale a coltura cellulare 3D, abbiamo integrato microfabbricazione con tecnologia cryogelation per produrre macroporosa Microscala Criogel (microcryogels), che può essere caricato con una varietà di tipi di cellule per formare microtissues 3D. Qui, presentiamo il protocollo per fabbricare versatile microtissues 3D e loro applicazioni in terapia rigenerativa e lo screening di stupefacenti. Dimensione e forma-controllabile microcryogels può essere fabbricato in un chip di matrice, che può essere raccolto fuori del chip come singoli vettori cellulare-caricato per la terapia rigenerativa iniettabile o più ulteriormente essere assemblati su chip in matrici di microtessuti 3D per high-throughput screening di stupefacenti. A causa della natura elastica alta di questi Criogel su microscala, il microtissues 3D presentano ottima iniettabilità per terapia minimamente invasiva cellulare proteggendo le cellule dalla forza di taglio meccanico durante l’iniezione. In questo modo una maggiore sopravvivenza ed effetto terapeutico nel modello di ischemia dell’arto del mouse. Nel frattempo, montaggio di matrici di microtessuti 3D in un formato standard di 384-multi-bene facilita l’uso di comuni strutture di laboratorio e attrezzature, abilitazione high throughput screening su questa piattaforma di cultura cellulare 3D versatile di stupefacenti.

Introduction

Coltura cellulare tradizionale su superfici appiattite di (2D) bidimensionali, ad esempio una piastra di coltura o piastre multi-pozzetto, difficilmente può suscitare comportamenti delle cellule vicino ai loro Stati nativi. Accurata ricapitolazione dei microambienti cellulari nativi, che comprendono vari tipi di cellule, matrici extracellulari e fattori bioattivi solubile in tridimensionale (3D) architetture1,2,3 ,4, è essenziale per costruire biomimicking tessuti in vitro per applicazioni in medicina rigenerativa, ingegneria dei tessuti, biologia fondamentale ricerca e droga scoperta5,6,7 ,8,9.

Al posto di coltura cellulare 2D, coltura cellulare 3D è ampiamente usato per avanzare biomimetici micro-architettura e caratteristiche funzionali delle cellule coltivate in vitro. Un metodo di coltura popolare cellulare 3D è quello di cellule aggregate in sferoidi7,8,9,10. Sferoidi cellulare potrebbero essere iniettati a tessuti danneggiati con una maggiore ritenzione cellulare e la sopravvivenza rispetto ad iniezione di cellule disperse. Tuttavia, non uniforme sferoide dimensioni e inevitabile danno meccanico imposto sulle cellule con la forza di taglio fluido durante l’iniezione conducono al povero cella effetti terapeutici11,12,13. Allo stesso modo, l’intrinseca non-uniformità durante l’aggregazione di sferoidi ha reso loro traduzione al 3D basati su cellule high throughput screening di stupefacenti impegnativo10.

Un altro metodo per la coltura cellulare 3D è realizzato con l’assistenza dei biomateriali, che in genere incapsula le cellule in idrogel acquoso o scaffold porosi. Esso consente una maggiore flessibilità nella costruzione di architetture 3D. Per la terapia, cellule incapsulate in massa ponteggi vengono generalmente recapitate al corpo animale tramite impianto chirurgico, che è invasivo e traumatico, limitando quindi la traduzione ampia al capezzale. D’altra parte, idrogeli acquosi abilitare terapia minimamente invasiva iniettando le cellule sospese in soluzione di idrogel precursore nei corpi degli animali, permettendo la gelificazione in situ tramite termo-, reticolazione chimica o enzimatica11. Tuttavia, come le cellule vengono consegnate mentre i precursori di idrogel sono ancora in uno stato acquoso, essi sono anche esposti a cesoia meccanica durante l’iniezione. Non solo quindi, reticolazione chimica o enzimatica durante la gelificazione in situ di idrogel potrebbe anche imporre il danneggiamento delle cellule all’interno. Per lo screening di stupefacenti, colture cellulari di biomateriale-aiutato affrontano problemi con uniformità, la controllabilità e la velocità effettiva. Utilizzando idrogeli, cellule sono in genere coinvolti durante la gelificazione, da che il processo può colpire la funzione e la vitalità cellulare. Gelificazione durante la semina delle cellule ostacola anche l’utilizzo di maggior parte delle apparecchiature ad alta produttività, poiché potrebbe essere necessario essere tenuta su ghiaccio per evitare la gelificazione prima semina cellulare l’idrogel e l’idrogel potrebbe incepparsi punte di erogazione, che sono solitamente molto sottili per garantire la precisione per High throughput screening. Scaffold preformato potrebbe potenzialmente separare procedure di fabbricazione di biomateriale da coltura cellulare, tuttavia la maggior parte sono disponibili come materiali alla rinfusa con relativamente bassa velocità effettiva14prodotti basati sul patibolo.

Per superare alcune delle carenze degli attuali metodi di cultura 3D, abbiamo sviluppato una tecnologia di microfabbricazione-cryogelation integrato per fabbricare un chip di matrice standard e facile da usare microcryogel15. In questo protocollo, la gelatina è selezionata per esemplificare la tecnica di fabbricazione di microcryogel come è biocompatibile, biodegradabile e conveniente, e nessuna ulteriore modifica è necessaria per il collegamento delle cellule. Altri polimeri di fonti naturali o sintetici potrebbero essere utilizzati anche per la fabbricazione, a seconda dell’applicazione. Tramite questa tecnologia, possiamo fabbricare microcryogels miniaturizzati e altamente elastico con controllabile dimensioni, forma e disposizione. Quando caricato con una varietà di tipi cellulari, microtissues 3D potrebbe essere formata per varie applicazioni. Queste caratteristiche uniche permettono iniettabilità desiderata, protezione delle cellule e ritenzione sito diretta dopo iniezione in vivo per ottenere effetti terapeutici migliori. Non solo in questo modo il microcryogels potrebbe essere ulteriormente trattati per formare matrici di microtessuti 3D compatibili con comuni attrezzature di laboratorio e strumenti per realizzare la coltura delle cellule ad alta produttività per lo screening di stupefacenti versatile e altri test cellulari. Qui, ci faremo i dettagli il processo di fabbricazione di microcryogels e il suo post-trattamento come singoli microtissues 3D o 3D microtessuti matrici per due importanti applicazioni, terapia cellulare e lo screening di stupefacenti, rispettivamente10,15 .

Protocol

esperimenti sugli animali seguito rigoroso protocollo approvato dal comitato di etica animale il centro di analisi biomedica, Università di Tsinghua. Sotto approvazione del comitato etico, tessuto adiposo umano è stato ottenuto dal dipartimento di chirurgia plastica di Peking Union Hospital con consenso informato dai pazienti. 1. fabbricazione di 3D Microcryogels progettazione e fabbricazione di chip array microstencil uso un software commerciale a matric…

Representative Results

Fabbricazione e caratterizzazione di microcryogels per la formazione di microtessuti 3D. Secondo questo protocollo, microcryogels sono stati fabbricati a forma il 3D microtissues e microcryogels individuali o matrici di microcryogel e sono state applicate alla terapia rigenerativa e, rispettivamente di screening di stupefacenti (Figura 1). Microstencil chip array fabbricato da PMMA …

Discussion

Rigenerativi modelli medicina e in vitro per lo screening di stupefacenti sono due importanti applicazioni per tessuto ingegneria5,6,7,8,9. Mentre queste due applicazioni hanno esigenze molto diverse, un terreno comune tra di loro si trova nella necessità di un più biomimetici coltura condizione per migliorare la cellula funzioni19…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni: 81522022, 51461165302). Gli autori si desidera ringraziare tutti i membri del laboratorio di Du per l’assistenza necessaria.

Materials

Gelatin sigma G7041 All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde  J&K 902042 Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm) CITOGLASS, China 10212450C To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4 Beijing Chemical Works 116-8 To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar asperts, China VC8130 To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets  Sunjin Electronics Co., Ltd, China Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system Rayjet, Australia Rayjet 50 C30 To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner Mycro Technologies, USA PDC-32G To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer Boyikang, China SC21CL To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%) Zhongkekeao, China DA0065 To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride ENERGY CHEMICAL, China A01E0801360010 To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) CS01-10 To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue Promega (Wisconsin, USA). G8080 To test cell viability.
Cell strainer BD Biosciences, USA 352360 To collect microgels.
D-Luciferin SYNCHEM (Germany) s039 To tack cells.
Scanning electron microscope FEI, USA Quanta 200 To characterize microgel morphology.
 Mechanical testing machine Bose, USA 3230 To measure mechanical features.
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA ALADINI 1000 To test injactabiliy.
Digital force gauge HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China H-50  To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC AN74i To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader Molecular Devices,USA M5 To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope Nikon, Japan A1Rsi To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system Caliper Life Sciences, USA IVIS To track cell in animals.
Liquid work stataion Apricot design,USA S-pipette To load medium or cell suspension high-throuputly.
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Li, Y., Yan, X., Liu, W., Zhou, L., You, Z., Du, Y. 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening. J. Vis. Exp. (128), e55982, doi:10.3791/55982 (2017).
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