Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Enkel og rask metode å få høy kvalitet svulst DNA fra klinisk-patologisk prøver bruker Touch forlaget cytologi

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56943
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,3
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

Summary

Få høykvalitets genomisk DNA fra tumor vev er et viktig første skritt for å analysere genetiske endringer med neste generasjons sekvensering. I denne artikkelen presenterer vi en enkel og rask metode for å berike kreftceller og få intakt DNA fra touch forlaget cytologi prøver.

Abstract

Det er viktig å bestemme mutational status i kreft før administrasjon og behandling av bestemte molekylær målrettet narkotika for kreftpasienter. I klinisk setting, er formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vev mye brukt for genetisk testing. FFPE DNA er imidlertid vanligvis skadet og fragmentert under fiksering prosessen med formalin. FFPE DNA er derfor noen ganger ikke tilstrekkelig for genetisk testing på grunn av lav kvalitet og mengde DNA. Her presenterer vi en metode for preg forlaget cytologi (TIC) få genomisk DNA fra kreftceller, som kan observeres under et mikroskop. Cellen morfologi og kreft cellen tallene kan evalueres ved hjelp TIC prøver. Videre kan utvinning av genomisk DNA fra TIC prøver fullføres innen to dager. Den totale mengden og kvaliteten på TIC DNA Hentet ved hjelp av denne metoden var høyere enn FFPE DNA. Denne raske og enkle metoden tillater forskere å få høy kvalitet DNA for genetisk testing (f.eks, neste generasjons sekvensering analyse, digital PCR og kvantitative sanntid PCR) og forkorte tiden det rapporterer resultater.

Introduction

Neste generasjons sekvensering teknologi har gitt forskerne betydelige fremskritt i å analysere genomet informasjon i genetisk variasjoner, Mendelian sykdom, arvelig predisposisjon og kreft 1,2,3 . Kreft genomet Atlas (TCGA) og International kreft genomet Consortium (ICGC) har forfulgt identifikasjon av genetiske endringer i flere typer vanlig kreft4. Hundrevis av viktige kreft driveren gener har blitt identifisert, og noen av disse molekylene er målrettet i narkotika utvikling1,5,6.

I klinisk setting brukes FFPE eksemplarer vanligvis for patologisk diagnose og molekylære testing for ulike sykdommer, inkludert kreft. Men under fiksering prosessen med formalin, DNA-protein eller DNA-DNA cross-linking oppstår og DNA fragmentering er indusert. Dermed er FFPE DNA-prøver ikke alltid egnet for genetisk analyse på grunn av lav kvalitet og mengde DNA7,8,9. Dessuten tar det flere dager å forberede FFPE eksemplarer, og tekniske ferdigheter er nødvendig for å forberede nøyaktig delene. Derfor er det ønskelig å utvikle en enkel og rask metode for å få høy kvalitet intakt DNA.

Cytologi er en alternativ metode for patologisk diagnose. Fargemaskin eksempel forberedelse er en enklere, mindre kostbare og rask tilnærming sammenlignet med FFPE forberedelser10. TIC teknikken er utført på sentinel lymfeknuter og marginale vev fra brystkreftpasienter for intraoperativ rask diagnose for noen år11,12. Det er imidlertid noen rapporter som har undersøkt om høy kvalitet genomisk DNA kan hentes fra TIC prøver og brukes for påfølgende genetisk analyse. Fargemaskin prøver er vanligvis farget med Papanicolaou (Pap) eller Giemsa flekker, og vi har tidligere rapportert at mengden og kvaliteten av DNA utvunnet fra TIC prøver (spesielt Giemsa-farget eksempler) er overlegen prøver innhentet fra FFPE vev13. Sammenlignet med Pap flekker, har Giemsa flekker en fordel til krever mindre flekker prosedyrer. I Pap flekker, når prøvene er fast og farget, må de være montert med montering medium (f.eksMalinol) for å skille eksempel innholdet, for eksempel kreftceller og normale celler inflammatoriske celler under et mikroskop. Hvis Pap prøven er utarbeidet uten montering trinn, er det nesten umulig å observere cellene under et mikroskop fordi prøven er tørket. Til sammenligning Giemsa flekker kan observeres i tørket staten, derfor montering trinnet er ikke nødvendig for rask mobilnettet evaluering. For microdissection er Giemsa flekker mer egnet fordi det krever tørr prøver.

I denne rapporten, vi introdusere en enkel og rask metode for å forberede TIC prøver med Giemsa flekker og vise at TIC er en bedre kilde til DNA sammenlignet med FFPE eksemplarer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TIC forberedelse for rask mikroskopiske vurdering med vanlig Glass lysbilder

  1. Utføre TIC utarbeidelse så snart som mulig etter klinisk patologisk vev materialer er tilgjengelige. Hvis TIC prøver ikke umiddelbart være forberedt, holde vev materialet dekket med saltvann fuktet sterilt gasbind og lagre i kjøleskapet for å forhindre tørking av vev.
  2. Forberede 5 mm3 vev materiale som solide tumorer (f.eks, lever, lunge og bryst vev) klinisk oppnås ved kirurgi eller endoskopi.
    1. Forsiktig tørke vevet med sterilt gasbind belagt med fysiologiske saltvann og fjerne blod, hvis vevet overflaten har mye blod.
    2. For mikroskopiske prøver som biopsi materiale, holde prøven fuktet sterilt gasbind dynket i fysiologiske saline.
  3. Kuttet og trim normalt vev med trimming kniv og utsette overflaten av svulst lesjonen, hvis svulst massene ikke vises grovt.
  4. Trykk svulst overflaten av de resected på en normal objektglass flere ganger med hansker hender. Visuelt bekrefte rørt området er over 80% av den normale objektglass.
  5. Lett trykk av normal objektglass mot et polyetylen naphthalate (PENN) membran lysbilde og gni forsiktig 2 - 3 ganger med hansker hender. Visuelt bekrefte cellene overføres fra den normale objektglass til pennen membran lysbildet.
  6. Air-Dry både glass og PENN membran lysbilder for 5 min ved romtemperatur.
  7. Flekk av normal objektglass for direkte fargemaskin eksamen. Dypp glass lysbilder med etappe, den stabiliserende løsning for 5 s, og deretter flekk med Giemsa flekk løsning for 15 s.
  8. Vurdere og skjermen svulst innholdet og cellularity på den normale objektglass helt med et mikroskop for rask vurdering. Evaluere kreftceller basert på flere kriterier; kjernefysisk utvidelse, unormal karyotype, rikelig chromatin, skjeve fordelingen av celler, forholdet mellom kjernefysiske komponent/cytoplasmatiske komponent, Cellestørrelse og celle polaritet.

2. utarbeidelse av pennen membran lysbildefilm for genetisk Testing

  1. Hvis prøven viser svulst cellularity over 60% av rask mikroskopiske vurdering (trinn 1.8), kuttet svulst-rørt filmen PENN membran lysbildene for DNA utvinning med en kniv og hansker hender. Overføre kuttet filmen til et sterilt microcentrifuge rør med en pincette og hansker hender.
  2. Hvis svulst cellularity ble bestemt som lav (mindre enn 60% av svulst innholdet) av rask mikroskopiske vurdering (trinn 1.8), bruke laser fange microdissection og få svulst prøver.
    1. Utføre Giemsa flekker for å vurdere kreftceller ved hjelp av standardprotokoller.
    2. Klippe filmen PEM membran lysbildet ved passende laser fange microdissection.
    3. Overføre kuttet filmen til et sterilt microcentrifuge rør med en pincette og hansker hender.
    4. Lagre filmen inneholder microcentrifuge røret på 4 ° C til DNA utvinning (protokollen kan pauses her).

3. DNA utvinning

  1. Utføre DNA utvinning fra vevsprøver TIC eller FFPE med en FFPE DNA utvinning utstyr i henhold til produsentens instruksjoner med mindre endringer. En tilsvarende kit er tilgjengelig for FFPE DNA utvinning trinn.
  2. Legge til 180 µL av vev lyseringsbuffer (pH = 8.3) til filmen inneholder microcentrifuge røret med en manuell 200-µL pipette. Legge til 20 µL av proteinasen K med en manuell 20-µL pipette og blanding av vortexing med en vortex mikser med maksimal hastighet (omtrent 2500 rpm) for 5 s.
  3. Inkuber prøvene på 56 ° C over natten med en luft inkubator.
  4. Inkuber FFPE og TIC prøvene ved 90 ° C i en varme blokk for 1 h og 10 min, henholdsvis. Kort Nedspinning microcentrifuge røret på 1500 x g for 5 s ved romtemperatur med en mini sentrifuge.
  5. Legge til 200 µL av lyseringsbuffer til prøven med en 200-µL pipette og bland grundig ved vortexing med maksimal hastighet 5 s.
  6. Legg 200 µL av etanol (96-100%) med en 200-µL pipette og bland godt av vortexing med maksimal hastighet 5 s. kort Nedspinning microcentrifuge røret på 1500 x g for 5 s ved romtemperatur med en mini sentrifuge.
  7. Nøye overføre hele lysate kolonnen spin med 1000-µL pipette og sentrifuge 6000 x g for 1 min på 25 ° C.
  8. Plasser kolonnen spinn i en ren 2-mL samling rør med hansker hender, og forkaste samling rør som inneholder gjennomflytsenhet i en plast disposisjon boks.
  9. Legge til 500 µL av vaskebuffer kolonnen spin med 1000-µL pipette og sentrifuge 6000 x g for 1 min på 25 ° C.
  10. Plasser kolonnen spinn i en ren 2-mL samling rør med hansker hender, og forkaste samling rør som inneholder gjennomflytsenhet i en plast disposisjon boks.
  11. Legge til 500 µL av vaskebuffer kolonnen spin med 1000-µL pipette og sentrifuge 6000 x g for 1 min på 25 ° C.
  12. Kast samling rør som inneholder gjennomflytsenhet i en plast disposisjon boks. Plasser kolonnen spinn i et rent 1.5-mL microcentrifuge rør med hansker hender og sentrifuge 20.000 x g for 3 min ved 25 ° C tørke membranen.
  13. Plass kolonnen spinn i et DNA-lav bindende rør med hansker hender.
    1. Legge til 40-50 µL av elueringsbufferen i midten av membranen med en 100-µL pipette.
    2. Inkuber ved romtemperatur for 5 min og sentrifuge 20.000 x g for 1 min på 25 ° C.
    3. Lagre DNA-prøver på 20 ° C til neste trinn (protokollen kan pauses her).

4. beregning av DNA kvalitet av kvantitative sanntid PCR

  1. Klargjør master blandingen i et sterilt microcentrifuge rør med en pipette, som følger: 10 µL av 2 x sanntid PCR Master Mix, 1 µL av 20 x RNase P Primer-sonden Mix (amplicon størrelse: 87 bp), og 8 µL av sterile nuclease-fritt vann.
  2. Klargjør andre master blandingen i en steril microcentrifuge tube som følger: 10 µL av 2 x sanntid PCR Master Mix, 1 µL av 20 x RNase P Primer-sonden Mix (amplicon størrelse: 268 bp), og 8 µL av sterile nuclease-fritt vann.
  3. Utføre føljetong fortynninger av menneskelig kontroll genomisk DNA (inkludert i pakken) 4 ganger for en fem-punkts standardkurve og bestemmer den absolutte DNA konsentrasjoner13.
  4. Legge til 19 µL av to forberedt master mikser (forberedt i trinn 4.1 og 4.2) i separate brønner av en optisk 96-brønns reaksjon plate med en 20-µL pipette.
  5. Legg 1 µL FFPE DNA eller TIC DNA å skille brønner som inneholder reaksjonen blanding med en 2-µL pipette. Legg 1 µL av nuclease-fritt vann inn i en egen brønn som inneholder reaksjonen blanding for ingen mal kontrollen.
  6. Hold ikke selvklebende siden av en optisk selvklebende folien og skrelle tilbake den beskyttende støtte fra midten av filmen. Forsiktig dra applikatoren over filmen og forsegle filmen over 96-brønns platen.
  7. Bland forsiktig 96-brønns platen med en 96-brønns plate blandebatteri for 10 s ved romtemperatur 2000 RPM. Sentrifuge platen kort på 1000 x g for 3 min ved romtemperatur.
  8. Slå på sanntid PCR apparatet og sett inn 96-brønns platen. Kjøre PCR reaksjonene ved hjelp av følgende protokollen: 95 ° C for 20 s, etterfulgt av 45 sykluser av 95 ° C for 1 s og 60 ° C for 20 s. Bruk "standard kurve" og "rask modus."
  9. Vurdere DNA fragmentering med forholdet av DNA (relativ kvantifisering; RQ) innhentet for den lange amplicon (268 bp) til den korte amplicon (87 bp). RQ er middelverdien av lange amplicon/the middelverdien av kort amplicon13.

5. forberedelser for neste generasjons sekvensering biblioteket

  1. Forberede sekvensering biblioteket neste generasjons sekvensering i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Klargjør multiplex PCR master blandingen i et sterilt microcentrifuge rør per prøve som følger: 4 µL av 5 x Multiplex PCR reaksjon løsning, 4 µL av 5 x primer bassenget, ≤6 µL TIC eller FFPE DNA (1-100 ng), og legge til nuclease-fritt vann opp til 20 µL.
    1. Legge multiplex PCR master blandingen til en PCR rør og bland forsiktig ved å trykke på røret.
    2. Kort Nedspinning microcentrifuge røret på 1500 x g for 5 s ved romtemperatur med en mini sentrifuge.
  3. Kjøre PCR reaksjonene ved hjelp av følgende protokollen: 99 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 20 sykluser av 99 ° C for 15 s og 60 ° C for 4 min og holde trinn 10 ° C. Kort Nedspinning PCR røret med en mini sentrifuge 1500 x g for 5 s ved romtemperatur.
    Merk: Bestemme antall sykluser basert på antall primer par.
  4. Åpne lokket på PCR røret, og legge 2 µL av begrensning enzymet med en 2-µL pipette. Lukk lokket på PCR rør og bland forsiktig ved å tappe PCR røret. Kort Nedspinning PCR røret med en mini sentrifuge 1500 x g for 5 s ved romtemperatur.
  5. Kjøre PCR reaksjonene ved hjelp av følgende protokollen: 50 ° C i 10 min, 55 ° C i 10 min, 60 ° C for 20 min, og holde steg 10 ° C. Kort Nedspinning PCR røret med en mini sentrifuge 1500 x g for 5 s ved romtemperatur.
  6. Legge til adapter ligation master blandingen inn i hver også inneholder den fordøyde PCR-amplicons med en pipette som følger: 4 µL av adapter ligation løsning, 0,5 µL strekkode, 0,5 µL av adapter, 2 µL nuclease uten vann og 2 µL av DNA ligase. Lukk lokket på PCR rør og bland forsiktig ved å trykke. Kort Nedspinning PCR røret med en mini sentrifuge 1500 x g for 5 s ved romtemperatur.
  7. Kjøre PCR reaksjonene ved hjelp av følgende protokollen: 22 ° C i 30 min, 68 ° C i 5 min, 72 ° C i 5 minutter, og holde steg 10 ° C.
  8. Rense sekvensering biblioteket med magnetiske perler i henhold til produsentens instruksjoner.
  9. Overføre adapter-samskrevet biblioteket løsningen til 1.5-mL DNA lav-bindende røret. Legge til 45 µL av magnetiske perler inn i DNA lav-bindende røret for 1st rensing. Bland forsiktig ved å tappe røret og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
  10. Sett DNA-lav bindende røret i en magnetisk rack, så ruge i 2 minutter ved romtemperatur før løsningen er klart. Forsiktig kaste nedbryting med en 200-µL pipette uten å forstyrre de magnetiske perlene.
  11. Legge til 150 µL av nylagde 70% etanol med en 200-µL pipette, og deretter gå i rør til siden av magneten å vaske perler. Forsiktig kaste nedbryting uten å forstyrre de magnetiske perlene.
  12. Gjenta trinn 5.11 for en andre vask.
  13. Kort spinne ned røret med mini sentrifuge 1500 x g for 5 s ved romtemperatur. Sett DNA lav-bindende røret i en magnetisk rack, og forsiktig kast etanol dråper med en 10-µL pipette.
  14. Legge til 50 µL av lav TE inn i DNA lav-bindende røret med magnetiske perler pellet for å spre perler. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
  15. Sett DNA lav-bindende røret i en magnetisk rack og ruge ved romtemperatur i 2 minutter til løsningen er klart.
  16. Overføre den 50 µL av nedbryting inn i den nye DNA lav-bindende rør og legge 75 µL av magnetiske perler med en 100-µL pipette for 2nd rensing. Bland forsiktig ved å tappe røret og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
  17. Sett DNA lav-bindende røret i en magnetisk rack, så ruge i 2 minutter ved romtemperatur før løsningen er klart. Forsiktig kaste nedbryting med en 200-µL pipette uten å forstyrre de magnetiske perlene.
  18. Legge til 150 µL av nylagde 70% etanol med en 200-µL pipette, og deretter gå i rør til siden av magneten å vaske perler. Forsiktig kaste nedbryting uten å forstyrre de magnetiske perlene.
  19. Gjenta trinn 5.18 for en andre vask.
  20. Kort spinne ned røret med en mini sentrifuge 1500 x g for 5 s ved romtemperatur. Sett DNA lav-bindende røret i en magnetisk rack, og forsiktig kast etanol dråper med en 10-µL pipette.
  21. Legge til 50 µL av lav TE i DNA lav-bindende røret med magnetiske perler pellet for å spre perler. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
  22. Sett DNA lav-bindende røret i en magnetisk rack og ruge ved romtemperatur i 2 minutter til løsningen er klart.
  23. Overføre den 45 µL av nedbryting som inneholder renset biblioteket i den nye DNA lav-bindende rør med en 100 µL pipette.

6. kvantifisere biblioteket konsentrasjonen av kvantitative sanntid PCR

  1. Bestemme konsentrasjonen av hvert bibliotek i henhold til produsentens instruksjoner13.
    1. Utarbeide en 20-fold fortynning løsning som følger: Bland 2 µL av renset bibliotek og 38 µL nuclease uten vann i en DNA lav-bindende rør med en 2-µL og 100 µL pipette.
    2. Lagre ufortynnet bibliotekene på 20 ° C til trinn 7.3.
  2. Utarbeide en 200-fold fortynning løsning som følger: blande 5 µL av 20-fold utvannet renset biblioteket (forberedt i trinn 6.1) og 45 µL nuclease uten vann i en DNA lav-bindende rør.
  3. Utarbeide en 2,000-fold fortynning løsning som følger: blande 5 µL av 200-fold utvannet renset biblioteket (forberedt i trinn 6.2) og 45 µL nuclease uten vann i en DNA lav-bindende rør.
  4. Forberede reaksjon master mix slik: Bland 10 µL av 2 x master mix løsningen og 1 µL av 20 x primer-sonden analysen løsning i sterilt microcentrifuge rør med en pipette, og bland ved å trykke på røret. Legge til 11 µL av reaksjonen master blanding i brønnene av en optisk 96-brønns reaksjon.
  5. Legg 9 µL av 2,000-fold utvannet biblioteket, 9 µL av hver standard kontroll eller 9 µL av nuclease-fritt vann hver brønn med en 10-µL pipette.
  6. Hold ikke selvklebende siden av optisk selvklebende folien og skrelle tilbake den beskyttende støtte fra midten av filmen.
    1. Forsiktig dra applikatoren over filmen og forsegle filmen over 96-brønns platen.
    2. Bland forsiktig 96-brønns platen med en 96-brønns plate blandebatteri for 10 s ved romtemperatur.
    3. Sentrifuge platen kort på 1000 x g for 3 min ved romtemperatur.
  7. Slå på sanntid PCR apparatet og sett inn 96-brønns platen. Kjøre PCR reaksjonene ved hjelp av følgende protokollen: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C for 20 s, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C for 1 s og 60 ° C for 20 s. Bruk "standard kurve" og "rask modus."
  8. Beregn konsentrasjonen ufortynnet bibliotek ved å multiplisere konsentrasjonen fastsatt med qPCR av 2000.

7. neste generasjons sekvensering

  1. Planlegge kjøre tilstanden og angi parameteren kjøre i programvaren.
    1. Klikk [Plan kategorien] og [mal], og velg den kjøre metoden.
    2. Velg programmet og teknikk type, og klikk [neste].
    3. Velg instrument, prøve forberedelse kit (valgfritt), kit bibliotektypen, mal kit, sekvensering kit, basere kalibrering modus, chip type, kontrollere sekvens (valgfritt), og strekkode og klikk [neste].
    4. Velg plugins og klikk [neste].
    5. Velg prosjektet og klikk [neste].
    6. Velg standard referanse og BED filer av målrettede området.
    7. Skriv inn prøven, Velg strekkoden, og klikk [Plan kjøre].
  2. Utføre mal forberedelse og chip lasting i et automatisert instrument i henhold til produsentens instruksjoner. Tine påreagenskassetten ved romtemperatur for 45 min. før bruk.
  3. Fortynne ufortynnet biblioteket med nuclease-gratis vann etter biblioteket konsentrasjonen beregnet i trinn 6.8 og gjøre 20 pM biblioteker.
    1. Forberede et gruppert bibliotek sekvenser og lagre på is.
    2. Legg til 25 µL av grupperte biblioteket med en 100 µL pipette bunnen av prøven røret. Bruke grupperte biblioteket innen 48 timer.
  4. Slå og åpne dekselet på automatiserte instrumentet.
    1. Plass sekvensering chip, chip adapter, berikelse patron, tips patron, PCR plate, PCR ramme segl, utvinning rør, løsning kassetten og påreagenskassetten til riktig plassering av automatiserte instrumentet.
    2. Trykk [Angi går] og [steg for steg] på skjermen.
    3. Lukk dekslet og trykk [Start sjekk] på skjermen.
    4. Etter dekk scan prosess, berøringsskjerm [neste] på skjermen.
    5. Sjekk skjermen innholdet (kit type, chip type chip ID, prøve-ID, planer), angi klokkeslettet og trykk [OK] på skjermen.
  5. Etter endt chip lasting:
    1. Trykk [neste] på skjermen og åpne dekselet.
    2. Losset sekvensering chip fra chip adapter med hansker hender.
    3. Plassere brikken i beholderen chip rap med parafilm og butikk på 4 ° C til sekvensering reaksjonen.
    4. Fjernet berikelse patron, PCR plate, PCR ramme segl, utvinning rør, løsning kassetten og påreagenskassetten fra riktig plassering av automatiserte instrumentet med hansker hender.
    5. Overføre en tom-tip kassett til avfall tips plasseringen av automatiserte instrumentet med hansker hender.
    6. Trykk [neste] og lukk dekselet.
    7. Trykk [Start] og rengjør automatisert maskinen av ultrafiolette stråler for 4 min.
  6. Oppløse en natrium kloritt tablett i 1000 mL ultrapure vann og filteret løsning med en 0.22-µm filter flyt filter enhet.
    1. Slå på sekvensering instrumentet.
    2. Trykk [Clean] og [neste] på skjermen på sekvensering instrumentet.
    3. Rengjør sekvensering maskinen med 250 mL av filter-steriliseres natrium kloritt løsning og senere 250 mL ultrapure vann.
  7. Trykk [Initialize], og velg aktuell sekvensering kit på skjermen.
    1. Installere en grå avsender på riktig sted med hansker hender.
    2. Initialisere sekvensering instrumentet med vaskeløsning (følger med i pakken), pH justering løsningen (inneholder 350 µL av 100 mM natriumhydroksid) og pH standard løsningen (følger med i pakken).
  8. Legge til 20 µL av dATP, dGTP, dCTP og dTTP nukleotider (forutsatt i kit) i 50-mL rør (forutsatt i kit) med en 100-µL pipette.
    1. Installere en grå avsender på riktig sted med hansker hender.
    2. Laste 50 mL tube og skruen på sekvensering instrumentet.
    3. Trykk [neste] på skjermen for å starte initialisering trinn, som tar ca 25 min.
  9. Når du har fullført initialisering trinnet:
    1. Trykk [Run] på skjermen og Velg passende biblioteket forberedelse instrumentet.
    2. Skanne todimensjonal strekkoden på brikken.
    3. Sett inn sekvensering chip på riktig plassering.
    4. Lukk chip klemme og instrument døren.
    5. Trykk [Chip sjekk], [neste], og [OK] på skjermen for å starte sekvensering kjøre.
  10. Etter reaksjon sekvensering overføre data og utføre analyse av data rørledning på sekvensering server13,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser hele prosessen fra forbereder TIC prøver å DNA utvinning. Spesielt tar prosedyren bare to dager å få genomisk DNA fra TIC prøver. Vi vurdert noen effekter av svulst lagring før lysbildet behandling. Vi fant at kreftceller er tilkoblet på av objektglass når vevsprøver ble umiddelbart berørt på lysbildet, og når vev ble holdt i saltvann fuktet sterilt-gasbind 1t (figur 2). Men når vev ble holdt ved romtemperatur, var kreftceller ikke godt knyttet til lysbildet. Ferdige lysbilder kan lagres på 4 ° C i tre måneder. Derfor er det viktig å ikke tillate den prøver å tørke.

Vi undersøkte nytten av vår metode og sammenligne den med prøver anskaffes ved hjelp av FFPE. TIC-og FFPE var forberedt fra 14 svulst prøvene, og vi bekreftet at svulsten innholdet og renhet kunne vurderes fra TIC prøver. Når vi utført Giemsa flekker, kan antall kreftceller og svulst morfologi vurderes av mikroskopi. Vi var dermed rutinemessig vurdere kreftceller og senere utføre kvalitetskontroll DNA.

DNA kvantitet og kvalitet var anslått av kvantitative sanntid PCR13,14,15. Vi bestemt absolutt DNA antallene og RQ verdien, som er en indikator på hvilket nedbrytning av genomisk DNA. Resultatene viste at en høyere yield DNA ble oppnådd med TIC prøver sammenlignet med de FFPE prøvene (tabell 1). I tillegg RQ verdiene av TIC DNA var betydelig høyere forhold til FFPE DNA (Figur 3, p = 2,3 ganger 10-8, tosidige Student t tester). Vi har også vurdert RQ verdiene av TIC og FFPE DNA Hentet fra ulike svulst typer og fant at TIC DNA var høyere i kvalitet sammenlignet FFPE DNA (Figur 3). Disse resultatene indikerte at TIC DNA mindre fragmentert FFPE DNA.

Vi vurdert neste om TIC DNA kan brukes for neste generasjons sekvensering analyse. FFPE og TIC DNA ble utarbeidet fra primære tykktarmskreft og metastatisk leversykdom kreft fra en pasient (figur 4A). PCR forsterkning og biblioteket forberedelse ble gjennomført i kreft Hotspot-panelet og deretter målrettet sekvensering ble utført. Som et resultat, ble APC Q1367 * identifisert i både FFPE og TIC DNA Hentet fra nettstedet 1 (tabell 2). Videre APC S1356 * KRAS G12D og TP53 M237I ble oppdaget i både FFPE og TIC DNA Hentet fra nettstedet 2, 3 og 4 (tabell 2). Disse resultatene antydet at identiske somatiske mutasjoner ble identifisert i sammenkoblede FFPE og TIC DNA prøver forberedt fra samme svulst området (figur 4B og tabell 2). Spesielt oppdaget den samme somatiske mutasjoner mellom primære tykktarmskreft (område 2, ikke området 1) og to metastatisk leverkreft prøver, antyder at svulsten kloner område 2 metastase å leveren (figur 4B og tabell 2). Sammen tyder disse funnene på at TIC DNA er høy kvalitet og egner seg for et bredt spekter av genetisk testing inkludert neste generasjons sekvensering.

Figure 1
Finne 1. skjematisk å DNA fra en TIC eksempel forberedelse. Tumor vev rørte på lysbildet glasset for å forberede TIC prøven. Etter vurdering av svulst morfologi og innholdet under et mikroskop, kan svulst DNA hentes og brukes for genetisk testing. Ved TIC svulsten DNA kan fås fra en klinisk patologisk prøven innen to dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Utarbeidelse av TIC prøver. Resected svulst eksemplarer ble umiddelbart berørt på en normal objektglass (venstre panel), som er holdt i saltvann fuktet sterilt-gasbind 1t (midten), og holdt ved romtemperatur 1t (høyre). Eksempel #1 ble leverkreft eksempel #2 var brystkreft. Mikroskopiske bilder ble tatt med et digitalt kamera montert et mikroskop. Skala bar: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. DNA kvalitetskontroll anslått av kvantitative sanntid PCR analyse. TIC og FFPE DNA var utdraget fra 14 tumor vev fra colorectal (n = 8), mage (n = 4), og metastatisk leverkreft (n = 2). Sammenligning av de relative kvantifisering scorene mellom TIC-Giemsa og FFPE-han prøver. RQ verdiene av TIC DNA var betydelig høyere enn for FFPE DNA. Statistisk analyse mellom de to gruppene ble utført og p-verdier ble beregnet av kortet tosidige Student t -test med Excel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Neste generasjons sekvensering analyser data med TIC og FFPE DNA. (A) Macroscopic og mikroskopiske bilder. Representant bilder av TIC-Giemsa og FFPE-han flekker fra tykktarmskreft (område 1 og 2) og metastatisk leversykdom karsinom prøver (siden 3 og 4). Skala bar i makroskopisk bilder: 1 cm, skala bar i mikroskopiske bilder: 100 µm. (B) varmekartet viser fordelingen av somatiske mutasjoner for hvert område som svulst (n = 8). Identiske mutasjoner ble oppdaget blant sammenkoblede TIC og FFPE DNA prøver. Verdiene av allel fraksjoner angis i eksamen fargeskala fra 1% (lys rosa) til 100% (rosa). Grå kolonner viste ingen identifiserte mutasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

TIC-Giemsa (n = 14) FFPE-han (n = 14)
Totalt DNA (ng) Totalt DNA (ng)
Eksempel Svulst området Kort Lang RQ Kort Lang RQ
Site1 Kolon 1495 1247 0,83 939 349 0,37
Omr2 Kolon 991 1057 1,07 556 204 0,37
Site3 Leveren 467 511 1.09 130 39 0,3
Site4 Leveren 2172 2115 0,97 488 127 0.26
Site5 Kolon 749 598 0,8 529 205 0,39
Site6 Magen 330 286 0,86 211 98 0.46
Site7 Magen 636 499 0.78 154 84 0,55
Site8 Magen 27 27 1.01 135 81 0,6
Site9 Kolon 1986 1611 0,81 476 163 0,34
Site10 Kolon 280 218 0.78 209 83 0,39
Site11 Kolon 1546 575 0,37 366 159 0.43
Site12 Magen 1501 1200 0,8 274 132 0.48
Site13 Kolon 1556 1404 0,9 326 179 0,55
Site14 Kolon 1565 1210 0.77 680 295 0.43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

Tabell 1. DNA kvalitetsdata. Sammenkoblet TIC (n = 14) og FFPE prøver (n = 14) var forberedt fra kolon, leveren og magen kreft. TIC prøvene var farget med Giemsa og FFPE prøver var farget med hematoxylin og eosin (han). DNA-prøver ble trukket ut og kvantifisert ved kvantitative sanntid PCR med to primer par forsterke RNaseP locus (lang amplicon (268 bp) og korte amplicon (87 bp)). RQ verdier ble beregnet som følger: middelverdien av lang amplicon delt bythe middelverdien av kort amplicon. SD, standardavvik; RQ, relativ kvantifisering

Eksempel navn Beliggenhet Forberedelse Gene symbol Mutasjon Posisjon Referanse Variant Koding Dekning Allel brøk
Primære tykktarmskreft Området 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45%
Primære tykktarmskreft Området 1 TIC APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72%
Primære tykktarmskreft Området 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77%
Primære tykktarmskreft Området 2 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 52%
Primære tykktarmskreft Området 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73%
Primære tykktarmskreft Området 2 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 89%
Primære tykktarmskreft Området 2 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 56%
Primære tykktarmskreft Området 2 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86%
Metastatisk leversykdom kreft Nettstedet 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92%
Metastatisk leversykdom kreft Nettstedet 3 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 62%
Metastatisk leversykdom kreft Nettstedet 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91%
Metastatisk leversykdom kreft Nettstedet 3 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 97%
Metastatisk leversykdom kreft Nettstedet 3 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 64%
Metastatisk leversykdom kreft Nettstedet 3 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95%
Metastatisk leversykdom kreft Sted 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 93%
Metastatisk leversykdom kreft Sted 4 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 60%
Metastatisk leversykdom kreft Sted 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92%
Metastatisk leversykdom kreft Sted 4 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94%
Metastatisk leversykdom kreft Sted 4 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 62%
Metastatisk leversykdom kreft Sted 4 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95%

Tabell 2. Sammenligning av mutasjoner i sammenkoblede FFPE og TIC DNA oppdaget av målrettet sekvensering analyse. Sammenkoblet TIC og FFPE var forberedt fra 2 primære kolorektal kreft (område 1 og 2) og 2 metastatisk leversykdom kreft (siden 3 og 4). Målrettet sekvensering ble utført med disse DNA-prøver og somatiske mutasjoner ble identifisert. Mutasjon profiler var like mellom parede TIC og FFPE DNA prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien presenterte vi en alternativ metode for å få svulst DNA fra klinisk patologiske prøver med TIC. TIC forberedelse er svært enkel og trenger mindre tid sammenlignet med FFPE metoder, uten behovet for spesielle instrumenter10. Alle prosedyrer fra TIC forberedelse til DNA ekstraksjon kan fullføres innen to dager (figur 1). Denne metoden forkorter dermed tiden utføre genetisk testing. Spesielt, gir dette en betydelig fordel i forkortelsen antall dager kreves for molekylær analyse. Denne kort behandlingstid tillater oss å umiddelbart tilbyr en passende therapy for progressive pasienter som trenger molecularly målrettet narkotika. Denne metoden gir dermed fordeler for analyser av genetiske endringer i svulster og administrasjon av molecularly målrettet medikamenter for kreft terapi.

Det er noen viktige punkter for å lykkes med å bruke TIC DNA for genetisk analyse. Tumor vev kan skyldes nekrotisk behandling som kjemoterapi eller andre behandlinger. Dermed er forsiktig nødvendig i forbereder TIC prøver å unngå utvalg fra nekrotisk inndelinger i svulst som mulig. Videre, innledende mikroskopiske vurdering er svært viktig for senere prosedyrer. I tillegg er hindre tørking av tumor vev nødvendig for vellykket TIC eksempel forberedelse. Hvis tumor vev er tørket, resulterer dette i færre tilknyttede celler på av objektglass. Det vil også være vanskelig å observere svulst cellularity og morfologi fordi tørking fører til degenerasjon av tumor vev.

Det er noen potensielle fordeler ved hjelp av TIC DNA. Først kan vi kontrollere svulst cellularity under den første vurderingen med mikroskopi. Hvis normale celler, som lymfocytter og stromal celler, var rikelig i vev prøvene, vil forurensning av disse normale celler hindre muligheten til å oppdage somatiske mutasjoner i kreftceller. Rask mikroskopiske vurdering av prøvene kan hjelpe evalueringen av svulst cellularity og beregning av om tilstrekkelig svulst DNA-prøver ble innhentet fra TIC prøvene før DNA utvinning. Andre viste resultatene at TIC DNA er både høy kvalitet og kvantitet. FFPE DNA har blitt brukt for neste generasjons sekvensering analyse inkludert målrettet sekvensering, exome sekvensering og hele genomet sekvensering16,17,18,19,20. Arkivering FFPE DNA brukes rutinemessig for genetisk analyse21,22, men FFPE DNA kan bli fragmentert i formalin fiksering. Dette kan føre til problemer i PCR forsterkning eller DNA utvinning, forårsaker mangel på sekvens dekning, ensartethet målet regioner, og øke risikoen for sekvensen feil23,24. Derimot er TIC DNA ikke fragmentert, som kan skyldes alkohol fiksering som har mindre innflytelse på nukleinsyre. Som TIC DNA ikke er fragmentert som FFPE DNA, vil disse prøvene være mer egnet for neste generasjons sekvensering analyse, sanntid PCR og digital PCR. Faktisk viste vi tidligere at TIC DNA fra en svulst prøven kan brukes i neste generasjons sekvensering analyse, en metode kalt "TIC-seq", og resultatene kan nettopp fange svulst somatiske mutasjoner13. Tredje gjelder denne teknikken for et bredt spekter av materialer. Gjeldende rapporten brukte vi kirurgisk prøver. I tillegg til kirurgisk vev, metastatisk lymfeknute, kan bronkial eller endoskopisk biopsi brukes for utarbeidelse av TIC DNA.

I konklusjonen, presenterer vi en enkel og rask metode for å lage høykvalitets svulst DNA TIC utvalg. Denne metoden vil utvide nye muligheter innen genetisk analyse og promotere presisjon medisin i klinisk setting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle de medisinske og hjelpeutstyr ansatte på sykehuset og pasienter for samtykker i å delta. Vi takker Gabrielle White Wolf, PhD, fra Edanz gruppe (www.edanzediting.com/ac) for å redigere et utkast av denne rapporten. Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid for genom-forskningsprosjekt fra Yamanashi prefekturet (Y.H. og MO.) og stipend fra The YASUDA medisinske Foundation (Y.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).

Tags

Kreftforskning problemet 133 DNA svulst touch forlaget cytologi FFPE fragmentering kreft
Enkel og rask metode å få høy kvalitet svulst DNA fra klinisk-patologisk prøver bruker Touch forlaget cytologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., … More

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter