Summary

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

Published: October 04, 2017
doi:

Summary

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

Abstract

Per aggiornare coltura cellulare 2D tradizionale a coltura cellulare 3D, abbiamo integrato microfabbricazione con tecnologia cryogelation per produrre macroporosa Microscala Criogel (microcryogels), che può essere caricato con una varietà di tipi di cellule per formare microtissues 3D. Qui, presentiamo il protocollo per fabbricare versatile microtissues 3D e loro applicazioni in terapia rigenerativa e lo screening di stupefacenti. Dimensione e forma-controllabile microcryogels può essere fabbricato in un chip di matrice, che può essere raccolto fuori del chip come singoli vettori cellulare-caricato per la terapia rigenerativa iniettabile o più ulteriormente essere assemblati su chip in matrici di microtessuti 3D per high-throughput screening di stupefacenti. A causa della natura elastica alta di questi Criogel su microscala, il microtissues 3D presentano ottima iniettabilità per terapia minimamente invasiva cellulare proteggendo le cellule dalla forza di taglio meccanico durante l’iniezione. In questo modo una maggiore sopravvivenza ed effetto terapeutico nel modello di ischemia dell’arto del mouse. Nel frattempo, montaggio di matrici di microtessuti 3D in un formato standard di 384-multi-bene facilita l’uso di comuni strutture di laboratorio e attrezzature, abilitazione high throughput screening su questa piattaforma di cultura cellulare 3D versatile di stupefacenti.

Introduction

Coltura cellulare tradizionale su superfici appiattite di (2D) bidimensionali, ad esempio una piastra di coltura o piastre multi-pozzetto, difficilmente può suscitare comportamenti delle cellule vicino ai loro Stati nativi. Accurata ricapitolazione dei microambienti cellulari nativi, che comprendono vari tipi di cellule, matrici extracellulari e fattori bioattivi solubile in tridimensionale (3D) architetture1,2,3 ,4, è essenziale per costruire biomimicking tessuti in vitro per applicazioni in medicina rigenerativa, ingegneria dei tessuti, biologia fondamentale ricerca e droga scoperta5,6,7 ,8,9.

Al posto di coltura cellulare 2D, coltura cellulare 3D è ampiamente usato per avanzare biomimetici micro-architettura e caratteristiche funzionali delle cellule coltivate in vitro. Un metodo di coltura popolare cellulare 3D è quello di cellule aggregate in sferoidi7,8,9,10. Sferoidi cellulare potrebbero essere iniettati a tessuti danneggiati con una maggiore ritenzione cellulare e la sopravvivenza rispetto ad iniezione di cellule disperse. Tuttavia, non uniforme sferoide dimensioni e inevitabile danno meccanico imposto sulle cellule con la forza di taglio fluido durante l’iniezione conducono al povero cella effetti terapeutici11,12,13. Allo stesso modo, l’intrinseca non-uniformità durante l’aggregazione di sferoidi ha reso loro traduzione al 3D basati su cellule high throughput screening di stupefacenti impegnativo10.

Un altro metodo per la coltura cellulare 3D è realizzato con l’assistenza dei biomateriali, che in genere incapsula le cellule in idrogel acquoso o scaffold porosi. Esso consente una maggiore flessibilità nella costruzione di architetture 3D. Per la terapia, cellule incapsulate in massa ponteggi vengono generalmente recapitate al corpo animale tramite impianto chirurgico, che è invasivo e traumatico, limitando quindi la traduzione ampia al capezzale. D’altra parte, idrogeli acquosi abilitare terapia minimamente invasiva iniettando le cellule sospese in soluzione di idrogel precursore nei corpi degli animali, permettendo la gelificazione in situ tramite termo-, reticolazione chimica o enzimatica11. Tuttavia, come le cellule vengono consegnate mentre i precursori di idrogel sono ancora in uno stato acquoso, essi sono anche esposti a cesoia meccanica durante l’iniezione. Non solo quindi, reticolazione chimica o enzimatica durante la gelificazione in situ di idrogel potrebbe anche imporre il danneggiamento delle cellule all’interno. Per lo screening di stupefacenti, colture cellulari di biomateriale-aiutato affrontano problemi con uniformità, la controllabilità e la velocità effettiva. Utilizzando idrogeli, cellule sono in genere coinvolti durante la gelificazione, da che il processo può colpire la funzione e la vitalità cellulare. Gelificazione durante la semina delle cellule ostacola anche l’utilizzo di maggior parte delle apparecchiature ad alta produttività, poiché potrebbe essere necessario essere tenuta su ghiaccio per evitare la gelificazione prima semina cellulare l’idrogel e l’idrogel potrebbe incepparsi punte di erogazione, che sono solitamente molto sottili per garantire la precisione per High throughput screening. Scaffold preformato potrebbe potenzialmente separare procedure di fabbricazione di biomateriale da coltura cellulare, tuttavia la maggior parte sono disponibili come materiali alla rinfusa con relativamente bassa velocità effettiva14prodotti basati sul patibolo.

Per superare alcune delle carenze degli attuali metodi di cultura 3D, abbiamo sviluppato una tecnologia di microfabbricazione-cryogelation integrato per fabbricare un chip di matrice standard e facile da usare microcryogel15. In questo protocollo, la gelatina è selezionata per esemplificare la tecnica di fabbricazione di microcryogel come è biocompatibile, biodegradabile e conveniente, e nessuna ulteriore modifica è necessaria per il collegamento delle cellule. Altri polimeri di fonti naturali o sintetici potrebbero essere utilizzati anche per la fabbricazione, a seconda dell’applicazione. Tramite questa tecnologia, possiamo fabbricare microcryogels miniaturizzati e altamente elastico con controllabile dimensioni, forma e disposizione. Quando caricato con una varietà di tipi cellulari, microtissues 3D potrebbe essere formata per varie applicazioni. Queste caratteristiche uniche permettono iniettabilità desiderata, protezione delle cellule e ritenzione sito diretta dopo iniezione in vivo per ottenere effetti terapeutici migliori. Non solo in questo modo il microcryogels potrebbe essere ulteriormente trattati per formare matrici di microtessuti 3D compatibili con comuni attrezzature di laboratorio e strumenti per realizzare la coltura delle cellule ad alta produttività per lo screening di stupefacenti versatile e altri test cellulari. Qui, ci faremo i dettagli il processo di fabbricazione di microcryogels e il suo post-trattamento come singoli microtissues 3D o 3D microtessuti matrici per due importanti applicazioni, terapia cellulare e lo screening di stupefacenti, rispettivamente10,15 .

Protocol

esperimenti sugli animali seguito rigoroso protocollo approvato dal comitato di etica animale il centro di analisi biomedica, Università di Tsinghua. Sotto approvazione del comitato etico, tessuto adiposo umano è stato ottenuto dal dipartimento di chirurgia plastica di Peking Union Hospital con consenso informato dai pazienti. 1. fabbricazione di 3D Microcryogels progettazione e fabbricazione di chip array microstencil uso un software commerciale a matric…

Representative Results

Fabbricazione e caratterizzazione di microcryogels per la formazione di microtessuti 3D. Secondo questo protocollo, microcryogels sono stati fabbricati a forma il 3D microtissues e microcryogels individuali o matrici di microcryogel e sono state applicate alla terapia rigenerativa e, rispettivamente di screening di stupefacenti (Figura 1). Microstencil chip array fabbricato da PMMA …

Discussion

Rigenerativi modelli medicina e in vitro per lo screening di stupefacenti sono due importanti applicazioni per tessuto ingegneria5,6,7,8,9. Mentre queste due applicazioni hanno esigenze molto diverse, un terreno comune tra di loro si trova nella necessità di un più biomimetici coltura condizione per migliorare la cellula funzioni19…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni: 81522022, 51461165302). Gli autori si desidera ringraziare tutti i membri del laboratorio di Du per l’assistenza necessaria.

Materials

Gelatin sigma G7041 All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde  J&K 902042 Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm) CITOGLASS, China 10212450C To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4 Beijing Chemical Works 116-8 To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar asperts, China VC8130 To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets  Sunjin Electronics Co., Ltd, China Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system Rayjet, Australia Rayjet 50 C30 To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner Mycro Technologies, USA PDC-32G To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer Boyikang, China SC21CL To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%) Zhongkekeao, China DA0065 To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride ENERGY CHEMICAL, China A01E0801360010 To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) CS01-10 To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue Promega (Wisconsin, USA). G8080 To test cell viability.
Cell strainer BD Biosciences, USA 352360 To collect microgels.
D-Luciferin SYNCHEM (Germany) s039 To tack cells.
Scanning electron microscope FEI, USA Quanta 200 To characterize microgel morphology.
 Mechanical testing machine Bose, USA 3230 To measure mechanical features.
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA ALADINI 1000 To test injactabiliy.
Digital force gauge HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China H-50  To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC AN74i To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader Molecular Devices,USA M5 To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope Nikon, Japan A1Rsi To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system Caliper Life Sciences, USA IVIS To track cell in animals.
Liquid work stataion Apricot design,USA S-pipette To load medium or cell suspension high-throuputly.

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179 (2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141 (2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581 (2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056 (2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Play Video

Cite This Article
Li, Y., Yan, X., Liu, W., Zhou, L., You, Z., Du, Y. 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening. J. Vis. Exp. (128), e55982, doi:10.3791/55982 (2017).

View Video