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Cancer Research

स्पर्श छाप Cytology का उपयोग नैदानिक रोग नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूमर डीएनए प्राप्त करने के लिए सरल और तेजी से विधि

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56943
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,3
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

Summary

ट्यूमर के ऊतकों से उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के आनुवंशिक परिवर्तन अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग कर का विश्लेषण करने के लिए एक आवश्यक पहला कदम है । इस अनुच्छेद में, हम ट्यूमर कोशिकाओं को समृद्ध और स्पर्श छाप cytology नमूनों से बरकरार डीएनए प्राप्त करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

यह प्रशासन और कैंसर रोगियों के लिए विशिष्ट आणविक लक्षित दवाओं के उपचार से पहले कैंसर में उत्परिवर्तन की स्थिति का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है । नैदानिक सेटिंग में, formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतकों को व्यापक रूप से आनुवंशिक परीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, FFPE डीएनए आम तौर पर क्षतिग्रस्त और formalin के साथ निर्धारण की प्रक्रिया के दौरान खंडित है । इसलिए, डीएनए की कम गुणवत्ता और मात्रा की वजह से FFPE डीएनए कभी-कभार आनुवंशिक परीक्षण के लिए पर्याप्त नहीं होता है । यहाँ हम स्पर्श छाप cytology (टिक) कैंसर कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए एक विधि मौजूद है, जो एक खुर्दबीन के नीचे मनाया जा सकता है. कक्ष आकृति विज्ञान और कैंसर कोशिका संख्या टिक नमूनों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा, टिक नमूनों से जीनोमिक डीएनए की निकासी दो दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है । कुल राशि और टिक डीएनए की गुणवत्ता इस विधि का उपयोग कर प्राप्त की है कि FFPE डीएनए की तुलना में अधिक था । इस तेजी से और सरल विधि शोधकर्ताओं आनुवंशिक परीक्षण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है (उदा, अगली पीढ़ी अनुक्रमण विश्लेषण, डिजिटल पीसीआर, और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर) और परिणाम रिपोर्टिंग के लिए बदलाव समय छोटा करने के लिए ।

Introduction

अगली पीढ़ी sequencing प्रौद्योगिकी आनुवंशिक विविधताओं, Mendelian रोग, वंशानुगत गड़बड़ी में जीनोम जानकारी का विश्लेषण करने में शोधकर्ताओं ने महत्वपूर्ण प्रगति प्रदान की है, और कैंसर 1,2,3 . कैंसर जीनोम एटलस (TCGA) और अंतरराष्ट्रीय कैंसर जीनोम कंसोर्टियम (ICGC) आम कैंसर के कई प्रकार में आनुवंशिक परिवर्तन की पहचान का पीछा किया है4। आवश्यक कैंसर चालक जीन के सैकड़ों सफलतापूर्वक पहचान की गई है, और इन अणुओं के कुछ दवा विकास1,5,6के लिए लक्षित किया जा रहा है ।

नैदानिक सेटिंग में, FFPE नमूनों आमतौर पर कैंसर सहित विभिन्न रोगों के लिए रोग निदान और आणविक परीक्षण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, formalin के साथ निर्धारण की प्रक्रिया के दौरान, डीएनए-प्रोटीन या डीएनए-डीएनए पार से जोड़ने होता है और डीएनए विखंडन प्रेरित है । इस प्रकार, FFPE डीएनए के नमूनों हमेशा कम गुणवत्ता और डीएनए की मात्रा की वजह से आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं7,8,9. इसके अतिरिक्त, यह FFPE नमूनों को तैयार करने के लिए कई दिन लगते हैं, और तकनीकी कौशल सही वर्गों को तैयार करने के लिए आवश्यक है । इसलिए, उच्च गुणवत्ता बरकरार डीएनए प्राप्त करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि विकसित करने के लिए वांछनीय है ।

Cytology रोग निदान के लिए एक वैकल्पिक तरीका है । कोशिकाविज्ञान नमूना तैयारी एक सरल, कम खर्चीला है, और अधिक तेजी से दृष्टिकोण FFPE तैयारी के साथ की तुलना में10. टिक तकनीक intraoperative तेजी से निदान के लिए कुछ वर्षों के लिए स्तन कैंसर रोगियों से प्रहरी लिम्फ नोड्स और सीमांत ऊतकों पर प्रदर्शन किया गया है11,12। हालांकि, वहां कुछ रिपोर्टों है कि क्या उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए टिक नमूनों से निकाला जा सकता है और बाद में आनुवंशिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल की जांच की है । कोशिकाविज्ञान नमूनों सामांयतः Papanicolaou (पीएपी) या Giemsa धुंधला के साथ दाग रहे हैं, और हम पहले की सूचना दी है कि राशि और डीएनए की गुणवत्ता टिक नमूनों से निकाले (विशेष रूप से Giemsa-दाग नमूनों) FFPE से प्राप्त नमूनों को बेहतर कर रहे है 13ऊतक । पीएपी धुंधला के साथ तुलना में, Giemsa धुंधला कम धुंधला प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है में एक फायदा है । पीएपी धुंधला में, के बाद नमूनों को ठीक किया गया है और सना हुआ, वे बढ़ते मध्यम (उदा, Malinol) नमूना सामग्री, जैसे ट्यूमर कोशिकाओं, सामांय कोशिकाओं, और एक खुर्दबीन के नीचे भड़काऊ कोशिकाओं के रूप में भेद के लिए के साथ घुड़सवार किया जाना चाहिए । यदि पीएपी नमूना बढ़ते कदम के बिना तैयार है, यह लगभग एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण क्योंकि नमूना सूख गया है असंभव है । इसकी तुलना में, Giemsa धुंधला सूख राज्य में मनाया जा सकता है, इसलिए, बढ़ते कदम त्वरित सेलुलर मूल्यांकन के लिए आवश्यक नहीं है । microdissection के लिए, Giemsa धुंधला अधिक उपयुक्त है क्योंकि यह शुष्क नमूनों की आवश्यकता है ।

इस रिपोर्ट में, हम Giemsa धुंधला के साथ टिक नमूनों की तैयारी के लिए एक सरल और तेजी से विधि लागू करने और प्रदर्शन है कि टिक FFPE नमूनों के साथ तुलना में डीएनए के लिए एक बेहतर स्रोत है ।

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Protocol

1. सामांय ग्लास स्लाइड का उपयोग कर त्वरित सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए टिक तैयारी

  1. नैदानिक रोग ऊतक सामग्री उपलब्ध हैं के बाद जितनी जल्दी हो सके टिक तैयारी करते हैं । अगर टिक नमूनों को तुरंत तैयार नहीं किया जा सकता है, ऊतक सामग्री खारा गीला बाँझ-धुंध और फ्रिज में स्टोर के ऊतकों के सूखने को रोकने के साथ कवर रखने के लिए ।
  2. 5 मिमी3 ऊतक सामग्री जैसे ठोस ट्यूमर (जैसे, जिगर, फेफड़े, और स्तन के ऊतकों) नैदानिक सर्जरी या एंडोस्कोपी द्वारा प्राप्त तैयार करते हैं ।
    1. ऊतक सतह रक्त का एक बहुत कुछ है, तो धीरे शारीरिक खारा के साथ लिपटे बाँझ-धुंध के साथ ऊतक पोंछ और रक्त को हटा दें ।
    2. इस तरह के बायोप्सी सामग्री के रूप में सूक्ष्म नमूनों के लिए, शारीरिक खारा में लथपथ बाँझ-धुंध के साथ गीला नमूना रखें.
  3. कट और एक ट्रिमिंग चाकू के साथ सामांय ऊतक ट्रिम और ट्यूमर के घावों की सतह बेनकाब, अगर ट्यूमर आम तौर पर दिखाई नहीं दे रहे हैं ।
  4. दस्ताने हाथों के साथ कई बार एक सामान्य गिलास स्लाइड पर संप्रदायीय नमूनों की ट्यूमर सतह को छूने. नेत्रहीन की पुष्टि छुआ क्षेत्र सामांय गिलास स्लाइड के 80% से अधिक है ।
  5. हल्के से एक पॉलीथीन naphthalate (पेन) झिल्ली स्लाइड के खिलाफ सामांय गिलास स्लाइड प्रेस और धीरे दस्ताने हाथों से 2-3 बार रगड़ना । विज़ुअल रूप से पुष्टि करें कि कक्ष सामान्य ग्लास स्लाइड से पेन झिल्ली स्लाइड पर स्थानांतरित किए जाते हैं.
  6. एयर-ड्राई दोनों ग्लास और पेन झिल्ली स्लाइड कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ।
  7. प्रत्यक्ष कोशिकाविज्ञान परीक्षा के लिए सामांय गिलास स्लाइड दाग । 5 एस के लिए निर्धारण समाधान के साथ ग्लास स्लाइड डुबकी, और फिर 15 एस के लिए Giemsa धुंधला समाधान के साथ दाग ।
  8. आकलन और त्वरित आकलन के लिए एक खुर्दबीन के साथ पूरी तरह से सामान्य गिलास स्लाइड पर ट्यूमर सामग्री और सेलुलर स्क्रीन. कई मानदंडों के आधार पर ट्यूमर कोशिकाओं का मूल्यांकन; नाभिकीय इज़ाफ़ा, असामान्य कैरयोटाइप, प्रचुर मात्रा में क्रोमेटिन, कोशिकाओं का असमान वितरण, परमाणु घटक के अनुपात/cytoplasmic घटक, कोशिका का आकार, और कोशिका ध्रुवीयता.

2. आनुवंशिक परीक्षण के लिए पेन झिल्ली स्लाइड फिल्म की तैयारी

  1. नमूना त्वरित सूक्ष्म आकलन (चरण 1.8) द्वारा 60% से अधिक ट्यूमर सेलुलर से पता चलता है, तो एक चाकू और दस्ताने हाथों के साथ डीएनए निष्कर्षण के लिए पेन झिल्ली स्लाइड की ट्यूमर-छुआ फिल्म में कटौती । एक pincette और दस्ताने हाथों के साथ एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब करने के लिए कटौती फिल्म हस्तांतरण ।
  2. ट्यूमर सेलुलर कम के रूप में निर्धारित किया गया था (ट्यूमर की सामग्री की कम 60%) त्वरित सूक्ष्म आकलन द्वारा (चरण 1.8), लेजर पर कब्जा microdissection का उपयोग करें और ट्यूमर के नमूने प्राप्त.
    1. प्रदर्शन Giemsa मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर ट्यूमर कोशिकाओं का आकलन करने के लिए धुंधला ।
    2. उपयुक्त लेजर कैप्चर microdissection द्वारा PEM झिल्ली स्लाइड की फिल्म काट ।
    3. एक pincette और दस्ताने हाथों के साथ एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब करने के लिए कटौती फिल्म हस्तांतरण ।
    4. फिल्म की दुकान-4 ° c पर microcentrifuge ट्यूब युक्त डीएनए निष्कर्षण जब तक (प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है) ।

3. डीएनए निष्कर्षण

  1. छोटे संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक FFPE डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर टिक या FFPE ऊतक नमूनों से डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन । एक समकक्ष किट FFPE डीएनए निष्कर्षण कदम के लिए उपलब्ध है ।
  2. ऊतक lysis बफर के 180 µ एल जोड़ें (पीएच = 8.3) एक मैनुअल के साथ microcentrifuge ट्यूब युक्त फिल्म के लिए 200-µ l पिपेट. 5 एस के लिए अधिकतम गति (लगभग 2,500 rpm) पर एक भंवर मिक्सर के साथ भंवर द्वारा एक मैनुअल 20-µ एल पिपेट और मिश्रण के साथ proteinase कश्मीर के 20 µ एल जोड़ें ।
  3. एक एयर मशीन के साथ रात भर 56 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की मशीन ।
  4. 1 एच और 10 मिनट, क्रमशः के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 90 डिग्री सेल्सियस पर FFPE और टिक नमूनों की मशीन । संक्षेप में एक मिनी केंद्रापसारक के साथ कमरे के तापमान पर 5 एस के लिए 1,500 x जी में microcentrifuge ट्यूब नीचे स्पिन ।
  5. एक 200-µ l पिपेट के साथ नमूने के लिए lysis बफर के 200 µ एल जोड़ें और 5 एस के लिए अधिकतम गति पर भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
  6. एक 200-µ l पिपेट के साथ इथेनॉल के 200 µ एल जोड़ने के लिए और 5 एस के लिए अधिकतम गति पर भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । संक्षेप में एक मिनी के साथ कमरे के तापमान पर 5 एस के लिए 1,500 x जी में microcentrifuge ट्यूब नीचे स्पिन ।
  7. ध्यान से एक 1,000 µ l पिपेट के साथ स्पिन कॉलम के लिए पूरे lysate हस्तांतरण और 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 6,000 x g पर केंद्रापसारक ।
  8. दस्ताने हाथ के साथ एक साफ 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन कॉलम प्लेस, और संग्रह एक प्लास्टिक निपटान बॉक्स में प्रवाह के माध्यम से युक्त ट्यूब त्यागें ।
  9. एक 1,000-µ एल पिपेट के साथ स्पिन कॉलम को धोने बफर के 500 µ एल जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 6,000 x जी पर केंद्रापसारक ।
  10. दस्ताने हाथ के साथ एक साफ 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन कॉलम प्लेस, और संग्रह एक प्लास्टिक निपटान बॉक्स में प्रवाह के माध्यम से युक्त ट्यूब त्यागें ।
  11. एक 1,000-µ एल पिपेट के साथ स्पिन कॉलम को धोने बफर के 500 µ एल जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 6,000 x जी पर केंद्रापसारक ।
  12. एक प्लास्टिक निपटान बॉक्स में प्रवाह के माध्यम से युक्त संग्रह ट्यूब त्यागें । दस्ताने हाथों के साथ एक साफ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्पिन कॉलम प्लेस और 25 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 20,000 x g पर झिल्ली शुष्क करने के लिए केंद्रापसारक ।
  13. एक डीएनए में स्पिन कॉलम प्लेस-दस्ताने हाथों के साथ कम बाध्यकारी ट्यूब ।
    1. एक 100-µ एल पिपेट के साथ झिल्ली के केंद्र के लिए एक रेफरेंस बफर के 40-50 µ एल जोड़ें ।
    2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन और 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 20,000 x g पर केंद्रापसारक ।
    3. अगले कदम (प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है) तक-20 ° c पर डीएनए नमूने स्टोर ।

4. मात्रात्मक रीयल टाइम पीसीआर द्वारा डीएनए गुणवत्ता का आकलन

  1. एक पिपेट के साथ एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में मास्टर मिश्रण तैयार करें, इस प्रकार है: 10 µ एल के 2x वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिक्स, 1 µ एल के 20x RNase पी प्राइमर-जांच मिश्रण (amplicon आकार: 87 बीपी), और 8 µ के एल बाँझ nuclease-मुक्त पानी ।
  2. इस प्रकार के रूप में एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में दूसरा मास्टर मिश्रण तैयार: 2x वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिक्स के 10 µ एल, 1 µ एल के 20x RNase पी प्राइमरी-जांच मिश्रण (amplicon आकार: 268 बीपी), और 8 µ एल के बाँझ nuclease-मुक्त पानी ।
  3. मानव नियंत्रण जीनोमिक डीएनए के धारावाहिक कमजोरियां प्रदर्शन (किट में आपूर्ति) एक पांच सूत्री मानक वक्र के लिए 4 बार और पूर्ण डीएनए सांद्रता13निर्धारित करते हैं ।
  4. दो तैयार मास्टर घोला जा सकता है की 19 µ एल जोड़ें (4.1 और 4.2 कदम में तैयार) एक 20-µ l पिपेट के साथ एक ऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट के अलग कुओं में ।
  5. एक 2-µ l पिपेट के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त कुओं को अलग करने के लिए FFPE डीएनए या टिक डीएनए के 1 µ एल जोड़ें । एक अलग अच्छी तरह से कोई टेम्पलेट नियंत्रण के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त में nuclease-मुफ्त पानी की 1 µ एल जोड़ें.
  6. एक ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म के गैर चिपकने वाला पक्ष पकड़ो और वापस छील फिल्म के केंद्र से सुरक्षात्मक समर्थन । धीरे से फिल्म के ऊपर applicator खींचें और 96-खैर प्लेट पर फिल्म सील ।
  7. धीरे 96-अच्छी तरह से एक 96-अच्छी प्लेट मिक्सर का उपयोग कर 2000 rpm पर कमरे के तापमान पर 10 एस के लिए थाली मिश्रण । कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 1000 x g पर संक्षेप में प्लेट केंद्रापसारक ।
  8. रीयल-टाइम पीसीआर यंत्र पर बिजली और 96-वेल प्लेट डालें । पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए निंनलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग: 95 ° c 20 एस के लिए, 1 एस के लिए 95 ° c के 45 चक्र और 60 डिग्री सेल्सियस के बाद 20 एस के लिए उपयोग "मानक वक्र" और "फास्ट मोड."
  9. डीएनए के अनुपात के साथ डीएनए विखंडन का आकलन (सापेक्ष ठहराव; RQ) ने अल् amplicon (87 बीपी) को लांग amplicon (268 बीपी) के लिए प्राप् त किया । RQ का निकृष्ट मूल्य है लम्बा amplicon/कम amplicon13का निकृष्ट मूल्य ।

5. अगली पीढ़ी के sequencing पुस्तकालय की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार अगली पीढ़ी sequencing के लिए sequencing लाइब्रेरी तैयार करें ।
  2. इस प्रकार के रूप में एक नमूना प्रति बाँझ microcentrifuge ट्यूब में मल्टीप्लेक्स पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार: 4 5x मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान के µ एल, 5x प्राइमर पूल के 4 µ एल, ≤ 6 µ एल टिक या FFPE डीएनए (1-100 एनजी), और nuclease-मुफ्त पानी जोड़ने के लिए 20 µ एल
    1. मल्टीप्लेक्स पीसीआर मास्टर मिक्स को एक पीसीआर ट्यूब में डालें और ट्यूब पर टैप करके धीरे से मिक्स करें ।
    2. संक्षेप में एक मिनी केंद्रापसारक के साथ कमरे के तापमान पर 5 एस के लिए 1,500 x जी में microcentrifuge ट्यूब नीचे स्पिन ।
  3. पीसीआर प्रतिक्रियाओं भागो निंनलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग: 99 ° c 2 मिनट के लिए, 15 एस के लिए 99 ° c के 20 चक्र और 4 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के बाद, और 10 ° c चरण पकड़े । संक्षेप में, कमरे के तापमान पर 5 एस के लिए 1,500 x g पर एक मिनी के साथ पीसीआर ट्यूब नीचे स्पिन ।
    नोट: प्राइमरी जोड़े की संख्या के आधार पर चक्रों की संख्या निर्धारित करें ।
  4. पीसीआर ट्यूब के ढक्कन खोलें, और 2-µ l पिपेट के साथ प्रतिबंध एंजाइम के 2 µ एल जोड़ें । पीसीआर ट्यूब के ढक्कन बंद कर दें और पीसीआर ट्यूब टैप करके धीरे से मिलाएं । संक्षेप में, कमरे के तापमान पर 5 एस के लिए 1,500 x g पर एक मिनी के साथ पीसीआर ट्यूब नीचे स्पिन ।
  5. निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं चलाएँ: 10 मिनट के लिए 50 ° c, 10 मिनट के लिए 55 ° c, 20 मिनट के लिए 60 ° c, और 10 ° c चरण पकड़े. संक्षेप में, कमरे के तापमान पर 5 एस के लिए 1,500 x g पर एक मिनी के साथ पीसीआर ट्यूब नीचे स्पिन ।
  6. इस प्रकार के रूप में एक पिपेट के साथ पच पीसीआर amplicons एक अच्छी तरह से युक्त में अनुकूलक बंधाव मास्टर मिश्रण जोड़ें: 4 µ l के अनुकूलक बंधाव सॉल्यूशन, बारकोड के 0.5 µ l, अनुकूलक के 0.5 µ l, µ के 2 nuclease l का मुफ्त पानी, और DNA µ के 2 ligase l. पीसीआर ट्यूब के ढक्कन बंद करें और दोहन से धीरे मिश्रण । संक्षेप में, कमरे के तापमान पर 5 एस के लिए 1,500 x g पर एक मिनी के साथ पीसीआर ट्यूब नीचे स्पिन ।
  7. निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं चलाएँ: 22 ° c के लिए 30 मिनट, 68 ° c 5 मिनट, 5 मिनट के लिए 72 ° c के लिए, और 10 ° c चरण पकड़े ।
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार चुंबकीय मोतियों के साथ अनुक्रमण पुस्तकालय शुद्ध ।
  9. अनुकूलक-ligated पुस्तकालय समाधान 1.5-एमएल डीएनए कम बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरण । 1st शुद्धि के लिए डीएनए कम-बाइंडिंग ट्यूब में चुंबकीय मोतियों की 45 µ एल जोड़ें । ट्यूब और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन दोहन से धीरे मिश्रण ।
  10. एक चुंबकीय रैक में डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब प्लेस, तो समाधान स्पष्ट है जब तक कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन । चुंबकीय मोतियों को परेशान किए बिना एक 200-µ l पिपेट के साथ supernatant को ध्यानपूर्वक छोड़ें ।
  11. 200-µ l पिपेट के साथ हौसले से तैयार 70% इथेनॉल के 150 µ l को जोड़ें, फिर मोतियों को धोने के लिए ट्यूब साइड को चुंबक की तरफ ले जाएं । ध्यान से चुंबकीय मोती परेशान बिना supernatant त्यागें ।
  12. एक दूसरे धोने के लिए चरण 5.11 दोहराएँ ।
  13. संक्षेप में छोटे के साथ ट्यूब नीचे स्पिन 5 के लिए 1,500 x जी में कमरे के तापमान पर एस । एक चुंबकीय रैक में डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब प्लेस, और ध्यान से एक 10-µ एल पिपेट के साथ इथेनॉल बूंदें त्यागें ।
  14. डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब चुंबकीय मोती गोली से युक्त में कम ते के 50 µ एल जोड़ें मोतियों को फैलाने के लिए । कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन ।
  15. एक चुंबकीय रैक में डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब प्लेस, और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन जब तक समाधान स्पष्ट है ।
  16. नए डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब में supernatant के 50 µ एल स्थानांतरण और 2एनडी शुद्धि के लिए एक 100 µ एल पिपेट के साथ चुंबकीय मोतियों की 75 µ एल जोड़ें । ट्यूब और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन दोहन से धीरे मिश्रण ।
  17. एक चुंबकीय रैक में डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब प्लेस, तो समाधान स्पष्ट है जब तक कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन । चुंबकीय मोतियों को परेशान किए बिना एक 200-µ l पिपेट के साथ supernatant को ध्यानपूर्वक छोड़ें ।
  18. 200-µ l पिपेट के साथ हौसले से तैयार 70% इथेनॉल के 150 µ l को जोड़ें, फिर मोतियों को धोने के लिए ट्यूब साइड को चुंबक की तरफ ले जाएं । ध्यान से चुंबकीय मोती परेशान बिना supernatant त्यागें ।
  19. एक दूसरे धोने के लिए चरण ५.१८ दोहराएँ ।
  20. संक्षेप में एक मिनी के साथ ट्यूब नीचे स्पिन 5 कमरे के तापमान पर एस के लिए 1,500 x जी में । एक चुंबकीय रैक में डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब प्लेस, और ध्यान से एक 10-µ एल पिपेट के साथ इथेनॉल बूंदें त्यागें ।
  21. डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब चुंबकीय मोती गोली से युक्त में कम ते के 50 µ एल जोड़ें मोतियों को फैलाने के लिए । कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन ।
  22. एक चुंबकीय रैक में डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब प्लेस, और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन जब तक समाधान स्पष्ट है ।
  23. एक 100-µ l पिपेट के साथ नए डीएनए कम बाइंडिंग ट्यूब में शुद्ध पुस्तकालय युक्त supernatant के 45 µ एल हस्तांतरण.

6. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा पुस्तकालय एकाग्रता को बढ़ाता है

  1. निर्माता के निर्देश के अनुसार प्रत्येक पुस्तकालय की एकाग्रता का निर्धारण13.
    1. इस प्रकार एक 20-गुना कमजोर पड़ने समाधान तैयार करें: शुद्ध पुस्तकालय के 2 µ l को मिलाएं और 2-µ l और 100-µ l पिपेट के साथ एक डीएनए कम-बाइंडिंग ट्यूब में nuclease-मुफ्त पानी की 38 µ l
    2. -20 ° c चरण 7.3 तक पतला पुस्तकालयों की दुकान ।
  2. एक 200 गुना कमजोर पड़ने समाधान के रूप में तैयार करें: 20 गुना पतला शुद्ध पुस्तकालय के 5 µ एल मिश्रण (6.1 चरण में तैयार) और 45 nuclease के µ एल-एक डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब में मुफ्त पानी ।
  3. एक 2,000 गुना कमजोर पड़ने समाधान तैयार इस प्रकार है: मिश्रण 5 200 गुना पतला शुद्ध पुस्तकालय के µ एल (6.2 चरण में तैयार) और 45 nuclease के µ एल-एक डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब में मुफ्त पानी ।
  4. इस प्रकार के रूप में प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण तैयार: 2x मास्टर मिश्रण समाधान के 10 µ एल मिश्रण और 20x प्राइमर के 1 µ एल-एक पिपेट के साथ बाँझ microcentrifuge ट्यूब में जांच परख समाधान, तो ट्यूब दोहन से मिश्रण. एक ऑप्टिकल 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया के कुओं में प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण के 11 µ एल जोड़ें ।
  5. 2,000 गुना पतला पुस्तकालय के 9 µ एल जोड़ें, प्रत्येक मानक नियंत्रण के 9 µ एल, या nuclease के 9 µ एल-एक 10-µ एल पिपेट के साथ अच्छी तरह से मुक्त पानी ।
  6. ऑप्टिकल चिपकने वाला फिल्म के गैर चिपकने वाला पक्ष पकड़ो और वापस छील फिल्म के केंद्र से सुरक्षात्मक समर्थन ।
    1. धीरे से फिल्म के ऊपर applicator खींचें और 96-खैर प्लेट पर फिल्म सील ।
    2. धीरे कमरे के तापमान पर 10 एस के लिए एक 96-अच्छी तरह से प्लेट मिक्सर का उपयोग कर 96 अच्छी तरह से थाली मिश्रण ।
    3. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 1000 x g पर संक्षेप में प्लेट केंद्रापसारक ।
  7. रीयल-टाइम पीसीआर यंत्र पर बिजली और 96-वेल प्लेट डालें । पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए निंनलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग: 50 ° c 2 मिनट के लिए, 95 ° c के लिए 20 s, के लिए 95 ° c के 40 चक्र के बाद 1 s और 60 ° c के लिए 20 s. का प्रयोग करें "मानक वक्र" और "फास्ट मोड."
  8. 2,000 से qPCR के साथ निर्धारित एकाग्रता गुणा द्वारा unपतला पुस्तकालय एकाग्रता की गणना ।

7. अगली पीढ़ी sequencing

  1. भागो शर्त की योजना और सॉफ्टवेयर के भीतर भागो पैरामीटर सेट ।
    1. क्लिक करें [योजना टैब] और [टेंपलेट], और उपयुक्त चलाएं विधि का चयन ।
    2. अनुप्रयोग और तकनीक का प्रकार चुनें, और [अगला] क्लिक करें ।
    3. साधन का चयन करें, नमूना तैयारी किट (वैकल्पिक), पुस्तकालय किट प्रकार, टेम्पलेट किट, अनुक्रमण किट, बेस अंशांकन मोड, चिप प्रकार, नियंत्रण अनुक्रम (वैकल्पिक), और बारकोड सेट, और क्लिक करें [अगला].
    4. plugins चुनें और क्लिक करें [अगला] ।
    5. प्रोजेक्ट चुनें और [अगला] क्लिक करें ।
    6. लक्षित क्षेत्र के डिफ़ॉल्ट संदर्भ और बिस्तर फ़ाइलों का चयन करें ।
    7. नमूना नाम टाइप करें, बारकोड का चयन करें, और [योजना चलाएँ]
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक स्वचालित साधन में टेम्पलेट तैयारी और चिप लोड करने. उपयोग करने से पहले 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक एजेंट कारतूस गल ।
  3. पतला पुस्तकालय nuclease-मुफ्त पानी के साथ पुस्तकालय एकाग्रता की गणना में 6.8 कदम और 20 प्रधानमंत्री पुस्तकालयों के अनुसार ।
    1. अनुक्रमण और बर्फ पर स्टोर के लिए एक पूल में पुस्तकालय तैयार ।
    2. नमूना ट्यूब के नीचे करने के लिए एक 100 µ एल पिपेट के साथ परित पुस्तकालय के 25 µ एल जोड़ें । 48 ज के भीतर परित लाइब्रेरी का उपयोग करें ।
  4. पर बिजली और स्वचालित उपकरण के कवर खुला ।
    1. sequencing चिप, चिप अनुकूलक, संवर्धन कारतूस, टिप कारतूस, पीसीआर प्लेट, पीसीआर फ्रेम सील, वसूली ट्यूब, समाधान कारतूस, और स्वचालित साधन की उचित स्थिति के लिए रिएजेंट कारतूस प्लेस ।
    2. टच [भागो सेट] और [कदम से कदम] स्क्रीन पर ।
    3. आवरण को बंद करें और स्क्रीन पर [प्रारंभ करें चेक] स्पर्श करे ।
    4. डेक स्कैन प्रक्रिया के बाद, स्क्रीन पर [अगला] स्पर्श करें ।
    5. प्रदर्शन सामग्री की जांच करें (किट प्रकार, चिप प्रकार, चिप आईडी, नमूना आईडी, योजनाओं), समय निर्धारित करते हैं, और टच [ठीक] स्क्रीन पर ।
  5. चिप लोडिंग खत्म करने के बाद:
    1. स्क्रीन पर [अगला] स्पर्श करें और आवरण खोलें ।
    2. दस्ताने हाथों के साथ चिप अनुकूलक से sequencing चिप उतारा ।
    3. चिप कंटेनर में चिप प्लेस, parafilm के साथ रैप और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक अनुक्रमण प्रतिक्रिया ।
    4. संवर्धन कारतूस, पीसीआर प्लेट, पीसीआर फ्रेम सील, वसूली ट्यूब, समाधान कारतूस, और दस्ताने हाथों के साथ स्वचालित उपकरण के उचित स्थान से एजेंट कारतूस हटा दिया ।
    5. दस्ताने हाथों के साथ स्वचालित उपकरण के अपशिष्ट टिप स्थिति के लिए एक खाली टिप कारतूस हस्तांतरण ।
    6. टच [अगला] और कवर बंद ।
    7. टच [प्रारंभ] और 4 मिनट के लिए पराबैंगनी किरणों द्वारा स्वचालित साधन साफ ।
  6. एक 0.22-µm फिल्टर फ्लो फिल्टर इकाई के साथ ultrapure पानी और फिल्टर समाधान के 1,000 मिलीलीटर में एक सोडियम क्लोराइड गोली भंग ।
    1. sequencing साधन पर पावर ।
    2. टच [स्वच्छ] और [अगले] sequencing साधन की स्क्रीन पर ।
    3. फिल्टर-निष्फल सोडियम क्लोराइड समाधान के 250 मिलीलीटर और बाद में ultrapure पानी की 250 मिलीलीटर के साथ अनुक्रमण साधन को साफ करें ।
  7. स्पर्श [प्रारंभ] और स्क्रीन पर उपयुक्त sequencing किट का चयन करें ।
    1. दस्ताने हाथों के साथ उपयुक्त स्थान पर एक ग्रे वणिक स्थापित करें ।
    2. (किट में प्रदान की), पीएच समायोजन समाधान (100 मिमी सोडियम हीड्राकसीड के 350 µ एल युक्त), और पीएच मानक समाधान (किट में उपलब्ध कराई) धोने समाधान के साथ अनुक्रमण साधन शुरू ।
  8. dATP, dGTP, dCTP, और dTTP न्यूक्लियोटाइड के 20 µ एल जोड़ें (किट में प्रदान की) 50 मिलीलीटर ट्यूबों (किट में प्रदान की) के साथ एक 100-µ l पिपेट ।
    1. दस्ताने हाथों के साथ उपयुक्त स्थान पर एक ग्रे वणिक स्थापित करें ।
    2. sequencing साधन पर 50 मिलीलीटर ट्यूब और पेंच लोड ।
    3. स्क्रीन पर [अगला] स्पर्श प्रारंभिक चरण है, जो लगभग 25 मिनट लगते है शुरू करने के लिए ।
  9. प्रारंभिक चरण पूरा करने के बाद:
    1. टच [भागो] स्क्रीन पर और उपयुक्त पुस्तकालय तैयारी साधन का चयन करें ।
    2. चिप के दो आयामी बारकोड स्कैन करें ।
    3. उपयुक्त स्थिति पर sequencing चिप सम्मिलित करें ।
    4. बंद चिप दबाना और साधन दरवाजा ।
    5. टच [चिप चेक], [अगले], और [ठीक] स्क्रीन पर sequencing चलाने शुरू करने के लिए ।
  10. sequencing प्रतिक्रिया के बाद, डेटा स्थानांतरित करें और sequencing सर्वर13,17पर डेटा-विश्लेषण पाइपलाइन निष्पादित करें ।

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Representative Results

चित्रा 1 डीएनए निष्कर्षण के लिए टिक नमूनों की तैयारी से पूरी प्रक्रिया से पता चलता है । विशेष रूप से, प्रक्रिया केवल दो दिनों के लिए टिक नमूनों से जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए लेता है । हम स्लाइड प्रसंस्करण से पहले ट्यूमर भंडारण के किसी भी प्रभाव का मूल्यांकन किया । हमने पाया है कि ट्यूमर कोशिकाओं को कांच की स्लाइड पर संलग्न जब ऊतक नमूनों को तुरंत स्लाइड पर छुआ गया था, और जब ऊतकों खारा गीला बाँझ में रखा गया था-1 घंटे (चित्रा 2) के लिए धुंध । हालांकि, जब ऊतकों को कमरे के तापमान पर रखा गया था, तो ट्यूमर कोशिकाएं स्लाइड से अच्छी तरह से जुड़ी नहीं थीं । तैयार की गई स्लाइड्स को तीन महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों को शुष्क करने की अनुमति नहीं है ।

हम हमारे विधि की उपयोगिता की जांच की और यह FFPE का उपयोग कर प्राप्त नमूनों के साथ तुलना करें । टिक और FFPE नमूने 14 ट्यूमर नमूनों से तैयार थे, और हम पुष्टि की है कि ट्यूमर सामग्री और पवित्रता टिक नमूनों से मूल्यांकन किया जा सकता है । के बाद हम Giemsa धुंधला प्रदर्शन, ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या और ट्यूमर आकृति विज्ञान माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. हम इस प्रकार नियमित रूप से ट्यूमर कोशिकाओं का मूल्यांकन करने में सक्षम थे और बाद में एक डीएनए गुणवत्ता की जांच करते हैं ।

डीएनए मात्रा और गुणवत्ता मात्रात्मक रीयल टाइम पीसीआर13,14,15द्वारा अनुमानित थे । हम निरपेक्ष डीएनए मात्रा और RQ मूल्य है, जो जीनोमिक डीएनए के क्षरण स्तर का एक संकेतक है निर्धारित किया है । परिणाम से पता चला कि एक उच्च डीएनए उपज FFPE नमूनों (तालिका 1) के साथ तुलना में टिक नमूनों का उपयोग कर हासिल किया गया था । इसके अलावा, टिक डीएनए के RQ मूल्यों FFPE डीएनए (चित्रा 3, पी = 2.3 एक्स 10-8, दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण) के साथ तुलना में काफी अधिक थे । हम भी अलग ट्यूमर प्रकार से निकाले गए टिक और FFPE डीएनए के RQ मूल्यों का आकलन किया और पाया कि टिक डीएनए FFPE डीएनए की तुलना में गुणवत्ता में उच्च था (चित्रा 3) । इन परिणामों ने संकेत दिया कि टिक डीएनए FFPE डीएनए से कम खंडित था ।

हम अगले मूल्यांकन कि क्या टिक डीएनए अगली पीढ़ी अनुक्रमण विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । FFPE और टिक डीएनए प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर और मेटास्टेटिक लीवर कैंसर से एक रोगी (चित्रा 4a) से प्राप्त तैयार थे । पीसीआर प्रवर्धन और पुस्तकालय की तैयारी कैंसर हॉटस्पॉट पैनल और बाद में लक्षित अनुक्रमण का उपयोग कर आयोजित किया गया था । नतीजतन, APC Q1367 * दोनों FFPE और टिक 1 साइट (तालिका 2) से निकाले डीएनए में पहचान की थी । इसके अलावा, APC S1356 *, KRAS G12D, और TP53 M237I दोनों FFPE और टिक 2 साइट, 3, और 4 (तालिका 2) से निकाले डीएनए में पाए गए । इन परिणामों का सुझाव दिया है कि समान दैहिक उत्परिवर्तनों युग्मित FFPE और टिक डीएनए एक ही ट्यूमर साइट से तैयार नमूनों में पहचान की गई (चित्रा 4B और 2 तालिका) । विशेष रूप से, एक ही दैहिक उत्परिवर्तनों प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर के बीच का पता लगाया (2 साइट नहीं, 1 साइट नहीं) और दो मेटास्टेटिक जिगर के कैंसर के नमूने थे, सुझाव है कि 2 साइट से ट्यूमर क्लोन जिगर को metastasize (चित्रा 4B और 2 तालिका) । एक साथ इन निष्कर्षों का सुझाव है कि टिक डीएनए उच्च गुणवत्ता है और अगली पीढ़ी अनुक्रमण सहित आनुवंशिक परीक्षण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है ।

Figure 1
चित्रा 1. एक टिक नमूना तैयारी से डीएनए प्राप्त करने के लिए योजनाबद्ध. ट्यूमर ऊतक स्लाइड ग्लास पर छुआ है टिक नमूना तैयार करने के लिए । एक खुर्दबीन के नीचे ट्यूमर आकृति विज्ञान और सामग्री के आकलन के बाद, ट्यूमर डीएनए निकाला जा सकता है और आनुवंशिक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया । टिक का उपयोग करके, ट्यूमर डीएनए दो दिनों के भीतर एक नैदानिक रोग नमूना से प्राप्त किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. टिक नमूनों की तैयारी । संप्रदाय ट्यूमर नमूने तुरंत एक सामांय गिलास स्लाइड (बाएं पैनल) पर छुआ, खारा में रखा गया बाँझ-1 (मध्य) के लिए धुंध गीला कर रहे थे, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखा (सही) । सैंपल #1 hepatocellular कार्सिनोमा था और सैंपल #2 ब्रेस्ट कैंसर था । सूक्ष्म चित्र एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर एक खुर्दबीन पर चढ़कर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार: 100 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण द्वारा अनुमानित डीएनए गुणवत्ता की जांच । टिक और FFPE डीएनए कोलोरेक्टल (एन = 8), पेट (n = 4), और मेटास्टेटिक लीवर कैंसर (n = 2) से 14 ट्यूमर के ऊतकों से निकाले गए थे । टिक-Giemsa और FFPE-वह नमूनों के बीच सापेक्ष ठहराव स्कोर की तुलना । टिक डीएनए के RQ मूल्यों FFPE डीएनए की तुलना में काफी अधिक थे । दो समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था और p-मानों की गणना Excel के उपयोग से दो-पुच्छ छात्र के t परीक्षण द्वारा की गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. अगली पीढ़ी अनुक्रमण विश्लेषण टिक और FFPE डीएनए का उपयोग कर डेटा । (क) Macroscopic और सूक्ष्म बिंब. टिक-Giemsa और FFPE के प्रतिनिधि छवियां-वह कोलोरेक्टल कैंसर से धुंधला (1 साइट और 2) और मेटास्टेटिक लिवर कार्सिनोमा नमूने (साइट 3 और 4) । macroscopic छवियों में स्केल बार: 1 सेमी, सूक्ष्म छवियों में स्केल बार: 100 µm. (ख) हीट प्रत्येक ट्यूमर साइट (n = 8) के लिए दैहिक उत्परिवर्तनों के वितरण दिखा नक्शा । युग्मित टिक और FFPE डीएनए नमूनों के बीच समान उत्परिवर्तनों का पता लगाया गया । allelic अंशों का मान 1% (हल्का गुलाबी) से 100% (गुलाबी) से ग्रैजुएशन कलर स्केल में दर्शाया गया है । ग्रे कॉलम कोई पहचान उत्परिवर्तन दिखाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

टिक-Giemsa (n = 14) FFPE-वह (n = 14)
कुल डीएनए (एनजी) कुल डीएनए (एनजी)
नमूना ट्यूमर साइट कम लंबी rq कम लंबी rq
Site1 बृहदांत्र १४९५ १२४७ ०.८३ ९३९ 349 0.37
Site2 बृहदांत्र ९९१ १०५७ 1.07 556 204 0.37
Site3 जिगर 467 511 १.०९ 130 39 0.3
Site4 जिगर २१७२ २११५ ०.९७ 488 127 ०.२६
Site5 बृहदांत्र 749 598 0.8 529 205 ०.३९
Site6 पेट 330 286 ०.८६ 211 ९८ ०.४६
Site7 पेट 636 499 ०.७८ 154 84 0.55
Site8 पेट 27 27 1.01 135 81 0.6
Site9 बृहदांत्र 1986 १६११ ०.८१ 476 163 ०.३४
Site10 बृहदांत्र 280 218 ०.७८ 209 83 ०.३९
Site11 बृहदांत्र १५४६ 575 0.37 366 159 0.43
Site12 पेट १५०१ 1200 0.8 274 132 ०.४८
Site13 बृहदांत्र 1556 १४०४ 0.9 326 179 0.55
Site14 बृहदांत्र १५६५ १२१० ०.७७ 680 295 0.43
मतलब ± एसडी 1093 ± 682 600-300 ± 0.85 ± 0.18 391 ± 253 157 ± 86 0.42 ± 0.10

तालिका 1. डीएनए गुणवत्ता डेटा । युग्मित टिक (n = 14) और FFPE नमूनों (n = 14) बृहदांत्र, जिगर, और पेट के कैंसर से तैयार थे । टिक नमूने Giemsa के साथ दाग थे, और FFPE नमूने hematoxylin और eosin (वह) के साथ दाग थे । डीएनए नमूने निकाले गए थे और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा quantified दो प्राइमरी जोड़ियों के साथ RNaseP लोकस (लांग amplicon (268 bp) और शॉर्ट amplicon (87 बीपी)) बढ़ाना । RQ मूल्यों का पालन के रूप में गणना कर रहे थे: लंबे amplicon विभाजित bythe का मतलब मूल्य कम amplicon का मतलब मान । एसडी, मानक विचलन; RQ, रिश्तेदार quantitation

नमूना नाम स्थान तैयारी जीन प्रतीक उत्परिवर्तन स्थिति संदर्भ वैरिएंट कोडिंग कवरेज Allelic अंश
प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर साइट 1 FFPE apc Q1367 * chr5:112175390 सी टी c. 4099C > T 1999 ४५ टक्के
प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर साइट 1 टिक apc Q1367 * chr5:112175390 सी टी c. 4099C > T 1011 ७२%
प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर साइट 2 FFPE apc S1356 * chr5:112175358 सी एक c. 4067C > A 1968 ७७ टक्के
प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर साइट 2 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 सी टी c. 35G > A १९९३ ५२ टक्के
प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर साइट 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 सी एक c. 711G > T 1991 ७३ टक्के
प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर साइट 2 टिक apc S1356 * chr5:112175358 सी एक c. 4067C > A 1967 89%
प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर साइट 2 टिक KRAS G12D chr12:25398284 सी टी c. 35G > A १९९४ ५६ टक्के
प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर साइट 2 टिक TP53 M237I chr17:7577570 सी एक c. 711G > T १९९५ 86%
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 3 FFPE apc S1356 * chr5:112175358 सी एक c. 4067C > A १९७४ 92%
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 3 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 सी टी c. 35G > A १९९५ ६२ टक्के
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 सी एक c. 711G > T १२९६ 91%
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 3 टिक apc S1356 * chr5:112175358 सी एक c. 4067C > A १९६४ 97%
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 3 टिक KRAS G12D chr12:25398284 सी टी c. 35G > A १९९३ ६४ टक्के
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 3 टिक TP53 M237I chr17:7577570 सी एक c. 711G > T 1998 ९५ टक्के
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 4 FFPE apc S1356 * chr5:112175358 सी एक c. 4067C > A 1965 93%
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 4 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 सी टी c. 35G > A 1992 60%
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 सी एक c. 711G > T १९९३ 92%
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 4 टिक apc S1356 * chr5:112175358 सी एक c. 4067C > A १९६० 94%
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 4 टिक KRAS G12D chr12:25398284 सी टी c. 35G > A 1992 ६२ टक्के
मेटास्टेटिक लिवर कैंसर साइट 4 टिक TP53 M237I chr17:7577570 सी एक c. 711G > T १९९५ ९५ टक्के

तालिका 2. युग्मित FFPE और टिक डीएनए में उत्परिवर्तनों की तुलना लक्षित अनुक्रमण विश्लेषण द्वारा पता चला । युग्मित टिक और FFPE नमूने 2 प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर (साइट 1 और 2) और 2 मेटास्टेटिक यकृत कैंसर (साइट 3 और 4) से तैयार किया गया । लक्षित अनुक्रमण इन डीएनए के नमूनों के साथ प्रदर्शन किया और दैहिक उत्परिवर्तनों की पहचान की गई थी । उत्परिवर्तन प्रोफाइल युग्मित टिक और FFPE डीएनए के नमूनों के बीच समान थे ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम नैदानिक रोग नमूनों से टिक का उपयोग कर ट्यूमर डीएनए प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति प्रस्तुत किया । टिक तैयारी बहुत आसान है और FFPE तरीकों के साथ तुलना में कम समय की जरूरत है, विशेष उपकरणों के लिए आवश्यकता के बिना10. टिक तैयारी से डीएनए निष्कर्षण के लिए सभी प्रक्रियाओं को दो दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है (चित्र 1) । इस विधि इस प्रकार आनुवंशिक परीक्षण प्रदर्शन के लिए बदलाव समय छोटा । विशेष रूप से, यह आणविक विश्लेषण के लिए आवश्यक दिनों की संख्या को छोटा करने में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है । इस छोटे बदलाव समय हमें तुरंत प्रगतिशील कैंसर रोगियों जो आणविक लक्षित दवाओं की आवश्यकता के लिए एक उपयुक्त चिकित्सा की पेशकश करने के लिए अनुमति देता है । इस विधि इस प्रकार ट्यूमर और कैंसर थेरेपी के लिए आणविक रूप से लक्षित दवाओं के प्रशासन में आनुवंशिक परिवर्तन के विश्लेषण के लिए लाभ प्रदान करता है ।

वहां आनुवंशिक विश्लेषण के लिए टिक डीएनए का उपयोग करने की सफलता के लिए कुछ प्रमुख बिंदु हैं । ट्यूमर के ऊतकों क्योंकि कीमोथेरेपी या अन्य उपचार के रूप में उपचार की वजह से गल सकता है । इस प्रकार, सावधानी के रूप में ज्यादा संभव के रूप में ट्यूमर में गल वर्गों से नमूने से बचने के लिए टिक नमूनों की तैयारी में की जरूरत है । इसके अलावा, प्रारंभिक सूक्ष्म आकलन अनुवर्ती प्रक्रियाओं के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, ट्यूमर के ऊतकों के सूखने को रोकने के सफल टिक नमूना तैयारी के लिए आवश्यक है । यदि ट्यूमर के ऊतकों सूख रहे हैं, कांच स्लाइड पर कम संलग्न कोशिकाओं में यह परिणाम है । ट्यूमर के ऊतकों के अध कि सूख जाता है क्योंकि यह भी ट्यूमर सेलुलर और आकृति विज्ञान का पालन करने के लिए मुश्किल हो जाएगा ।

वहां टिक डीएनए का उपयोग करने के लिए कुछ संभावित लाभ कर रहे हैं । सबसे पहले, हम माइक्रोस्कोप के साथ पहले आकलन के दौरान ट्यूमर सेलुलर की जांच कर सकते हैं । यदि लिम्फोसाइटों और stromal कोशिकाओं के रूप में सामांय कोशिकाओं, ऊतक के नमूनों में प्रचुर मात्रा में थे, इन सामांय कोशिकाओं के संदूषण को ट्यूमर कोशिकाओं में दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने की क्षमता को रोकने जाएगा । नमूनों की त्वरित सूक्ष्म आकलन ट्यूमर सेलुलर और पर्याप्त ट्यूमर डीएनए नमूने डीएनए निष्कर्षण से पहले टिक नमूनों से प्राप्त किया गया था कि के आकलन के मूल्यांकन में मदद कर सकते हैं. दूसरा, हमारे परिणामों से पता चला है कि टिक डीएनए दोनों उच्च गुणवत्ता और मात्रा में है । FFPE डीएनए अगली पीढ़ी sequencing लक्षित अनुक्रमण सहित विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है, exome अनुक्रमण, और पूरे जीनोम अनुक्रमण16,17,18,19,20। अभिलेखीय FFPE डीएनए भी नियमित रूप से आनुवंशिक विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है21,22, लेकिन FFPE डीएनए formalin निर्धारण के दौरान खंडित किया जा सकता है । यह पीसीआर प्रवर्धन या डीएनए निष्कर्षण में समस्याओं में परिणाम कर सकते हैं, अनुक्रम कवरेज की कमी के कारण, लक्ष्य क्षेत्रों में एकरूपता, और अनुक्रम त्रुटि के जोखिम में वृद्धि23,24. इसके विपरीत, टिक डीएनए खंडित नहीं है, जो शराब निर्धारण कि न्यूक्लिक एसिड पर एक प्रभाव के कम है की वजह से हो सकता है । के रूप में टिक डीएनए FFPE डीएनए की तरह खंडित नहीं है, इन नमूनों अगली पीढ़ी अनुक्रमण विश्लेषण, वास्तविक समय पीसीआर, और डिजिटल पीसीआर के लिए और अधिक उपयुक्त हो जाएगा । दरअसल, हम पहले से पता चला है कि एक ट्यूमर नमूना से टिक डीएनए अगली पीढ़ी अनुक्रमण विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है, एक विधि बुलाया "टिक-seq", और परिणाम ठीक ट्यूमर दैहिक उत्परिवर्तनों13पर कब्जा कर सकता है । तीसरा, इस तकनीक सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है । वर्तमान रिपोर्ट में, हम शल्य नमूनों का इस्तेमाल किया । सर्जिकल ऊतकों के अलावा, मेटास्टेटिक लिम्फ नोड, दमा या इंडोस्कोपिक बायोप्सी टिक डीएनए की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

अंत में, हम उच्च गुणवत्ता ट्यूमर टिक नमूने का उपयोग डीएनए की तैयारी के लिए एक सरल और तेजी से विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि आनुवंशिक विश्लेषण के क्षेत्र में नई संभावनाओं का विस्तार और नैदानिक सेटिंग में परिशुद्धता दवा को बढ़ावा देने में मदद मिलेगी ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अस्पताल के सभी चिकित्सा और सहायक स्टाफ और मरीजों को भाग लेने के लिए सहमति के लिए धंयवाद । हम Gabrielle व्हाइट वुल्फ, पीएचडी, Edanz समूह (www.edanzediting.com/ac) से इस रिपोर्ट का एक मसौदा संपादन के लिए धंयवाद । इस अध्ययन के Yamanashi प्रांत (Y.H. और M.O.) और YASUDA मेडिकल फाउंडेशन (Y.H.) से एक अनुदान से जीनोम अनुसंधान परियोजना के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

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References

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स्पर्श छाप Cytology का उपयोग नैदानिक रोग नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूमर डीएनए प्राप्त करने के लिए सरल और तेजी से विधि
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Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., … More

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

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