Summary
Att få hög kvalitet genomiskt DNA från tumörvävnad är ett viktigt första steg för att analysera genetiska förändringar med nästa generations sekvensering. I denna artikel presenterar vi en enkel och snabb metod för att berika tumörceller och få intakta DNA från touch avtryck cytologi exemplar.
Abstract
Det är viktigt att fastställa mutationsstatus i cancer innan administration och behandling av specifika molekylära riktade läkemedel för cancerpatienter. I den kliniska inställningen används formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) vävnader allmänt för genetisk testning. FFPE DNA är dock generellt skadad och splittrad under processen fixering med formalin. Därför är FFPE DNA ibland inte tillräckligt för genetisk testning på grund av låg kvalitet och kvantitet av DNA. Här presenterar vi en metod för beröring avtryck cytologi (TIC) erhålla genomiskt DNA från cancerceller, som kan observeras under ett mikroskop. Cell morfologi och cancer cell nummer kan utvärderas med hjälp av TIC exemplar. Dessutom kan utvinning av genomisk DNA från TIC prover slutföras inom två dagar. Den totala mängden och kvaliteten på TIC DNA erhålls med denna metod var högre än för FFPE DNA. Denna snabba och enkla metod tillåter forskare att få hög kvalitet DNA för genetisk testning (t.ex., nästa generations sekvensering analys, digital PCR och kvantitativa realtid PCR) och att förkorta handläggningstiden för rapportering av resultat.
Introduction
Nästa generation sekvenseringsteknologi har gett forskare betydande framsteg i att analysera genominformationen i genetiska variationer, Mendelian sjukdomar, ärftliga anlag och cancer 1,2,3 . Den Cancer Genome Atlas (TCGA) och International Cancer Genome Consortium (ICGC) har drivit identifiering av genetiska förändringar i flera typer av vanliga cancerformer4. Hundratals viktiga bröstcancergener driver framgångsrikt har identifierats, och några av dessa molekyler är blir måltavla för drogen utveckling1,5,6.
I den kliniska inställningen används FFPE exemplar ofta för patologisk diagnos och molekylär testning för olika sjukdomar, inklusive cancer. Men under processen fixering med formalin DNA-protein eller DNA-DNA cross-linking uppstår och DNA-fragmentering induceras. Således, FFPE DNA-prover är inte alltid lämpliga för genetisk analys på grund av låg kvalitet och kvantitet av DNA7,8,9. Dessutom tar det flera dagar att förbereda FFPE exemplar och teknisk skicklighet är nödvändigt att noggrant förbereda avsnitten. Därför är det önskvärt att utveckla en enkel och snabb metod för att erhålla hög kvalitet intakt DNA.
Cytologi är en alternativ metod för patologisk diagnos. Cytologiska provberedning är en enklare, mindre dyra, och snabbare metod jämfört med FFPE förberedelse10. TIC tekniken har utförts på sentinel lymfkörtlar och marginella vävnader från bröstcancerpatienter för intraoperativ snabb diagnos för vissa år11,12. Det finns dock några rapporter som har undersökt om hög kvalitet genomiskt DNA kan extraheras från TIC exemplar och används för efterföljande genetisk analys. Cytologiska prover är vanligaste fläckade Papanicolaou (Pap) eller Giemsa färgning och tidigare rapporterade vi att mängden och kvaliteten av DNA extraheras från TIC exemplar (särskilt Giemsa-färgade prover) är överlägsna produktproverna FFPE vävnaderna13. Jämfört med Pap färgning, har Giemsa färgning en fördel i att kräva mindre färgning förfaranden. I Pap färgning, efter proverna har varit fixeras och färgas, måste de vara monterad med montering medium (t.ex., Malinol) för att skilja prov innehållet, till exempel tumörceller, normala celler och inflammatoriska celler i Mikroskop. Om Pap preparatet bereds utan det montering steget, är det nästan omöjligt att iaktta cellerna i Mikroskop eftersom preparatet torkas. I jämförelse, Giemsa färgning kan observeras i torkat tillstånd, därför montering steget är inte nödvändigt för snabb cellulära utvärdering. För lokalt är Giemsa färgning mer lämplig eftersom det kräver torra exemplar.
I detta betänkande, vi införa en enkel och snabb metod för att förbereda TIC exemplar med Giemsa färgning och visar att TIC är en bättre källa för DNA jämfört med FFPE exemplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. TIC förberedelse för snabb mikroskopisk bedömning använda normala glas glider
- Utföra TIC preparatet så snart som möjligt efter klinisk patologisk vävnad material finns. Om TIC exemplar inte kan omedelbart förberedas, hålla vävnad material täckt med koksaltlösning fuktad steril gasbinda och förvara i kylskåpet för att förhindra uttorkning av vävnader.
- Förbereda 5 mm3 vävnadsmaterial som solida tumörer (t.ex., levern, lungorna och bröstvävnad) kliniskt erhålls genom kirurgi eller endoskopi.
- Försiktigt torka vävnaden med steril gasbinda-belagda med fysiologisk koksaltlösning och ta bort blod, om vävnadsytan har en hel del blod.
- För mikroskopiska preparat såsom biopsi material, Behåll provet fuktad med steril gasbinda indränkt i fysiologisk koksaltlösning.
- Klippa och trimma den normala vävnaden med en trimning kniv och utsätta ytan av tumören lesionen, om tumören massorna inte är synligt grovt.
- Tryck tumören ytan av de opererande proverna med en vanlig glasskiva flera gånger med handskar på händerna. Visuellt bekräfta berört området är över 80% av den normala glasskiva.
- Tryck den normala glasskiva mot en polyeten polyetennaftalat (PEN) membran bild lätt och gnugga försiktigt 2 - 3 gånger med handskar på händerna. Visuellt bekräfta cellerna överförs från den normala glasskiva till penna membran bild.
- Lufttorka både glas och penna membran diabilder för 5 min i rumstemperatur.
- Färga den normala glasskiva för direkta Cytologisk undersökning. Doppa glasskivor med fixativ lösning för 5 s och sedan fläcken med Giemsa färgning lösning för 15 s.
- Bedöma och skärm tumör innehåll och cellularitet i normala glas bilden helt med ett mikroskop för snabb bedömning. Utvärdera tumörceller som grundas på flera kriterier. nukleära utvidgningen, onormal karyotyp, riklig kromatin, ojämlik fördelning av celler, förhållandet mellan nukleära komponent/cytoplasmiska komponent, Cellstorlek och cell polaritet.
2. beredning av den penna membran diafilm för genetisk testning
- Om provet visar tumören cellularitet över 60% av snabb mikroskopisk bedömning (steg 1,8), skär tumör-berört filmen penna membran bilder för DNA-extraktion med en kniv och handskar händer. Överföra klippa filmen till en steril mikrocentrifug rör med en pincette och handskar på händerna.
- Om den tumör cellularitet bestämdes som låg (mindre än 60% av tumören innehållet) snabb mikroskopisk bedömning (steg 1,8), använder laser fånga lokalt och erhålla tumörprover.
- Utföra Giemsa färgning för att bedöma tumörcellerna med hjälp av standardprotokoll.
- Klipp filmen av PEM membran bilden av lämplig laser fånga lokalt.
- Överföra klippa filmen till en steril mikrocentrifug rör med en pincette och handskar på händerna.
- Lagra film-innehållande mikrocentrifug röret vid 4 ° C tills DNA-extraktion (protokollet kan pausas här).
3. DNA-extraktion
- Utföra DNA-extraktion från vävnadsproverna TIC eller FFPE med ett FFPE DNA extraktion kit enligt tillverkarens anvisningar med mindre modifieringar. En motsvarande kit finns för FFPE DNA extraktion steg.
- Tillsätt 180 µL av vävnad lyseringsbuffert (pH = 8,3) till film-innehållande mikrocentrifug röret med en manuell 200-µL pipett. Tillsätt 20 µL av proteinas K med en manuell 20-µL pipetten och mix av vortexa med en vortex mixer med maximal hastighet (ca 2500 rpm) för 5 s.
- Inkubera proverna vid 56 ° C över natten med en luft-inkubator.
- Inkubera FFPE och TIC proverna vid 90 ° C i en värme block för 1 h och 10 min, respektive. Kort snurra ner mikrocentrifug röret vid 1500 x g i 5 s vid rumstemperatur med en mini centrifug.
- Tillsätt 200 µL lyseringsbuffert med en 200-µL pipett och blanda grundligt av vortexa med maximal hastighet för 5 s.
- Tillsätt 200 µL etanol (96-100%) med en 200-µL pipett och blanda av vortexa med maximal hastighet för 5 s. kort snurra ner mikrocentrifug röret vid 1500 x g i 5 s vid rumstemperatur med en mini centrifug.
- Noggrant överföra hela lysate till kolumnen spinn med en 1000-µL pipetten och centrifugera vid 6000 x g för 1 min vid 25 ° C.
- Placera den spin kolumnen i en ren 2-mL collection tube med handskar på händerna och kasserar samling röret som innehåller genomströmmande i en plast förfogande låda.
- Tillsätt 500 µL tvättbuffert i kolumnen spinn med en 1000-µL pipetten och centrifugera vid 6000 x g för 1 min vid 25 ° C.
- Placera den spin kolumnen i en ren 2-mL collection tube med handskar på händerna och kasserar samling röret som innehåller genomströmmande i en plast förfogande låda.
- Tillsätt 500 µL tvättbuffert i kolumnen spinn med en 1000-µL pipetten och centrifugera vid 6000 x g för 1 min vid 25 ° C.
- Kassera samling röret som innehåller genomströmmande i en plast förfogande låda. Placera kolumnen spin i en ren 1,5 mL mikrocentrifug rör med handskar på händerna och centrifugera 20 000 x g under 3 minuter vid 25 ° C torka membranet.
- Placera den spin kolumnen i en DNA-låg bindande tub med handskar på händerna.
- Tillsätt 40-50 µL av eluering buffert till mitten av membranet med en 100-µL pipett.
- Inkubera vid rumstemperatur i 5 min och centrifugera vid 20 000 x g för 1 min vid 25 ° C.
- Lagra de DNA-proverna vid-20 ° C tills vidare (protokollet kan pausas här).
4. uppskattning av DNA kvalitet av kvantitativa realtid PCR
- Förbereda huvudmixen i ett sterilt mikrocentrifug rör med en pipett, enligt följande: 10 µL 2 x realtids PCR Master Mix, 1 µL 20 x RNase P Primer-Probe Mix (kopiestorlek: 87 bp), och 8 µL sterilt nuclease-gratis vatten.
- Förbereda den andra master mix i en steril mikrocentrifug rör enligt följande: 10 µL 2 x realtids PCR Master Mix, 1 µL 20 x RNase P Primer-Probe Mix (kopiestorlek: 268 bp), och 8 µL sterilt nuclease-gratis vatten.
- Utföra seriespädningar av mänsklig kontroll genomiskt DNA (medföljer i satsen) 4 gånger för en femgradig standardkurva och bestämma den absoluta DNA koncentrationer13.
- Tillsätt 19 µL av de två förberedda master blandar (bereddes i steg 4.1 och 4.2) i separata brunnar av en optisk 96 brunnar reaktion platta med 20-µL pipett.
- Tillsätt 1 µL av FFPE DNA eller TIC DNA till separata brunnar innehållande reaktion mixen med 2-µL pipett. Tillsätt 1 µL nuclease-fritt vatten i en separat brunn innehållande reaktion mixen för ingen mall kontroll.
- Icke-häftande sida av en optisk självhäftande film och dra av den skyddande uppbackning från mitten av filmen. Försiktigt dra applikatorn över filmen och försegla filmen över plattan med 96 brunnar.
- Blanda försiktigt den plattan med 96 brunnar med en plattan med 96 brunnar mixer för 10 s vid rumstemperatur vid 2.000 rpm. Centrifugera plattan kort på 1 000 x g i 3 min i rumstemperatur.
- Slå på realtids PCR-instrumentet och infoga plattan med 96 brunnar. Kör de PCR-reaktioner med följande protokoll: 95 ° C under 20 s, följt av 45 cykler av 95 ° C för 1 s och 60 ° C för 20 s. användning ”standardkurvan” och ”snabb läge”.
- Bedöma DNA-fragmentering med förhållandet av DNA (relativ kvantifiering; RQ) erhålls för lång ospädd (268 bp) till kort ospädd (87 bp). RQ är medelvärdet av långa amplikon/the medelvärdet av kort amplikon13.
5. beredning av nästa generations sekvensering biblioteket
- Förbereda sekvensering biblioteket för nästa generations sekvensering enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbereda multiplex PCR huvudmixen i ett sterilt mikrocentrifug rör per prov enligt följande: 4 µL av 5 x Multiplex PCR-reaktion-lösning, 4 µL av 5 x primer pool, ≤6 µL TIC eller FFPE DNA (1-100 ng), och tillsätt nuclease-fritt vatten upp till 20 µL.
- Lägga till multiplex PCR huvudmixen en PCR-röret och blanda försiktigt genom att trycka på röret.
- Kort snurra ner mikrocentrifug röret vid 1500 x g i 5 s vid rumstemperatur med en mini centrifug.
- Kör de PCR-reaktioner med följande protokoll: 99 ° C i 2 min, följt av 20 cykler av 99 ° C för 15 s och 60 ° C under 4 min och innehav steg 10 ° C. Kort snurra ner PCR-röret med en mini Centrifugera vid 1500 x g i 5 s vid rumstemperatur.
Obs: Bestämma antalet cykler baserat på antalet primer-par. - Öppna locket på PCR-röret och tillsätt 2 µL restriktionsenzym med 2-µL pipett. Stäng locket till PCR-röret och blanda försiktigt genom att trycka på PCR-röret. Kort snurra ner PCR-röret med en mini Centrifugera vid 1500 x g i 5 s vid rumstemperatur.
- Kör de PCR-reaktioner med följande protokoll: 50 ° C i 10 min, 55 ° C i 10 min, 60 ° C i 20 min, och innehav steg 10 ° C. Kort snurra ner PCR-röret med en mini Centrifugera vid 1500 x g i 5 s vid rumstemperatur.
- Lägg till adapter ligering huvudmixen in till varje brunn innehållande de smält PCR-amplikoner med en pipett som följer: 4 µL adapter ligering lösning, 0,5 µL av streckkod, 0,5 µL av adapter, 2 µL nuclease-gratis vatten och 2 µL av DNA-ligase. Stäng locket till PCR-röret och blanda försiktigt genom att trycka på. Kort snurra ner PCR-röret med en mini Centrifugera vid 1500 x g i 5 s vid rumstemperatur.
- Kör de PCR-reaktioner med följande protokoll: 22 ° C i 30 min, 68 ° C i 5 min, 72 ° C i 5 minuter och innehav steg 10 ° C.
- Rena sekvensering biblioteket med magnetiska pärlor enligt tillverkarens anvisningar.
- Över lösningen adapter-sammanskrivna bibliotek i 1,5 mL DNA låg-bindande röret. Tillsätt 45 µL av magnetiska pärlor i DNA låg-bindande röret för 1st rening. Blanda försiktigt genom att trycka på röret och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Placera DNA-låg bindande röret i en magnetisk rack och inkubera i 2 min i rumstemperatur tills lösningen är klar. Noggrant avlägsna supernatanten med 200-µL pipett utan att störa magnetiska pärlor.
- Tillsätt 150 µL av nylagade 70% etanol med en 200-µL pipett och sedan flytta den tube sida till sidan av magneten att tvätta pärlorna. Noggrant kasta bort vätskefasen utan att störa magnetiska pärlor.
- Upprepa steg 5.11 för en andra tvätt.
- Kort snurra ner röret med mini Centrifugera vid 1500 x g i 5 s vid rumstemperatur. Placera DNA låg-bindande röret i en magnetisk rack och noggrant kasserar etanol droppar med pipett 10-µL.
- Tillsätt 50 µL av låg TE i DNA låg-bindande röret som innehåller magnetiska pärlor pelleten för att skingra pärlorna. Inkubera i 2 min i rumstemperatur.
- Placera DNA låg-bindande röret i en magnetisk rack och odla i rumstemperatur i 2 min tills lösningen är klar.
- Överför den 50 μl av supernatanten till nya DNA låg-bindande röret och tillsätt 75 µL av magnetiska pärlor med en 100-µL pipett för 2nd rening. Blanda försiktigt genom att trycka på röret och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Placera DNA låg-bindande röret i en magnetisk rack och inkubera i 2 min i rumstemperatur tills lösningen är klar. Noggrant avlägsna supernatanten med 200-µL pipett utan att störa magnetiska pärlor.
- Tillsätt 150 µL av nylagade 70% etanol med en 200-µL pipett och sedan flytta den tube sida till sidan av magneten att tvätta pärlorna. Noggrant kasta bort vätskefasen utan att störa magnetiska pärlor.
- Upprepa steg 5,18 för en andra tvätt.
- Kort snurra ner röret med en mini Centrifugera vid 1500 x g i 5 s vid rumstemperatur. Placera DNA låg-bindande röret i en magnetisk rack och noggrant kasserar etanol droppar med pipett 10-µL.
- Tillsätt 50 µL av låga TE i DNA låg-bindande röret som innehåller magnetiska pärlor pelleten för att skingra pärlorna. Inkubera i 2 min i rumstemperatur.
- Placera DNA låg-bindande röret i en magnetisk rack och odla i rumstemperatur i 2 min tills lösningen är klar.
- Över den 45 µL av supernatanten innehållande renat bibliotek i nya DNA låg-bindande röret med en 100-µL pipett.
6. kvantifiera bibliotek koncentrationen av kvantitativa realtid PCR
- Bestämma koncentrationen av varje bibliotek enligt tillverkarens anvisningar13.
- Bered en 20-fold utspädning enligt följande: blanda 2 µL av renat bibliotek och 38 µL nuclease-fritt vatten på DNA låg-bindande tub med en 2-µL och 100-µL pipett.
- Lagra outspädd biblioteken vid-20 ° C tills steg 7,3.
- Bered en 200-fold utspädning enligt följande: blanda 5 µL 20-fold utspädd renad biblioteket (bereddes i steg 6.1) och 45 µL nuclease-fritt vatten i ett rör med DNA i låg-bindande.
- Bered en 2,000-fold utspädning enligt följande: blanda 5 µL 200-fold utspädd renad biblioteket (bereddes i steg 6,2) och 45 µL nuclease-fritt vatten i ett rör med DNA i låg-bindande.
- Förbereda reaktion huvudmixen enligt följande: blanda 10 µL 2 x master mix lösning och 1 µL 20 x primer-probe analyslösningen i sterila mikrocentrifug rör med en pipett, sedan blanda genom att trycka på röret. Tillsätt 11 µL av reaktion huvudmixen i brunnar på en optisk 96 brunnar reaktion.
- Tillsätt 9 µL av 2,000-fold utspädda biblioteket, 9 µL av varje standard kontroll eller 9 µL nuclease-fritt vatten till varje brunn med en 10-µL pipett.
- Icke-häftande sida av optiska självhäftande film och dra av den skyddande uppbackning från mitten av filmen.
- Försiktigt dra applikatorn över filmen och försegla filmen över plattan med 96 brunnar.
- Blanda försiktigt den plattan med 96 brunnar med en plattan med 96 brunnar mixer för 10 s vid rumstemperatur.
- Centrifugera plattan kort på 1 000 x g i 3 min i rumstemperatur.
- Slå på realtids PCR-instrumentet och infoga plattan med 96 brunnar. Kör de PCR-reaktioner med följande protokoll: 50 ° C i 2 min, 95 ° C under 20 s, följt av 40 cykler av 95 ° C för 1 s och 60 ° C för 20 s. användning ”standardkurvan” och ”snabb läge”.
- Beräkna koncentrationen outspädd bibliotek genom att multiplicera koncentration bestäms med qPCR av 2,000.
7. nästa generations sekvensering
- Planera körningen villkoret och anger parametern kör inom programvaran.
- Klicka på [Plan fliken] och [mall], och välj Kör anslutningsmetod.
- Välj program och teknik typ och klicka på [Nästa].
- Välj instrument, prov förberedelse kit (tillval), biblioteket kit typ, mall kit, sekvensering kit, basera kalibreringsläge, chip typ, styra sekvensen (tillval) och streckkod set och klicka på [Nästa].
- Plugins och klicka på [Nästa].
- Projektet och klicka på [Nästa].
- Välj standard referens och BED filer i den berörda regionen.
- Ange namnet prov, markera streckkoden och klicka på [planera Run].
- Utföra mall förberedelse och chip lastning i automatiserade instrument enligt tillverkarens anvisningar. Tina reagens patronen i rumstemperatur i 45 min innan användning.
- Späd det outspädd biblioteket med nuclease-fritt vatten enligt bibliotek koncentration som beräknades i steg 6,8 och göra 20 pM bibliotek.
- Förbereda en poolad bibliotek för sekvensering och store på is.
- Tillsätt 25 µL av poolade biblioteket med 100 µL pipett till botten av provet röret. Använda sammanslagna biblioteket inom 48 h.
- Slå på och öppna luckan till det automatiska instrumentet.
- Placera sekvensering chip, chip adapter, berikning patron, tip patron, PCR-plattan, PCR ram sigill, återhämtning tube, lösning patron och reagens patron till lämplig position av automatiserade instrument.
- Tryck på [Ställ in kör] och [steg för steg] på skärmen.
- Stäng luckan och tryck på [Start check] på skärmen.
- Scan processen efter däck, tryck på [Nästa] på skärmen.
- Kontrollera skärminnehållet (kit typ, chip, chip ID, prov-ID, planer), ställa in tiden och tryck på [OK] på skärmen.
- Efter avslutad chip lastning:
- Tryck på [Nästa] på skärmen och öppna luckan.
- Lossas sekvensering chipet från chip adapter med handskar på händerna.
- Placera chipet i behållaren chip, rap med parafilm och förvaras vid 4 ° C tills sekvensering reaktionen.
- Bort anrikning patron, PCR-plattan, PCR ram sigill, återhämtning tube, lösning patron och reagens patron från lämplig position av automatiserade instrument med handskar på händerna.
- Överföra en tom-tip patron till avfall tip position av automatiserade instrument med handskar på händerna.
- Tryck på [Nästa] och Stäng locket.
- Tryck på [Start] och rengör det automatisera instrumentet av ultravioletta strålar för 4 min.
- Lös en natriumklorit tablett i 1 000 mL av ultrarent vatten och filtrera lösningen med en 0,22 µm filter flöde filterenhet.
- Slå på instrumentet sekvensering.
- Tryck på [Clean] och [Nästa] på skärmen på instrumentet sekvensering.
- Ren instrumentet sekvensering med 250 mL filter-steriliseras natriumklorit lösning och därefter 250 mL av ultrarent vatten.
- Tryck [initiera] och välj den lämpliga sekvensering kit på skärmen.
- Installera en grå avlastare på lämplig plats med handskar på händerna.
- Initiera instrumentet sekvensering med tvättlösningen (medföljer i satsen), pH justering lösningen (innehållande 350 µL av 100 mM natriumhydroxid) och pH standardlösningen (medföljer i satsen).
- Tillsätt 20 µL av dATP, dGTP, dCTP och dTTP nukleotider (medföljer i satsen) i 50 mL rör (medföljer i satsen) med 100-µL pipett.
- Installera en grå avlastare på lämplig plats med handskar på händerna.
- Ladda 50 mL tub och skruv på instrumentet sekvensering.
- Tryck på [Nästa] på skärmen för att starta det steget-initiering som tar ca 25 min.
- När du har slutfört steget initiering:
- Tryck [kör] på skärmen och välj lämpligt bibliotek förberedelse instrumentet.
- Skanna tvådimensionell streckkod av chip.
- Infoga sekvensering chipet på lämplig position.
- Stäng luckan till chip klämman och instrument.
- Tryck [Chip check], [Next], och [OK] på skärmen för att starta den sekvensering kör.
- Efter sekvensering reaktionen, överföra data och utföra data-analysera pipeline på sekvensering server13,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar hela processen från förbereder TIC prover för DNA-extraktion. Proceduren tar särskilt, bara två dagar att få genomiskt DNA från TIC prover. Vi utvärderat några effekter av tumör lagring före bild bearbetningen. Vi hittade att tumörceller fästes in i glas bilden när vävnadsprover berördes omedelbart in i bilden, och när vävnader hölls i saltlösning fuktade steril-gasbinda för 1 h (figur 2). Men när vävnader förvarades i rumstemperatur, var tumörcellerna inte väl kopplad till bilden. Förberedda bilder kan lagras vid 4 ° C i tre månader. Det är därför viktigt att inte låta exemplaren torka.
Vi undersökte nyttan av vår metod och jämföra det med exemplar som förvärvats med FFPE. TIC och FFPE prover var beredda från 14 tumör prover och vi bekräftade att tumören innehållet och renhet kan bedömas från TIC exemplaren. Efter att vi utfört Giemsa färgning, kunde antalet tumörceller och tumör morfologi bedömas av mikroskopi. Vi kunde således att rutinmässigt utvärdera tumörcellerna och därefter utföra en kvalitetskontroll för DNA.
DNA kvantitet och kvalitet uppskattades av kvantitativa realtid PCR-13,14,15. Vi har konstaterat de absoluta DNA kvantiteterna och RQ värdet, som är en indikator på nivån nedbrytning av genomisk DNA. Resultaten visade att en högre DNA avkastning uppnås med hjälp av TIC exemplaren jämfört med FFPE exemplaren (tabell 1). Dessutom RQ värdena av TIC DNA var betydligt högre jämfört med FFPE DNA (figur 3, p = 2,3 x 10-8, tvåsidiga Students t -test). Vi bedömde också RQ värdena av TIC och FFPE DNA extraheras från olika tumörtyper och fann att TIC DNA var högre i kvalitet jämfört med FFPE DNA (figur 3). Dessa resultat visade att TIC DNA var mindre fragmenterat än FFPE DNA.
Vi bedömt nästa om TIC DNA kunde användas för nästa generations sekvensering analys. FFPE och TIC DNA utarbetades från Primär kolorektal cancer och metastaserad levercancer som erhållits från en patient (figur 4A). PCR-amplifiering och bibliotek förberedelse genomfördes med hjälp av Cancer Hotspot panelen och därefter riktade sekvensering utfördes. Som ett resultat, identifierades APC Q1367 * i både FFPE och TIC DNA extraheras från plats 1 (tabell 2). Dessutom APC S1356 *, KRAS G12D och TP53 M237I upptäcktes i båda FFPE och TIC DNA extraheras från plats 2, 3 och 4 (tabell 2). Dessa resultat föreslog att de identiska somatiska mutationerna identifierades i Parade FFPE och TIC DNA prover beredd från samma tumör plats (figur 4B och tabell 2). Bland annat upptäcktes de samma somatiska mutationerna mellan Primär kolorektal cancer (plats 2, inte plats 1) och två metastaserad levercancer prover, vilket tyder på att tumören kloner från plats 2 metastasera till levern (figur 4B och tabell 2). Dessa rön tyder tillsammans att TIC DNA är hög kvalitet och är lämplig för ett brett utbud av genetisk testning inklusive nästa generations sekvensering.
Figur 1. Schematisk för att erhålla DNA från en TIC provberedning. Tumörvävnad är berört bild glaset att förbereda TIC provet. Efter bedömning av tumör morfologi och innehållet i Mikroskop, kan tumören DNA extraheras och används för genetisk testning. Genom att använda TIC, tumören DNA kan erhållas från kliniska patologiska prov inom två dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Beredning av TIC prover. Resected tumör prover var omedelbart rörde på en vanlig glasskiva (till vänster) höll i saltlösning fuktade steril-gasbinda för 1 h (mitten), och förvaras i rumstemperatur i 1 h (höger). Prov #1 var Hepatocellulär cancer och prov #2 var bröstcancer. Mikroskopiska bilder fångades med en digitalkamera som monteras på ett mikroskop. Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. DNA kvalitet Kontrollera beräknade av kvantitativ realtids PCR analys. TIC och FFPE DNA utvanns från 14 tumörvävnad från kolorektal (n = 8), mage (n = 4), och metastaserad levercancer (n = 2). Jämförelse av relativ kvantifiering poängen mellan TIC-Giemsa och FFPE-han prover. RQ värdena för TIC DNA var betydligt högre än för FFPE DNA. Statistisk analys mellan de två grupperna utfördes och p-värdena beräknades av oparade tvåsidiga Students t -test med hjälp av Excel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Nästa generations sekvensering analysdata med TIC och FFPE DNA. (A) Macroscopic och mikroskopiska bilder. Representativa bilder av TIC-Giemsa och FFPE-han färgning från kolorektal cancer (plats 1 och 2) och metastaserad kolorektalcancer lever prover (plats 3 och 4). Skalstapeln i makroskopiska bilder: 1 cm, skalstapeln i mikroskopiska bilder: 100 µm. (B) värmekarta visar fördelningen av somatiska mutationer för varje tumör webbplats (n = 8). Identiska mutationer upptäcktes bland Parade TIC och FFPE DNA prover. Värden av alleliska fraktioner indikeras i examen färgskala från 1% (ljusrosa) till 100% (rosa). Grå kolumner visade ingen identifierad mutation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| TIC-Giemsa (n = 14) | FFPE-HE (n = 14) | |||||||||
| Totala DNA (ng) | Totala DNA (ng) | |||||||||
| Prov | Tumören webbplats | Kort | Lång | RQ | Kort | Lång | RQ | |||
| Plats1 | Kolon | 1495 | 1247 | 0,83 | 939 | 349 | 0,37 | |||
| Plats2 | Kolon | 991 | 1057 | 1,07 | 556 | 204 | 0,37 | |||
| Webbplats3 | Lever | 467 | 511 | 1,09 | 130 | 39 | 0,3 | |||
| Webbplats4 | Lever | 2172 | 2115 | 0,97 | 488 | 127 | 0,26 | |||
| Site5 | Kolon | 749 | 598 | 0,8 | 529 | 205 | 0,39 | |||
| Site6 | Mage | 330 | 286 | 0,86 | 211 | 98 | 0,46 | |||
| Site7 | Mage | 636 | 499 | 0,78 | 154 | 84 | 0,55 | |||
| Webbplats8 | Mage | 27 | 27 | 1,01 | 135 | 81 | 0,6 | |||
| Webbplats9 | Kolon | 1986 | 1611 | 0,81 | 476 | 163 | 0,34 | |||
| Site10 | Kolon | 280 | 218 | 0,78 | 209 | 83 | 0,39 | |||
| Site11 | Kolon | 1546 | 575 | 0,37 | 366 | 159 | 0,43 | |||
| Site12 | Mage | 1501 | 1200 | 0,8 | 274 | 132 | 0,48 | |||
| Site13 | Kolon | 1556 | 1404 | 0,9 | 326 | 179 | 0,55 | |||
| Site14 | Kolon | 1565 | 1210 | 0,77 | 680 | 295 | 0,43 | |||
| Mean±SD | 1093±682 | 897±600 | 0.85±0.18 | 391±253 | 157±86 | 0.42±0.10 | ||||
Tabell 1. DNA kvalitetsdata. Parade TIC (n = 14) och FFPE exemplar (n = 14) utarbetades från kolon, lever och mage cancerformer. TIC prover var fläckade Giemsa och FFPE prover var färgas med hematoxylin och eosin (han). DNA-prover var utdraget och kvantifieras enligt kvantitativ realtids-PCR med två primer par förstärkande RNaseP locus (lång amplikon (268 bp) och kort amplikon (87 bp)). RQ-värdena beräknades enligt följande: medelvärdet av långa amplikon uppdelad Gemensamståndpunkt medelvärdet kort Restriktionsenzymanalys av kopian. SD, standardavvikelse; RQ, relativ kvantifiering
| Prov namn | Läge | Beredning | Gen symbol | Mutation | Ställning | Referens | Variant | Kodning | Täckning | Alleliska bråkdel | |
| Primär kolorektal cancer | Plats 1 | FFPE | APC | Q1367 * | chr5:112175390 | C | T | c.4099C > T | 1999 | 45% | |
| Primär kolorektal cancer | Plats 1 | TIC | APC | Q1367 * | chr5:112175390 | C | T | c.4099C > T | 1011 | 72% | |
| Primär kolorektal cancer | Plats 2 | FFPE | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1968 | 77% | |
| Primär kolorektal cancer | Plats 2 | FFPE | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1993 | 52% | |
| Primär kolorektal cancer | Plats 2 | FFPE | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1991 | 73% | |
| Primär kolorektal cancer | Plats 2 | TIC | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1967 | 89% | |
| Primär kolorektal cancer | Plats 2 | TIC | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1994 | 56% | |
| Primär kolorektal cancer | Plats 2 | TIC | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1995 | 86% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 3 | FFPE | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1974 | 92% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 3 | FFPE | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1995 | 62% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 3 | FFPE | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1296 | 91% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 3 | TIC | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1964 | 97% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 3 | TIC | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1993 | 64% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 3 | TIC | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1998 | 95% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 4 | FFPE | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1965 | 93% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 4 | FFPE | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1992 | 60% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 4 | FFPE | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1993 | 92% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 4 | TIC | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1960 | 94% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 4 | TIC | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1992 | 62% | |
| Metastaserad levercancer | Plats 4 | TIC | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1995 | 95% | |
Tabell 2. Jämförelse av mutationer i Parade FFPE och TIC DNA upptäcks av riktade sekvensering analys. Parade TIC och FFPE prover var beredda från 2 Primär kolorektal cancer (plats 1 och 2) och 2 metastaserande lever cancer (plats 3 och 4). Riktade sekvensering utfördes med dessa DNA-prover och somatiska mutationer har identifierats. Mutation profiler var identiska mellan Parade TIC och FFPE DNA prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie presenterade vi en alternativ metod för att erhålla tumör DNA från kliniska patologiska prover med TIC. TIC förberedelserna är mycket enkel och kräver mindre tid jämfört med FFPE metoder, utan krav på särskilda instrument10. Alla procedurer från TIC förberedelse till DNA-extraktion kan slutföras inom två dagar (figur 1). Denna metod förkortar därmed handläggningstid för att utföra genetisk testning. Särskilt, ger detta en betydande fördel i förkorta antalet dagar som krävs för molekylär analys. Detta kort handläggningstid tillåter oss att erbjuda en lämplig behandling omedelbart för progressiva cancerpatienter som kräver molekylärt riktade droger. Denna metod ger således fördelar för analyser av genetiska förändringar i tumörer och administrering av molekylärt riktade läkemedel för cancerbehandling.
Det finns några viktiga punkter för att lyckas med att använda TIC DNA för genetisk analys. Tumörvävnad kan vara nekrotisk på grund behandling såsom kemoterapi eller andra behandlingar. Försiktighet behövs således, förbereda TIC exemplar för att undvika provtagning från nekrotiska sektioner i tumören så mycket som möjligt. Vidare, inledande mikroskopisk bedömning är mycket viktigt för efterföljande förfaranden. Dessutom krävs förhindrar torkning av tumörvävnad för framgångsrika TIC provberedning. Om tumör vävnader är torkade, resulterar detta i färre bifogade celler på en glasskiva. Det blir också svårt att iaktta tumör cellularitet och morfologi eftersom torkning leder till degeneration av tumörvävnad.
Det finns några potentiella fördelar med att använda TIC DNA. Vi kan kontrollera den tumör cellularitet först under den första bedömningen med mikroskopi. Om normala celler, såsom lymfocyter och stromaceller, var rikligt i vävnadsproverna, skulle förorening av dessa normala celler förhindra möjligheten att upptäcka somatiska mutationer i tumörcellerna. Snabb mikroskopisk bedömning av proverna kan hjälpa utvärderingen av den tumör cellularitet och uppskattning av huruvida tillräckliga tumör DNA-prover erhölls från TIC proverna innan DNA-extraktion. För det andra, våra resultat visade att TIC DNA är både hög kvalitet och kvantitet. FFPE DNA har använts för nästa generations sekvensering analys inklusive riktade sekvensering, exome sekvensering och hela genomet sekvensering16,17,18,19,20. Archival FFPE DNA är också rutinmässigt används för genetisk analys21,22, men FFPE DNA kan fragmenteras under formalin fixering. Detta kan resultera i problem i PCR-amplifiering eller DNA-extraktion, orsakar en brist på sekvens täckning, enhetlighet på målregionerna, och öka risken för sekvens fel23,24. Däremot är TIC DNA inte fragmenterade, vilket kan bero på alkohol fixering som har mindre inflytande på nukleinsyra. Som TIC DNA inte är fragmenterad som FFPE DNA, kommer att dessa prover vara mer lämplig för nästa generations sekvensering analys, realtids-PCR och digital PCR. Faktiskt, vi tidigare visade att TIC DNA från tumör prov kan användas i nästa generations sekvensering analys, en metod som kallas ”TIC-seq”, och resultaten kunde just fånga tumör somatiska mutationer13. För det tredje, denna teknik är tillämpliga för ett brett utbud av material. I det aktuella betänkandet använde vi kirurgiska prover. Utöver kirurgisk vävnader, metastaserad lymfkörtel, kan bronkial eller endoskopisk biopsi användas för att förbereda TIC DNA.
Avslutningsvis presenterar vi en enkel och snabb metod för att förbereda hög kvalitet tumör DNA använder TIC prover. Denna metod kommer att expandera nya möjligheter inom genetisk analys och bidra till att främja precision medicine i den kliniska inställningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla den medicinska personalen och servicepersonalen sjukhuset och patienterna för samtycker till att delta. Vi tackar Gabrielle White Wolf, PhD, från Edanz-gruppen (www.edanzediting.com/ac) för att redigera ett utkast till detta betänkande. Denna studie stöddes av ett bidrag för Genome Research Project från Yamanashi prefektur (Y.H. och M.O.) och ett bidrag från The YASUDA medicinska stiftelsen (Y.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al.
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S.
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
