Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56943
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,3
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

Summary

Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Abstract

Yönetim ve belirli moleküler hedefli uyuşturucu tedavisi kanser hastaları için önce kanser mutational durumunu belirlemek için önemlidir. Klinik ortamda parafin gömülü (FFPE) doku formalin sabit genetik test etmek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, FFPE DNA genellikle zarar görmüş ve formalin ile fiksasyon işlemi sırasında parçalanmış. Bu nedenle, FFPE DNA bazen düşük kalite ve DNA miktarı nedeniyle genetik test için yeterli değildir. Burada mikroskop altında gözlenen dokunmatik Künye Sitoloji (TIC) genomik DNA kanser hücrelerinden elde etmek için bir yöntem mevcut. Hücre morfolojisi ve kanser hücre sayıları TIC numuneler kullanılarak değerlendirilebilir. Ayrıca, genomik DNA ekstraksiyon TIC örneklerinden iki gün içinde tamamlanabilir. Toplam miktar ve kalite TIC bu yöntemi kullanarak elde edilen DNA FFPE DNA daha yüksek. Araştırmacılar yüksek kaliteli DNA (örneğin, sonraki nesil sıralama analizi, dijital PCR ve nicel gerçek zamanlı PCR) genetik test için elde etmek için ve sonuçları raporlama için dönüş süresini kısaltmak için bu hızlı ve basit bir yöntem sağlar.

Introduction

Yeni nesil sıralama teknolojisi araştırmacılar genetik varyasyonları, Mendel hastalığı, kalıtsal yatkınlık ve kanser 1,2,3 genom bilgileri analiz önemli gelişmeler sağlamıştır . Kanser genom Atlas (TCGA) ve uluslararası kanser genom Konsorsiyumu (ICGC) genetik değişiklikler çeşitli yaygın kanserlerin4tanımlaması yakalamışlardır. Temel kanser sürücü genler yüzlerce başarıyla tespit edilmiştir ve bu moleküllerin bazıları ilaç geliştirme1,5,6için hedef alınmaktadır.

Klinik ortamda FFPE numuneler Patolojik tanı ve moleküler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için test için yaygın olarak kullanılır. Ancak, formalin ile fiksasyon sürecinde DNA-protein veya DNA-DNA cross-linking oluşur ve DNA fragmantasyonu indüklenen. Böylece, FFPE DNA örnekleri her zaman düşük kalite ve miktar DNA7,8,9nedeniyle genetik analiz için uygun değildir. Ayrıca, o FFPE numuneler hazırlamak için birkaç gün sürer ve teknik beceri doğru bölümleri hazırlamak gereklidir. Bu nedenle, bu yüksek kaliteli bozulmamış DNA elde etmek için basit ve hızlı bir yöntem geliştirmek için arzu edilir.

Sitoloji Patolojik tanı için alternatif bir yöntemdir. Daha basit, daha az pahalı ve daha hızlı yaklaşım FFPE hazırlık10ile karşılaştırıldığında saytolojik örnek hazırlıktır. TIC tekniği sentinel lenf düğümleri ve meme kanserli hastalarda bir yıl11,12için intraoperatif hızlı tanı için marjinal dokulardan yapıldı. Ancak, yüksek kaliteli genomik DNA-ebilmek var olmak hulâsa TIC örnekler incelenmiştir ve sonraki genetik analiz için kullanılan birkaç raporları vardır. Saytolojik örnekler yaygın özelikle (Pap) veya Giemsa boyama ile lekeli ve biz daha önce miktarı ve kalitesi TIC örnekler (özellikle Giemsa lekeli örnekleri) çıkarılan DNA'ın FFPE elde edilen örnekler daha üstün olduğunu bildirdi doku13. PAP boyama ile karşılaştırıldığında, Giemsa boyama boyama daha az prosedürleri gerektiren bir avantaja sahiptir. Sonra örnekleri sabit ve lekeli, Pap boyama, onlar orta (örneğin, Malinol) tümör hücreleri, normal hücreleri ve inflamatuar hücrelerin mikroskop altında gibi örnek içeriği ayırt için montaj ile monte edilmesi gerekir. Pap numune montaj adım hazırlanan örnek kurutulur çünkü hücrelerin mikroskop altında gözlemlemek neredeyse imkansız. İçinde karşılaştırma, Giemsa boyama kurutulmuş durumda görülebilir, bu nedenle, montaj adım hızlı hücresel değerlendirme için gerekli değildir. Kuru numune gerektirdiğinden mikrodiseksiyon için Giemsa boyama daha uygundur.

Bu raporda, biz Giemsa boyama ile TIC numunelerin hazırlanması için basit ve hızlı bir yöntem tanıtmak ve TIC FFPE numuneler ile karşılaştırıldığında DNA için daha iyi bir kaynak olduğunu göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TIC hazırlık Normal cam kullanarak hızlı mikroskopik değerlendirmesi için slaytlar

  1. Klinik Patolojik doku malzemelerin mevcut olacağı sonra en kısa zamanda TIC hazırlık gerçekleştirin. TIC numuneler hemen hazır değil, serum ıslatılmış kaplı doku malzemeler steril gazlı bez tutmak ve dokuları kurutma önlemek için buzdolabında saklamak.
  2. Klinik olarak cerrahi veya endoskopi tarafından elde edilen 5 mm3 doku malzeme solid tümör (örneğin, karaciğer, akciğer ve meme dokuları) gibi hazırlayın.
    1. Yavaşça doku fizyolojik serum kaplı steril gazlı bezle silin ve kan, doku yüzeyi çok kan varsa kaldırın.
    2. Biyopsi malzeme gibi mikroskobik örnekleri için fizyolojik serum içinde batırılmış steril gazlı bezle nemlendirilmiş örnek tutmak.
  3. Kesmek ve normal doku düzeltme bıçakla trim ve tümör kitleleri fena halde görünür değilse tümör lezyon yüzeyine karşı karşıya.
  4. Eldivenli ellerle birkaç kez normal cam slayda rezeke örneklerin tümör yüzeye dokunun. Görsel olarak dokundu alan üzerinde normal cam slayt % 80'i olduğunu doğrulayın.
  5. Hafifçe karşı bir polietilen Naftalin (PEN) membran slayda normal cam slayt tuşuna basın ve 2 - 3 kez eldivenli elleriyle hafifçe ovalayın. Görsel olarak hücreleri kalem membran slayda normal cam slayttan aktarılır onaylayın.
  6. Cam ve kalem membran slaytlar oda sıcaklığında 5 min için kuruması.
  7. Doğrudan saytolojik muayene için normal cam slayt leke. 5 s için sabitleştirici çözüm ile cam slaytlar ve çözüm 15 boyama Giemsa ile sonra leke daldırma s.
  8. Değerlendirmek ve tamamen hızlı değerlendirme için mikroskop ile tümör içeriği ve cellularity normal cam slayt üzerinde ekran. Tümör hücreleri çeşitli ölçütlere göre değerlendirmek; Nükleer genişleme, anormal karyotip, bol Kromatin, hücre eşitsiz dağılımı, nükleer bileşen/sitoplazmik bileşeni, hücre boyutunu ve hücre polarite oranı.

2. genetik test için hazırlık kalem membran Slayt Film

  1. Örnek tümör cellularity gösteriyorsa hızlı mikroskopik değerlendirme (1.8. adım) üzerinden % 60 oranında tümör dokundu filmin DNA ekstraksiyon kalem membran slaytların bir bıçak ile kesmek ve eldivenli elleri. Bir pincette ve eldivenli elleri ile steril microcentrifuge tüp kesme film aktarın.
  2. Tümör cellularity düşük (az %60 tümör içindekiler) hızlı mikroskopik değerlendirme (Adım 1.8) tarafından tespit edildi, lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanın ve tümör örneklerini almak.
    1. Standart protokolleri kullanarak tümör hücreleri değerlendirmek için boyama Giemsa gerçekleştirin.
    2. PEM membran slayt uygun lazer yakalama mikrodiseksiyon tarafından film kesti.
    3. Bir pincette ve eldivenli elleri ile steril microcentrifuge tüp kesme film aktarın.
    4. Film içeren microcentrifuge tüp 4 ° C'de (protokol burada duraklatılmış) DNA ekstraksiyon kadar saklayın.

3. DNA ekstraksiyon

  1. DNA çekme--dan küçük değişiklikler ile FFPE DNA ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre kullanarak TIC veya FFPE doku örnekleri gerçekleştirin. FFPE DNA ekstraksiyon adım için eşdeğer bir takımdır.
  2. Doku lizis arabelleği 180 µL eklemek (pH = 8,3) el ile 200-µL pipet ile film içeren microcentrifuge Tube. 5 için maksimum hızda (yaklaşık 2500 rpm) bir girdap karıştırıcılı vortexing tarafından İndinavir K bir el ile 20 µL pipet ve karıştırmak ile 20 µL eklemek s.
  3. 56 ° C'de örnekleri gecede bir hava kuluçka ile kuluçkaya.
  4. 90 ° c ısı blok için 1 saat 10 dk, FFPE ve TIC örnekleri sırasıyla kuluçkaya. Kısaca microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı spin s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.
  5. 200 µL lizis arabelleği için örnek bir 200-µL pipet ve karıştırmak ile iyice vortexing 5 için maksimum hızda tarafından ekleyin s.
  6. Etanol (96-%100) 200-µL pipet ile 200 µL ekleyip iyice karıştırın kısaca 5 için maksimum hızda vortexing tarafından s. spin microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.
  7. Dikkatle 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun için tüm lysate aktarma
  8. Spin sütun bir temiz 2 mL toplama tüp eldivenli ellerle yerleştirin ve bir plastik atık kutusuna akışı aracılığıyla içeren koleksiyon tüp atın.
  9. Yıkama arabelleği 500 µL 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun ekleyin
  10. Spin sütun bir temiz 2 mL toplama tüp eldivenli ellerle yerleştirin ve bir plastik atık kutusuna akışı aracılığıyla içeren koleksiyon tüp atın.
  11. Yıkama arabelleği 500 µL 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun ekleyin
  12. Akış-aracılığıyla bir plastik atık kutusuna içeren koleksiyon tüp atmak. Spin sütun eldivenli ellerle temiz 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin ve 20.000 x g 3 dk membran kuruması için 25 ° c de santrifüj kapasitesi.
  13. Spin sütun bir DNA-düşük bağlama tüp eldivenli ellerle yerleştirin.
    1. 40-50 µL elüsyon arabelleği membran 100 µL pipet ile Merkezi ekler.
    2. 5 min ve 25 ° C'de 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj için oda sıcaklığında kuluçkaya
    3. DNA örnekleri-20 ° c (protokol burada duraklatılmış) sonraki adım kadar saklayın.

4. nicel gerçek zamanlı PCR ile DNA kalitesinin tahmini

  1. Aşağıdaki gibi bir pipet ile steril microcentrifuge tüp ana karışımda hazırlamak: 2 gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL 20 x 10 µL RNase P astar-sonda Mix x (amplicon boyutu: 87 bp) ve steril su nükleaz Ücretsiz 8 µL.
  2. Bir steril microcentrifuge tüp ikinci ana karışımda gibi hazırlamak: 2 gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL 20 x 10 µL RNase P astar-sonda Mix x (amplicon Boyut: 268 bp) ve steril su nükleaz Ücretsiz 8 µL.
  3. Seri dilutions (kit ile sağlanan) insan kontrolü genomik DNA'ın beş maddelik standart eğri için 4 kez gerçekleştirmek ve mutlak DNA konsantrasyonları13belirlemek.
  4. 19 µL iki hazır ana karışımları (4.1 ve 4.2 adımda hazırlanan) bir optik 96-iyi tepki plaka 20 µL pipet ile ayrı kuyu içine ekleyin.
  5. FFPE DNA veya TIC DNA 2-µL pipet ile reaksiyon karışımı içeren wells ayırmak için 1 µL ekleyin. Hiçbir şablon kontrolü için tepki karışımı içeren ayrı bir kuyuya 1 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin.
  6. Optik bir yapıştırıcı film olmayan yapışkan tarafı tutun ve koruyucu film Merkezi'nden yedekleme geri soyma. Yavaşça aplikatör filmin sürükleyin ve film 96-şey plaka üzerinde mühür.
  7. 96-şey plaka Mikser kullanarak 10 için 96-şey plaka karışımı yavaşça s 2000 devirde oda sıcaklığında. Plaka kısaca 1000 x g için oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.
  8. Gerçek zamanlı PCR enstrüman ve INSERT 96-şey plaka gücüyle. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 20 95 ° C için 1 s ve 60 ° C 20 kullanım "Standart eğri" ve "hızlı modu" s. 95 ° C 45 döngüsü tarafından takip s,
  9. DNA (göreli miktar; oranıyla DNA fragmantasyonu değerlendirmek RQ) elde edilen uzun amplicon için (268 bp) kısa amplicon için (87 bp). RQ kısa amplicon13uzun amplicon / ortalama değeri ortalama değeridir.

5. bir sonraki nesil sıralama kitaplığı hazırlanması

  1. Sıralama kitaplığı üreticinin yönergeleri doğrultusunda sonraki nesil sıralama için hazır olun.
  2. Steril microcentrifuge tüp örnek başına çoklu PCR ana karışımda gibi hazırlamak: 4 µL Multiplex PCR reaksiyon çözüm, 4 µL astar Havuzu, ≤6 µL TIC veya FFPE DNA (1-100 ng), x 5 x 5 ve 20 µL kadar nükleaz ücretsiz su ekleyin.
    1. Çoklu PCR ana karışımı bir PCR tüp için hafifçe tüp dokunarak ekleyip karıştırın.
    2. Kısaca microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı spin s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.
  3. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 99 ° C için 2 dk, 99 ° C 20 döngüsü tarafından takip için 15 s ve 60 ° C 4 dk ve holding için adım 10 ° c Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.
    Not: astar çiftleri sayısına göre devir sayısını belirleyin.
  4. PCR tüp kapağını açın ve restriksiyon enzimi 2-µL pipet ile 2 µL ekleyin. Kapağı PCR tüp ve karışımı yavaşça PCR tüp dokunarak Giriş Paneli'ni kapatın. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.
  5. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 10 min, 55 ° C 10 min, 60 ° C 20 dk için için için 50 ° C ve holding adım 10 ° c Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.
  6. Her şey bir pipet ile sindirilir PCR amplicons aşağıdaki gibi içeren içine adaptörü ligasyonu ana karışımı ekleyin: 4 µL adaptör ligasyonu çözüm, barkod 0.5 µL, 0.5 µL bağdaştırıcısının, nükleaz ücretsiz su 2 µL ve DNA ligaz 2 µL. PCR tüp ve mix kapağı hafifçe dokunarak kapatın. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.
  7. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 30 dk, 5 dk, 5 dk, 72 ° C için 68 ° C için 22 ° C ve holding adım 10 ° c
  8. Sıralama kitaplığı üreticinin talimatlarına göre manyetik boncuklar ile arındırmak.
  9. Adaptör bakmaksızın kitaplığı Çözüm 1.5 mL DNA düşük-bağlama tüp içine aktarın. Manyetik boncuklar 45 µL 1st arıtma için DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Tüp dokunarak karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  10. Sonra oda sıcaklığında 2 dk kadar çözüm açıktır kuluçkaya DNA-düşük bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin. Dikkatle süpernatant 200-µL pipet ile manyetik boncuklar bozmadan atmak.
  11. 200-µL pipet ile taze hazırlanmış % 70 etanol 150 µL ekleyin, sonra tüp yan-yan boncuk yıkamak için mıknatıs taşı. Dikkatle süpernatant manyetik boncuklar bozmadan atmak.
  12. 5.11 ikinci bir yıkama için yineleyin.
  13. Kısaca 5 için 1.500 x g de mini santrifüj ile tüp spin s, oda sıcaklığında. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatle 10 µL pipet ile etanol damlacıkları atın.
  14. Düşük TE 50 µL boncuk dağıtmak için manyetik boncuklar Pelet içeren DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
  15. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve kadar çözüm açıktır, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
  16. 50 µL süpernatant, yeni DNA düşük-bağlama tüp içine aktarmak ve manyetik boncuklar 2nd arıtma 100 µL pipet ile 75 µL ekleyin. Tüp dokunarak karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  17. Sonra oda sıcaklığında 2 dk kadar çözüm açıktır kuluçkaya DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin. Dikkatle süpernatant 200-µL pipet ile manyetik boncuklar bozmadan atmak.
  18. 200-µL pipet ile taze hazırlanmış % 70 etanol 150 µL ekleyin, sonra tüp yan-yan boncuk yıkamak için mıknatıs taşı. Dikkatle süpernatant manyetik boncuklar bozmadan atmak.
  19. 5,18 için ikinci bir yıkama arasındaki adımları yineleyin.
  20. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile tüp spin s, oda sıcaklığında. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatle 10 µL pipet ile etanol damlacıkları atın.
  21. Düşük TE 50 µL boncuk dağıtmak için manyetik boncuklar Pelet içeren DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
  22. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve kadar çözüm açıktır, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
  23. Yeni DNA düşük-bağlama tüp 100 µL pipet ile içine arıtılmış kitaplığı içeren süpernatant ile 45 µL aktarın.

6. Kütüphane konsantrasyon nicel gerçek zamanlı PCR tarafından ölçmek

  1. Her kitaplık üreticisinin yönergeleri13göre konsantrasyonu belirlemek.
    1. Aşağıdaki gibi bir 20-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 2 µL arıtılmış Kütüphanesi ve nükleaz ücretsiz su bir DNA düşük-bağlama tüp 38 µL 2-µL ve 100 µL pipet ile karıştırın.
    2. -20 ° c su katılmamış kitaplıkları adım 7,3 kadar saklayın.
  2. Aşağıdaki gibi bir 200-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 20-fold seyreltilmiş saf kitaplığının (6.1 adımda hazırlanan) 5 µL karıştırın ve bir DNA düşük-bağlama tüp su nükleaz ücretsiz 45 µL.
  3. Aşağıdaki gibi bir 2,000-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 200-fold seyreltilmiş saf kitaplığının (6.2 adımda hazırlanan) 5 µL karıştırın ve bir DNA düşük-bağlama tüp su nükleaz ücretsiz 45 µL.
  4. Aşağıdaki gibi tepki ana karışım hazırlamak: 2 ana mix çözüm x 10 µL ve astar-sonda tahlil çözüm steril microcentrifuge tüp x 20 1 µL bir pipet ile karıştırın, sonra karışımı tüp dokunarak. 11 µL optik bir 96-şey reaksiyon kuyu içine tepki ana karışımı ekleyin.
  5. Her şey 10 µL pipet ile 9 µL 2,000-fold seyreltilmiş Kütüphanesi, standart her denetimin 9 µL veya 9 nükleaz ücretsiz su µL ekleyin.
  6. Optik yapıştırıcı film olmayan yapışkan tarafı tutun ve koruyucu film Merkezi'nden yedekleme geri soyma.
    1. Yavaşça aplikatör filmin sürükleyin ve film 96-şey plaka üzerinde mühür.
    2. 96-şey plaka Mikser kullanarak 10 için 96-şey plaka karışımı yavaşça s, oda sıcaklığında.
    3. Plaka kısaca 1000 x g için oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.
  7. Gerçek zamanlı PCR enstrüman ve INSERT 96-şey plaka gücüyle. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 50 ° C için 2 dk, 20 95 ° C için 1 s ve 60 ° C 20 kullanım "Standart eğri" ve "hızlı modu" s. 95 ° C 40 döngüsü tarafından takip s,
  8. Su katılmamış Kütüphane konsantrasyon qPCR ile 2.000 tarafından belirlenen konsantrasyon çarparak hesaplar.

7. sonraki üretimi sıralaması

  1. Çalışma durum planı ve yazılım içinde çalışma parametresini ayarlayın.
    1. [Planı sekmesini] ve [] şablon ve uygun çalışma yöntemini seçin.
    2. Uygulama ve teknik türü seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.
    3. Enstrüman, örnek hazırlama takımı (isteğe bağlı), kitaplığı seti türü, şablon seti, sıralama seti seçin, kalibrasyon modu temel, türü chip, sıra (isteğe bağlı) ve barkod kümesi kontrol ve [ileri] düğmesini tıklatın.
    4. Eklentileri seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.
    5. Projeyi seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.
    6. Varsayılan başvuru ve hedef bölgenin yatak dosyaları seçin.
    7. Örnek adı yazın, barkod seçin ve [planı Run]'ı tıklatın.
  2. Şablon hazırlama gerçekleştirmek ve üreticinin yönergelerine göre otomatik bir araç yükleme çip. Reaktif kartuşu kullanmadan önce 45 dk için oda sıcaklığında erimek.
  3. Su katılmamış kütüphanede 6,8 adımda hesaplanan Kütüphane konsantrasyon göre nükleaz ücretsiz suyla seyreltik ve 20 pM kitaplıkları olun.
    1. Havuza alınan bir kütüphane sıralama ve buz üzerinde mağaza hazırlayın.
    2. 100 µL pipet ile havuza alınan Kütüphanesi 25 µL örnek tüp altýna ekleyin. 48 saat içinde havuzlu kitaplığı kullanın.
  4. Güç ve otomatik araç kapağını açın.
    1. Sıralama çip, fiş adaptörü, zenginleştirme kartuş, ipucu kartuş, PCR plaka, PCR çerçeve mühür, kurtarma tüp, çözüm kartuş ve reaktif kartuşu otomatik araç uygun konuma yerleştirin.
    2. Dokunmatik çalışma [Kurulum] ve [adım adım] üstünde belgili tanımlık perde.
    3. Kapağı kapatın ve [Başlat onay] dokunmatik ekran üzerinde.
    4. Sonra güverte tarama işlemini, [ileri] dokunmatik ekran üzerinde.
    5. (Kit, yonga türü, çip ID, örnek kimliği, planları) ekran içeriğini denetleyin, saati ayarlamak ve [OK] dokunmatik ekran üzerinde.
  5. Çip yükleme bittikten sonra:
    1. [İleri] dokunmatik ekran üzerinde ve kapağını açın.
    2. Sıralama küçük parça--dan fiş adaptörü eldivenli ellerle kaldırıldı.
    3. Çip çip kapsayıcıya yerleştirmek rap parafilm ve sıralama tepki kadar 4 ° C'de mağaza ile.
    4. Zenginleştirme kartuş, PCR plaka, PCR çerçeve mühür, kurtarma tüp, çözüm kartuş ve reaktif kartuşu eldivenli ellerle otomatik enstrümanın uygun konumdan kaldırıldı.
    5. Bir boş-ipucu kartuş otomatik araç eldivenli elleri ile atık ipucu konumunu aktarın.
    6. [İleri] dokun ve kapağı kapatın.
    7. [Başlat] dokunma ve 4 dk için ultraviyole ışınları tarafından otomatik araç temiz.
  6. Ultrasaf su ve filtre çözüm 0,22-µm filtre akış filtresi birimi olan 1000 ml sodyum klorit tablet geçiyoruz.
    1. Sıralama araç gücüyle.
    2. Dokunma [temiz] ve [ileri] sıralama enstrümanın ekranda.
    3. Sıralama araç 250 mL filtre sterilize sodyum klorit çözüm ve daha sonra 250 mL ultrasaf su ile temizleyin.
  7. [Başlat] dokunun ve ekrandaki uygun sıralama seti seçin.
    1. Uygun yerde gri bir nakliyeci eldivenli elleriyle yükleyin.
    2. (Kit ile sağlanan) yıkama çözüm, (100 mM sodyum hidroksit 350 µL içeren) pH ayarlama çözüm ve (kit ile sağlanan) pH standart çözüm ile sıralama aracı başlatın.
  8. (Kit ile sağlanan) dATP, dGTP, dCTP ve dTTP nükleotit (Seti'nde sağlanan) 50 mL tüpler 20 µL 100 µL pipet ile ekleyin.
    1. Uygun yerde gri bir nakliyeci eldivenli elleriyle yükleyin.
    2. 50 mL tüp ve vida sıralama araç üzerine yükleyin.
    3. [İleri] dokunmatik ekran üzerinde yaklaşık 25 dakika sürer başlatma adım başlamak için.
  9. Başlatma adımı tamamladıktan sonra:
    1. [Run] dokunmatik ekran üzerinde ve uygun Kütüphane hazırlık aracı seçin.
    2. Çipin iki boyutlu barkod tarama.
    3. Uygun konumu sıralama çipte yerleştirin.
    4. Çip kelepçe ve enstrüman kapıyı kapat.
    5. [Çip onay] [ileri], dokunma ve [sıralama çalışma başlatmak için ekrandaki OK].
  10. Sıralama reaksiyon sonra veri aktarımı ve veri analiz boru hattı üzerinde sıralama sunucu13,17gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 TIC numuneler DNA ekstraksiyon için hazırlanıyor üzerinden tüm süreci gösterir. Özellikle, yordamı genomik DNA TIC örneklerinden elde etmek için sadece iki gün alır. Biz herhangi bir etkisi tümör depolama slayt işlemeden önce değerlendirildi. Tümör hücreleri doku örnekleri hemen slayt dokundu vardı ve dokular serum fizyolojik nemli steril-gazlı bez için 1 h (Şekil 2) tutuldu cam slayt bağlı olduğunu bulduk. Dokulara oda sıcaklığında tutulur ancak, tümör hücreleri de slayda bağlı değil. Hazırlanan slaytlar 4 ° C'de 3 aydır saklanan olabilir. Bu nedenle, Kuru örnekler vermemek önemlidir.

Biz bizim yöntem yarar muayene ve FFPE kullanarak alınan numuneler ile karşılaştırın. TIC ve FFPE örnekleri 14 tümör örnekler hazırlanmıştır ve tümör içeriği ve saflık TIC örnekler değerlendirildi doğruladı. Sonra biz Giemsa boyama, tümör hücreleri ve tümör Morfoloji mikroskobu tarafından değerlendirildi. Biz böylece düzenli olarak tümör hücreleri değerlendirmek ve daha sonra DNA kalite kontrolü yapmak başardık.

DNA miktar ve kalite nicel gerçek zamanlı PCR13,14,15tarafından tahmin edilmiştir. Biz mutlak DNA miktarları ve genomik DNA'ın yıkımı düzeyinin bir göstergesi olan RQ değerini tespit. Sonuçlar, daha yüksek bir DNA verim FFPE örnekler (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında TIC numuneler kullanılarak elde gösterdi. Buna ek olarak, RQ değerler TIC DNA'ın önemli ölçüde daha yüksek bu FFPE DNA ile karşılaştırıldı (şekil 3, p = 2.3 x 10-8, iki kuyruklu Öğrenci t testleri). Biz de TIC ve FFPE farklı tümör türlerine karşı çıkarılan ve TIC DNA kalitesinde FFPE DNA (şekil 3) göre daha yüksek bulundu DNA RQ değerleri değerlendirildi. Bu sonuçlar TIC DNA FFPE DNA daha az parçalanmış olduğunu belirtti.

TIC DNA sonraki nesil sıralama analizi için kullanılabilir olup olmadığını biz sonraki değerlendirildi. FFPE ve TIC DNA birincil kolorektal kanser ve metastatik karaciğer kanseri bir hasta (şekil 4A) elde hazırlanmıştır. PCR güçlendirme ve Kütüphane hazırlık kanser Hotspot panelini kullanarak yapılmıştır ve daha sonra hedeflenen sıralama gerçekleştirildi. Sonuç olarak, APC Q1367 * FFPE ve TIC Site 1 (Tablo 2) çıkarılan DNA tespit edilmiştir. Ayrıca, APC S1356 *, KRAS G12D ve TP53 M237I her iki FFPE tespit edildi ve TIC DNA sitesinden çıkarılan 2, 3 ve 4 (Tablo 2). Bu sonuçlar aynı somatik mutasyon aynı tümör (4B şekil ve Tablo 2) siteden hazırlanmış eşleştirilmiş FFPE ve TIC DNA örneklerinde tespit edilmiştir önerdi. Özellikle, aynı somatik mutasyon (Site 2'de, Site 1) birincil kolorektal kanser ve tümör klonlar Site 2 (şekil 4B ve Tablo 2) karaciğer metastaz düşündüren iki metastatik karaciğer kanseri örnekleri arasında tespit edildi. Birlikte bu bulgular TIC DNA yüksek kaliteli ve genetik test sonraki nesil sıralama dahil olmak üzere geniş bir aralığı için uygundur öneririz.

Figure 1
1. şematik DNA TIC numune hazırlama almak için rakam. Tümör doku TIC örnek hazırlamak için slayt camına dokundu. Sonra tümör morfoloji ve içeriği bir mikroskop altında değerlendirilmesi, tümör DNA çıkarılan ve genetik test etmek için kullanılır. TIC kullanarak, tümörün DNA bir klinik patolojik örnek iki gün içinde elde edilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. TIC örnekleri hazırlanması. Resected tümör numuneler hemen serum fizyolojik nemli steril-gazlı bez için 1 h (orta), muhafaza bir normal cam slayt (sol kapı aynası), üzerine dokundu ve 1 h için oda sıcaklığında (sağda) tutulur. Örnek #1 Hepatosellüler karsinom ve örnek #2 meme kanseri oldu. Mikroskobik resimler için mikroskop monte bir dijital kamera ile ele geçirildi. Ölçek çubuğu: 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. DNA kalite kontrolü tahmini nicel gerçek zamanlı PCR analizi ile. TIC ve FFPE DNA 14 tümör dokulardan kolorektal üzerinden elde (n = 8), mide (n = 4) ve metastatik karaciğer kanseri (n = 2). TIC-Giemsa ve FFPE-o örnekleri arasında göreli miktar puanları karşılaştırılması. RQ değerleri TIC DNA'ın önemli ölçüde FFPE DNA daha yüksek. İki grup arasında istatistiksel analiz gerçekleştirilen ve p-değerleri Excel kullanarak unpaired iki kuyruklu Öğrenci t testi tarafından hesaplanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Sonraki nesil sıralama çözümleme verisi TIC ve FFPE DNA kullanarak. (A)Macroscopic ve mikroskobik görüntüler. TIC-Giemsa ve FFPE-o kolorektal kanser (site 1 ve 2) ve metastatik karaciğer Karsinomu örnekleri (site 3 ve 4) Boyama temsilcisi görüntüleri. Ölçek çubuğu makroskopik görüntüler: 1 cm, ölçek çubuğu mikroskobik görüntüler: her tümör site için somatik mutasyon dağılımını gösteren 100 µm. (B) ısı haritası (n = 8). Aynı mutasyonlar eşleştirilmiş TIC ve FFPE DNA örnekleri arasında tespit edildi. Allelic kesirler değerlerini mezuniyet renk ölçeğinde %1 (pembe) % 100 (pembe) gösterilir. Gri sütun yok saptanan mutasyon gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

TIC-Giemsa (n = 14) FFPE-o (n = 14)
Toplam DNA (ng) Toplam DNA (ng)
Örnek Tümör sitesi Kısa Uzun RQ Kısa Uzun RQ
Site1 İki nokta üst üste 1495 1247 0,83 939 349 0,37
Site2 İki nokta üst üste 991 1057 1,07 556 204 0,37
Site3 Karaciğer 467 511 1,09 130 39 0,3
Site4 Karaciğer 2172 2115 0,97 488 127 0,26
Site5 İki nokta üst üste 749 598 0.8 529 205 0,39
Site6 Mide 330 286 0.86 211 98 0,46
Site7 Mide 636 499 0.78 154 84 0,55
Site8 Mide 27 27 1,01 135 81 0,6
Site9 İki nokta üst üste 1986 1611 0,81 476 163 0,34
Site10 İki nokta üst üste 280 218 0.78 209 83 0,39
Site11 İki nokta üst üste 1546 575 0,37 366 159 0,43
Site12 Mide 1501 1200 0.8 274 132 0.48
Site13 İki nokta üst üste 1556 1404 0,9 326 179 0,55
Site14 İki nokta üst üste 1565 1210 0.77 680 295 0,43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

Tablo 1. DNA kalite veri. Eşleştirilmiş TIC (n = 14) ve FFPE örnekler (n = 14) iki nokta üstüste, karaciğer ve mide kanserleri hazırlanmıştır. TIC örnekleri Giemsa ile lekeli ve FFPE örnekleri Hematoksilen ve Eozin (o) ile lekeli. DNA örnekleri çıkarılan ve nicel gerçek zamanlı PCR tarafından iki astar çift RNaseP odağı yükseltecek sayılabilir (uzun amplicon (268 bp) ve kısa amplicon (87 bp)). RQ değerleri olarak hesaplanan: uzun amplicon ortalama değerini bölünmüş kısa amplicon yanında ortalama değeri. SD, standart sapma; RQ, göreli Nefelometri

Örnek adı Konumu Hazırlık Gene sembolü Mutasyon Pozisyon Başvuru Varyant Kodlama Kapsama alanı Allelic kesir
Birincil kolorektal kanser Sayfa 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 % 45
Birincil kolorektal kanser Sayfa 1 TIC APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 %72
Birincil kolorektal kanser Site 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 % 77
Birincil kolorektal kanser Site 2 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 % 52
Birincil kolorektal kanser Site 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 % 73
Birincil kolorektal kanser Site 2 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 % 89
Birincil kolorektal kanser Site 2 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 % 56
Birincil kolorektal kanser Site 2 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 %86
Metastatik karaciğer kanseri Sitesi 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 % 92
Metastatik karaciğer kanseri Sitesi 3 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 %62
Metastatik karaciğer kanseri Sitesi 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 % 91
Metastatik karaciğer kanseri Sitesi 3 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 % 97
Metastatik karaciğer kanseri Sitesi 3 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 %64
Metastatik karaciğer kanseri Sitesi 3 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 % 95
Metastatik karaciğer kanseri Site 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 %93
Metastatik karaciğer kanseri Site 4 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 % 60
Metastatik karaciğer kanseri Site 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 % 92
Metastatik karaciğer kanseri Site 4 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 % 94'ü
Metastatik karaciğer kanseri Site 4 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 %62
Metastatik karaciğer kanseri Site 4 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 % 95

Tablo 2. Mutasyonlar eşleştirilmiş FFPE ve TIC hedeflenen sıralama analizi ile tespit DNA karşılaştırılması. Eşleştirilmiş TIC ve FFPE örnekleri 2 birincil kolorektal kanserler (Site 1 ve 2) hazırlanan ve 2 metastatik karaciğer kanserleri (Site 3 ve 4). Hedeflenen sıralama bu DNA örnekleri ile gerçekleştirilmiş ve somatik mutasyon tespit edilmiştir. Mutasyon profilleri eşleştirilmiş TIC ve FFPE DNA örnekleri arasında aynıydı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, tümör DNA TIC kullanarak klinik patolojik numunelerin elde etmek için alternatif bir yöntem mevcuttur. TIC hazırlık çok basittir ve FFPE yöntemleri, özel aletleri10zorunluluğu olmadan ile karşılaştırıldığında daha az zaman ihtiyacı var. TIC hazırlık DNA ekstraksiyon için yordamlar (şekil 1) iki gün içinde tamamlanabilir. Bu yöntem böylece genetik test gerçekleştirmek için geri dönüş süresini kısaltır. Özellikle, bu moleküler analiz için gereken gün sayısını kısalma içinde önemli bir avantaj sağlar. Bu kısa gerçekleştirme süresi hemen tatlı hedeflenen uyuşturucu isteyen Progresif kanser hastaları için uygun bir tedavi sunmak için bize izin verir. Bu yöntem böylece tümör genetik değişiklikler analizleri ve yönetim kanser tedavisi için tatlı hedeflenen ilaçların faydaları sağlar.

TIC DNA Genetik analiz için kullanarak başarı için bazı önemli noktalar vardır. Tümör doku tedavi kemoterapi gibi veya diğer tedaviler nedeniyle kangren olabilir. Böylece, dikkat TIC numunelerin hazırlanmasında örnekleme mümkün olduğunca tümör nekrotizan bölümlerden önlemek için gereklidir. Ayrıca, ilk mikroskobik değerlendirme sonraki yordamlar için çok önemlidir. Buna ek olarak, tümör dokuların kurutma engelleyen başarılı TIC numune hazırlama için gereklidir. Tümör doku kurutulur, bu cam slayt üzerinde daha az iliştirilmiş hücrelerdeki sonucu. Ayrıca tümör cellularity ve Morfoloji tümör doku dejenerasyonu neden kurutma çünkü gözlemlemek zor olacak.

TIC DNA'yı kullanarak bazı potansiyel faydaları vardır. İlk olarak, biz mikroskobu ile ilk değerlendirme sırasında tümör cellularity kontrol edebilirsiniz. Lenfositler ve stromal hücreler gibi normal hücrelerin doku örnekleri bol olsaydı, bu normal hücreler kirlenme somatik mutasyon tümör hücrelerinde algılama yeteneğini engeller. Hızlı mikroskopik değerlendirme örnekleri tümör cellularity değerlendirilmesi ve tahmini olup yeterli tümör DNA örnekleri DNA ekstraksiyon önce TIC örneklerinden elde yardımcı olabilir. İkinci olarak, bizim sonuçlar TIC DNA yüksek kalite ve miktar her ikisi de olduğunu gösterdi. FFPE DNA hedeflenen sıralama, exome sıralama ve tüm genom sıralama16,17,18,19,20de dahil olmak üzere sonraki nesil sıralama analizi için kullanılır. FFPE DNA formalin fiksasyon sırasında parçalanmış ancak arşivleme FFPE DNA Genetik analiz21,22için Ayrıca düzenli olarak kullanılır. Bu sorunlar PCR güçlendirme veya DNA ekstraksiyon, sıra kapsam, tekdüzelik, hedef bölgeleri, bir eksikliği neden neden ve sıra hata23,24riskini artırır. Buna ek olarak, TIC DNA, hangi-ebilmek var olmak daha az nükleik asit üzerinde büyük etkisi olan alkol fiksasyonu nedeniyle parçalanmış değil. TIC DNA FFPE DNA gibi parçalanmış değil, bu örnekler sonraki nesil sıralama analizi, gerçek zamanlı PCR ve dijital PCR için daha uygun olacaktır. Gerçekten de, daha önce bir tümör örnekten TIC DNA yeni nesil sıralama analizi, "TIC-seq" adı verilen bir yöntem kullanılabilir ve sonuçları tam olarak tümör somatik mutasyon13yakalamak gösterdi. Üçüncü olarak, bu teknik malzemeler geniş bir yelpazesi için geçerlidir. Geçerli rapordaki cerrahi numuneler kullandık. Cerrahi dokular yanı sıra, metastatik lenf nodu, bronş veya endoskopik biyopsi TIC DNA hazırlamak için kullanılabilir.

Sonuç olarak, biz yüksek kaliteli tümör DNA TIC numuneleri kullanılarak hazırlanması için basit ve hızlı bir yöntem mevcut. Bu yöntem genetik analizi alanında yeni olanakları genişletmek ve hassas tıp klinik ortamda tanıtımına yardımcı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Hastane ve hastaların tüm tıbbi ve yardımcı personel katılmayı kabul etmiş için teşekkür ediyoruz. Gabrielle White Wolf, doktora, Edanz bu raporu taslağını düzenlemek için Grup (www.edanzediting.com/ac) teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada genom araştırma projesinden Yamanashi İli (YH ve tarzı) ve bir hibe üzerinden YASUDA tıbbi Vakfı (YH) için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).

Tags

Kanser araştırmaları sayı: 133 DNA tümör touch Künye Sitoloji FFPE parçalanma kanser
Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., … More

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter