In vivo fiberkoblet præklinisk konfokal laserscanning endomikroskopi (pCLE) af hippocampale kapillærer hos vågne mus

Summary

Mens multifotonbilleddannelse kun er effektiv på begrænsede dybder fra vævets overflade, er det muligt at opnå 3 μm opløsningsbilleddannelse i enhver dybde via pCLE. Her præsenterer vi en protokol til udførelse af pCLE-billeddannelse til måling af mikrovaskulær dynamik i hippocampus hos ictal og vildtypemus.

Abstract

Målet med denne protokol er at beskrive fiberoptisk bundtkoblet præklinisk konfokal laserscanning endomikroskopi (pCLE) i sin specifikke anvendelse til at belyse kapillære blodgennemstrømningseffekter under anfald, drevet af vægmalericeller. In vitro og in vivo kortikal billeddannelse har vist, at kapillære indsnævringer drevet af pericytter kan skyldes funktionel lokal neural aktivitet såvel som fra lægemiddelapplikation hos raske dyr. Her præsenteres en protokol om, hvordan man bruger pCLE til at bestemme mikrovaskulær dynamiks rolle i neural degeneration i epilepsi ved enhver vævsdybde (specifikt i hippocampus). Vi beskriver en nakkestøtteteknik, der er blevet tilpasset til at registrere pCLE hos vågne dyr for at imødegå potentielle bivirkninger af anæstetika på neural aktivitet. Ved hjælp af disse metoder kan elektrofysiologiske og billeddannelsesoptagelser udføres over flere timer i dybe neurale strukturer i hjernen.

Introduction

I modsætning til andre mikroskopiske billeddannelsesmetoder 1,2,3,4,5,6,7,8 tillader in vivo fiberoptisk baseret konfokal mikroskopi måling af blodgennemstrømningsdynamik i ethvert hjerneområde, i enhver dybde^, ved høj hastighed (op til 240 Hz afhængigt af synsfeltstørrelse 9 ). En fiberoptisk sonde muliggør in vivo konfokal laserscanningsbilleddannelse ved 3 μm opløsning, fordi spidsen af sonden (et linseløst mål, der består af et bundt af individuelle fibre med en diameter på 5000-6000 3 μm) kan placeres med en mikroelektrodes nøjagtighed inden for 15 μm fra det fluorescerende mål af interesse. Som med in vivo to-foton-billeddannelse skal fluoroforer tidligere introduceres i billeddannelsesmålet. For eksempel kan fluorescein dextran (eller kvantepunkter) injiceres i vaskulaturen, eller genetisk kodede fluorescerende proteiner kan transfekteres til celler, eller fluorescerende farvestoffer som Oregon Green BAPTA-1 kan bulk-loades i celler inden billeddannelse.

Nyere forskning ved hjælp af disse teknikker har fundet ud af, at vægmalericellemotoraktivitet, der fører til ictal kapillær vasospasmer - pludselige indsnævringer, der opstår ved vægmalericellernes position under anfald 9 - kan bidrage til neurodegeneration i ictal hippocampus⁹. Mens tidligere billeddannelsesundersøgelser viste in vitro og in vivo pericytkonstriktioner forbundet med lægemiddelapplikationer 6,7,10,11,12^, fandt Leal-Campanario et al. de første tegn på in vivo spontane kapillære indsnævringer i murinhjernen. For at fastslå relevans for human temporal lobe epilepsi studerede de mandlige (P30-40 gamle) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) mus ^14,15 (JAX stock #003532), en genetisk model af human episodisk ataksi type 1¹⁵. Pericytter drev både patologiske og fysiologiske hippocampus vægmaleri vasokonstriktioner⁹ i de spontant epileptiske dyr og deres vildtype (WT) kuldkammerater. Disse observationer blev gentaget i WT-dyr, der blev epileptiske med kainsyre, hvilket indikerer deres generalisering til andre former for epilepsi. Leal-Campanario et al fastslog desuden ved hjælp af nye stereologiske mikroskopimetoder, at apoptotiske - men ikke sunde - neuroner hos epileptiske dyr var rumligt koblet til hippocampus mikrovaskulaturen. Fordi excitotoksicitet ikke har nogen kendt rumlig tilknytning til vaskulaturen, indikerede dette resultat, at unormal kapillær vasospasmisk iskæmi-induceret hypoxi bidrager til neurodegeneration i epilepsi. Figur 1 viser et skema over den generelle opsætning.

Protocol

Protokollen følger NIH-retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr. Alle procedurer blev godkendt af Barrow Neurological Institute's Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Stereotaksisk positionering til kraniotomi

1. Vej og bedøm derefter musen med en ketamin-xylazin (100 mg / kg-10 mg / kg i.p.) cocktail. Sørg for, at dyret bedøves fuldt ud ved at observere dets manglende reaktion på hale og / eller tåklemme.
2. Placer en varmepude under musen, og brug et rektalt termometer til kontinuerligt at overvåge kropstemperaturen under den indledende bedøvede implantationsoperation (figur 2A).
3. Påfør oftalmisk salve for at forhindre øjentørhed.
4. Stabiliser dyrets hoved i en gnaver stereotaxisk ramme, udstyret med en museadapter. For korrekt orientering af musen i den stereotaksiske ramme skal du placere dyrets tænder inde i hullet på bidstangen (figur 2A og figur 3A, punkt g). Stram næseklemmen, indtil den sidder tæt (figur 2A, B og figur 3A, punkt h). Musens kropsplacering skal være så lige som muligt (som i figur 2A).
   1. Fastgør yderligere dyrets hoved ved hjælp af museørestænger med kæbeholdermanchetter (figur 2A og figur 3A, punkt i) for at klemme kraniets zygomatiske processer fast.
      BEMÆRK: Når musens hoved er sikret, bør det ikke have noget horisontalt bevægelsesområde.
5. Når musen er justeret til den stereotaksiske ramme (figur 3B, punkt j), rengøres og steriliseres hovedbunden ved at tørre den af med klor-hexedinskrubbe 2-3 gange, hver gang efterfulgt af en alkoholskylning. Påfør derefter topisk lidokain oven på hovedet.
6. Lav et snit langs midterlinjen fra bageste til forreste (start snit ved bunden af kraniet og fuldfør det mellem øjnene; 12-15 mm) langs den sagittale midterlinje af kraniet, ved hjælp af enten fin saks eller et blad. Træk hovedbundens kanter tilbage med fire 28 mm bulldog serrefine klemmer for at eksponere kraniet og maksimere arbejdsområdet (figur 2B og figur 3C).
7. Brug en skalpel eller mikrospatel (figur 3C) til at skrabe periosteum til snittets kanter. Brug vævsseparerende saks eller tang (figur 3C) til forsigtigt at trække musklerne bag på nakken tilbage (figur 2B).
8. Tør toppen af kraniet med en applikator med bomuldsspids, fugtet med alkohol eller 30% hydrogenperoxid, for at optimere visualiseringen af kraniesuturerne. Påfør saltvand på kraniet, når bindevævet er fjernet.
9. Når musens hoved er stabiliseret i stereotaksiapparatet, anbringes en sprøjtenålespids (21 G) i elektrodeholderen (figur 3B, punkt l), og elektrodeholderen fastgøres til stereotaksisk mikromanipulator, hvorved nålespidsen sænkes til kraniets niveau (figur 2D).
10. Juster kraniets mediale-laterale retning ved at måle kraniets højde i enhver afstand bagud til bregma (dvs. -2,0 mm) og to lige store afstande lateralt fra midterlinjen på hver side af kraniet (dvs. ± 1,5 mm) (figur 2D). Sigt efter en højdeforskel på tværs af steder, der er mindre end 0,05 mm i dorsal-ventral retning.
    1. Hvis den er større end 0,05 mm, skal du dreje musens kranium ved hjælp af bidestangen eller flytte musens hoved ved at løsne ørestængerne forsigtigt, sideværts skifte hoved og ørestænger efter behov og derefter stramme ørestængerne igen.
11. Når kraniet er placeret i den stereotaksiske enhed, skal du bestemme og registrere de stereotaktiske koordinater for bregma- og lambda-kranietsuturerne langs anteroposterior (AP), mediale laterale (ML) og dorsale ventrale (DV) akser.
12. Identificer målpunktet (højre hippocampus) ved hjælp af et stereotaksisk atlas. Find derefter på kraniet målpunktskoordinaterne i forhold til bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (figur 2E).
13. Brug en kirurgisk markør til at markere fire hjørner af et 1,4 mm x 2 mm billeddannelsesvindue på kraniet med prikker, centreret omkring målpunktet direkte over hippocampus (figur 2F) til efterfølgende kraniotomi.
14. Brug den kirurgiske markør til at tegne to yderligere prikker: en over den øverste venstre parietale knogle (figur 2G) og en anden over højre frontale knogle (figur 2H) for at indikere den fremtidige placering af to knogleskruer (figur 3A, punkt b), der vil forankre hovedhætten (figur 3B, punkt m) til kraniet.
15. Brug den kirurgiske markør til at tegne yderligere tre prikker, der angiver, hvor de epidurale EEG-registreringselektroder vil blive indsat: en prik placeret 1 mm til hver side af midterlinjen og en yderligere prik på midterlinjen placeret 1 mm bag lambda (figur 2E, figur 4A og figur 5B).

2. Installation af hovedhætte

1. Brug en grater med en diameter på 0,7 mm (figur 3C) til forsigtigt at bore to små huller i kraniet ved prikpositionerne, der angiver knogleskruernes placering (se trin 1.15 ovenfor). Tag derefter to knogleskruer (rustfrit stålslids, længde: 4 mm; diameter: 0,85 mm), der tidligere er desinficeret med ethanol 70-80%, og skru dem fast på kraniet for yderligere stabilitet i hovedhætten (figur 2I-J og figur 3A, punkt b).
   1. Sørg for, at skruespidserne ikke stikker ud over bunden af knoglen ind i kraniehulen og risikerer skade på hjernen. Bemærk, at en af de to knogleskruer vil være foran de to skruer med hovedhætte og den anden bageste til dem (figur 2G-J).
2. Sprøjt saltvand over kraniet for at køle det ned og rense det. Tør derefter kraniet helt og påfør et tyndt lag cyanoacrylat omkring skruerne.
3. Brug et brugerdefineret justeringsstykke (figur 3A, punkt c), der er fastspændt til mikrodrevet, der er monteret på stereotaksenheden (figur 2F-J og figur 3A, punkt d), så hovedhættens position er justeret langs midterlinjen med den forreste ryg over bregma. Dette specialfremstillede stykke rustfrit stål er L-formet (vinklet 90°) med to huller adskilt af 4 mm (figur 2F-J og figur 3A, punkt c).
   1. Brug stereotaksmanipulatoren til at placere det L-formede justeringsstykke med to Fillister-hovedslidsede drivskruer fastgjort (M1,6 x 0,35 metrisk grov, 12 mm længde; Figur 3A, punkt a) over bregmaen, indtil bunden af skruerne ligger fladt på kraniet, idet man er forsigtig med ikke at udøve pres på kraniet (figur 2I-J).
4. Påfør cyanoacrylat efterfulgt af tandcement for at fastgøre skruernes bund til kraniet. Pas på ikke at blokere referencemærkerne i billedvinduet over hippocampus (figur 2K).

3. Billeddannelse af vindueskraniotomikirurgi

1. Ved hver af positionerne af kraniotomireferencemærkerne, der angiver hjørnerne af billeddannelsesvinduet (se trin 1.14 ovenfor), bores et grathul med en diameter på 0,7 mm efterfulgt af forsigtigt at afgrænse periferien af 1,4 mm x 2 mm kraniotomivinduet med boret med iterativt dybere snit (figur 2L).
2. Pas på ikke at bore for dybt eller med for meget kraft på kraniet, som er tyndt og skrøbeligt og har en tykkelse på ca. 300 μm. Når knogleklappen er færdig, skal du lirke den løse klap op med spidsen af en skalpel, og vær opmærksom på ikke at beskadige den underliggende dura mater.
3. Dæk det åbne vindue med knoglevoks (figur 2M).
4. Brug en grater med en diameter på 0,9 mm til at bore tre huller til fremtidig placering af de epidurale EEG-elektroder (se trin 1.15 ovenfor), og pas på ikke at skære gennem dura mater (figur 2E, L).
5. Dæk de tre huller med knoglevoks.
6. Påfør forsigtigt cyanoacrylat rundt om kanterne af det knoglevoksdækkede billedvindue og EEG-huller, og pas på ikke at forsegle kraniotomierne (figur 2L).
7. Byg en væg af tandcement, der omfatter billedvinduet og EEG-hullerne og binder det til den tidligere cementerede hovedhætte (figur 2M og figur 3B, punkt m).
8. Lad cementen tørre i mindst 10 minutter.
9. Luk eventuelle løse sårmargener med enkle afbrudte suturer ved hjælp af 4-0 eller 5-0 sort flettet silke (figur 2N og figur 3C).

4. Efter operationen

1. Brug en applikator med bomuldsspids til at påføre lidokainsalve omkring den udsatte hud for at dæmpe fornemmelsen omkring sårets kant.
2. Brug en steril applikator med bomuldsspids til at påføre Neosporin på den udsatte hud.
3. Fjern dyret fra den stereotaksiske ramme (figur 2N).
4. Injicer ketoprofen (5 mg / kg) IP eller IM til postkirurgisk analgesi.
5. Overhold dyret, indtil det er opmærksomt og bevæger sig (dette vil normalt ske inden for få minutter).
6. Placer dyret i et varmt bur og fortsæt med at overvåge dets opsving, indtil det drikker eller spiser og er klar til at overføre til dyrehuse.
7. Kontroller dyret mindst en gang dagligt i ca. en uge efter operationen, og hold øje med tegn på sløv adfærd og/eller utilstrækkelig spisning/drikke (figur 2O).

5. Farvestofinjektion og EEG-optagelse

1. Vent mindst en dag efter implantationsoperationen med hovedhætten for at starte optagelserne.
2. Anbring musen i en skumfastholdelsesanordning, der er støbt til kroppen, inden for den stereotaksiske ramme (figur 3B, punkterne n & j).
3. Hovedhætten (figur 3 B-I, punkt m) fastgøres til en brugerdefineret monteringsstang, der er fastgjort til den stereotaksiske ramme (figur 3A, B, punkt e & j og figur 4A). Den lange del af punkt e (figur 3 A, B) skal have en længde mellem 9,4 - 13 mm. Fastgør element f (en monteringsplade med dimensioner 1,5 cm x 0,5 cm, med to huller adskilt 4 mm fra centrum til midt) til element e (figur 3A, B, punkt e, f og k). Dette justeringssystem placerer den vågne mus sikkert til den stereotaksiske ramme under billedbehandlingssessionerne (figur 4).
4. Indsæt de epidurale EEG-registreringselektroder (figur 5A), og placer jordelektroderne (hvide ledninger) i det bageste centrale hul og registreringselektroderne (røde ledninger) i det forreste venstre og højre hul (figur 2E, figur 4E og figur 5E). Placer hver af ledningerne i en L-form mellem kraniet og dura mater (figur 5C) for at optimere elektrisk kontakt.
5. Injicer halevenen med grøn fluorescein lysinfikserbar dextran (0,2 ml / 25 g legemsvægt af fluorescein 5% w / w) for at visualisere blodgennemstrømningen i hippocampus.
   1. For at øge udvidelsen af den centrale vene i musens hale før injektion skal du bruge en eller flere af følgende strategier: a) Påfør 70% ethanol på den centrale vene ved hjælp af en applikator med bomuldsspids; b) Dyp halen i varmt vand (35-40 °C) i 1-3 minutter; c) Udsæt halen for en varmelampe i et par minutter.
   2. Fastgør musens hale med to fingre og find den centrale vene, som ligger umiddelbart under huden. Indsæt kanylen (ultrafin insulinsprøjte med integreret kanyle 30G) med skråningen opad i venen, ca. halvvejs til to tredjedele fra bunden af halen. Hold nålen parallelt med halen under injektionen.
   3. Injicer farvestoffet langsomt og støt, og pas på at undgå ændringer i nålens eller halens position.
      BEMÆRK: Der må ikke være modstand, når sprøjtens stempel trykkes ned.
   4. Når injektionen er afsluttet, skal du trække nålen ud og trykke let på punkteringsstedet for at forsegle beholderen.
   5. Tillad koagulation at forekomme.

6. In vivo fiberoptisk bundtkoblet præklinisk konfokal laserscanning endomikroskopi (pCLE)

1. Umiddelbart efter haleveneinjektionen (trin 5.5.3 ovenfor) klemmes det 300 μm skrå fiberoptiske bundt (indeholdende 5000–7000 3 μm fibre i hvert bundt) i nedadgående retning til robotens stereotaksiske drevs mobile arm.
2. Fjern knoglevoksen fra kraniotomien.
3. Fjern dura ved hjælp af den bøjede spids af en sprøjtenål.
4. Ved hjælp af robotpositioneringssystemet skal du først flytte fibermålet til den passende anterior-posterior og venstre-højre stereotaxiske placering, med spidsen nulstillet i z-aksen på overfladen af cortex.
5. Start EEG-optagelsen (figur 5D).
6. Start konfokal laserscanning af fibermålets bagplan, efterfulgt direkte af langsomt faldende målet i z-aksen ved hjælp af robotmikrodrevets z-kontroller, indtil det når måldybden i hjernen (figur 4C). Se billedresultaterne i den mikroskopiske software, mens du falder.
   1. Hvis fiberspidsen er inden for måloptagelsesområdet X-Y-Z, og to eller flere fartøjer kommer ind i billedvinduets FOV, skal du stoppe nedstigningen og starte videooptagelser. Få live full-field time-lapse film af blodgennemstrømningen ved 11.7 Hz ved hjælp af Cellvizio Labs billedbehandlingssoftware. (Højere hastigheder kan opnås med et mindre synsfelt). Optagelser kan finde sted i 4-5 timer ad gangen, i sammenhængende dage, hvis det er nødvendigt.
7. Brug en 10 ml sprøjte med skrå siliciumslange fastgjort til spidsen af nålen, fodre dyret under optagelserne ved periodisk at tilvejebringe pasta lavet med musepiller malet med vand.
8. Ved afslutningen af billedbehandlingssessionen skal du afslutte optagelserne.
9. Fjern forsigtigt EEG-ledningerne og rengør dem med Tergazyme.
10. Fjern langsomt det fiberoptiske bundt fra dyrets hjerne ved at vende fiberen langs z-aksen for indrejse.
11. Frigør dyret fra hovedstolpen og kropsstøtterne.
12. Hvis det er relevant, følg de nødvendige eutanasi og vævsbehandlingsprotokoller for at visualisere blodkar og udføre immunhistokemi.
13. Hvis du planlægger at optage fra det samme dyr i en fremtidig session, skal du dække billeddannelsesvinduet med knoglevoks eller silastisk.

Representative Results

Vi udviklede disse metoder til at vurdere, om unormale pericytdrevne kapillære vasospasmer i hippocampus - der opstår som følge af anfald - kan forårsage ærlig hypoxi, der bidrager til celledød i ictal fokus ^9,13.

Udviklingen af hovedhætten og dens korrekte installation gav høj stabilitet i optagelserne, hvilket muliggjorde samtidig registrering af EEG og blodgennemstrømning dybt inde i hippocampus hos vildtype- og epileptiske vågne mus i både ictale og interictale perioder. Opsamling af blodgennemstrømningshændelser relateret til anfald kræver registrering i længere perioder, således at aperiodiske blodgennemstrømningshændelser (såsom vasospasmer) kan fanges som reaktion på både inducerede og naturligt forekommende epileptiske anfald. Fastholdelsessystemet tillod stabile blodgennemstrømningsoptagelser af dybe hjernemikrokar og deres proksimale vægmalerier over lange timer (figur 6A-R). Vi fandt, at der i hele mikrokar forekom blodgennemstrømningsstop på positionerne af mærkede vægmalericeller.

Vi lokaliserede pålideligt fartøjer i hippocampus ved hjælp af en robot stereotaxisk enhed målrettet med interne koordinater fra et standard stereotaxisk atlas. Vi verificerede kvaliteten af fiberoptagelserne ved at sammenligne dem med højopløselige to-foton-billeddannelsesoptagelser af blodgennemstrømning og ækvivalente vasospasmer fra kortikalt væv på dybder, som to-fotonbilleddannelse kan nå (figur 6S-AA). Vi verificerede yderligere pCLE-resultaterne ved hjælp af immunhistokemi på registreringssteder for at vise med traditionel konfokal mikroskopi, at hippocampus vægmalericeller blev målrettet korrekt, og at de ikke kun var indsnævrende, men også rumligt forbundet med strikturer i mikrokar langt fra arterioler¹⁵ (figur 7).

De offentliggjorte resultater med disse metoder viser faktisk unormale hippocampus kapillære vasospasmer drevet af anfald samt korreleret celledød hos Kv1.1 epileptiske mutante mus og kainat model epileptiske mus ^9,13. Disse resultater indikerer en rolle for lokal ictal iskæmi / hypoxi i celledød under anfald på grund af unormale vasospasmer og bidrager til en voksende mængde arbejde, der udvider de potentielle mekanismer for ictal celledød.

Figur 1: Skematisk gengivelse af det eksperimentelle design. Vi registrerede EEG, mens vi udførte konfokalmikroskopi i hippocampus kapillærer hos både vågne epileptiske mus og WT kuldkammerater. Efter at have injiceret halevenen med fluorescein brugte vi en ny præklinisk konfokal laserscanningsendomikroskopi (pCLE) med et fibermål med en spidsdiameter på 0,3 mm til at registrere kapillær blodgennemstrømningsdynamik dybt i hjernen. Gul indikerer øget blodgennemstrømning, og rød indikerer stabil eller reduceret strømning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Protokol for implantationskirurgi med hovedhætte. A) Det bedøvede dyr blev anbragt på en varmepude og anbragt inden for stereotaksrammen (se figur 3B, litra j) og fastgjort med øretæver med mus (figur 3A, punkt i) og kæbeholdermanchetter (figur 3A, punkt g,h) over en varmepude. B) Eksponering af kraniesuturerne. C-D) Målinger af Bregma og Lambda. E) Visualisering af boresteder over dyrets kranium. De sorte punkter og firkanten angiver vinduet over hippocampus, der tillader indsættelse af pCLE. De to røde cirkler markerer indsætningspositionerne for EEG-optageledningerne. Den hvide prik markerer indsætningspunktet for EEG-jordledningerne. F) De fire sorte prikker på kraniet markerer de fremtidige hjørner af billedvinduets kraniotomi over hippocampus. Det brugerdefinerede justeringsstykke (figur 3A, punkt c) med hovedstolpeimplantaterne (figur 3A, punkt a) fastgjort til den stereotaktiske mikrodrevposition (figur 3A, punkt d). G-H) To yderligere prikker, en bageste (G) og en forreste (H), markerer den fremtidige placering af ankerskruer med hovedhætte (figur 3A, punkt b). I-J) To små skruer forankrer hovedhætten til kraniet (figur 3A, punkt b). K) Cyanoacrylat og tandcement påføres ankerskruerne fra panelerne I & J. L) Billedvinduets kraniotomi over hippocampus og de tre huller til EEG-elektroderne er boret. M) Billedkammeret er bygget (figur 3B, punkt i, m) ved at forme en berm med yderligere tandcement for at omkranse de tre EEG-huller og billedvinduet. N) Overhead visning af den færdige hovedhætte. O) Den genvundne mus tilbage i buret efter implantationsoperationen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Materialer, der anvendes i protokollen (specifikke punkter opregnet med små bogstaver). A) Materialer, der er anvendt til at bygge hovedhætten. a) To M1,6 x 12 mm maskinskruer (hovedstolpeimplantaterne). b) To små bolte til at fastgøre hovedhætten til kraniet. (c) Et brugerdefineret L-formet justeringsstykke i rustfrit stål med to huller 4 mm fra hinanden, som fastgør de to M1.6-skruer under operationen. d) Et standardmikrodrev monteret på en stereotaksisk anordning indeholder punkt c. e) En brugerdefineret monteringsstang med et f) justeringsstykke, der matcher de to huller fra punkt c. g) En bidestang og h) næseklemme for at stabilisere dyrets hoveds position. B) Opsætning under optagelserne. i) Hovedhætten fastgøres til punkt f under den bedøvede implantationsoperation. j) Mikrodrevet er placeret af en stereotaksisk ramme (litra d). l) En 21G-nål er fastgjort til mikrodrevet (punkt d) og bruges til at bestemme positionerne for Bregma- og Lambda-kraniesuturerne. m) En simuleret hovedhætte er afbildet her, fastgjort til punkt f, for at demonstrere musens placering i n) det skumforede fastholdelsesrør (mus ikke til stede). Item n former sig efter musens kropsform. C) Instrumenter og forsyninger, der er nødvendige for at udføre operationen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Opsætning af optagelsessession. A) Dyrets hoved er fastgjort. B) Placering af EEG-optageledningerne. Hvide EEG-ledninger placeres separat i hver side af kraniet. Røde EEG-ledninger placeres sammen i mellembunden (jorden) hul. C) Det fiberoptiske bundt indsættes i målvinduet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: EEG-optagelser. A) Epidural EEG-optagelser udføres med Physiotel F20-EET-sendere samtidig med de fiberoptiske pCLE-optagelser i det vågne dyr. B) Placering af de borede huller til indsættelse af ledninger til EEG-optagelser. De to røde ledninger går til de to huller, der er angivet med røde prikker. De to hvide ledninger indsættes sammen i hullet angivet med den hvide prik. Den røde firkant betegner målvinduet over dyrets hippocampus. Bogstavet 'B' på musens kranium angiver bregma. C) EEG-optagetrådene er bøjet i en L-form for at forbedre elektrisk kontakt mellem kraniet og dura-sagen. D) Eksempler på EEG-optagelser i vågne mus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Optagelser af vægmalericellevasokonstriktioner hos mus. A-R) In vivo fiberoptisk dual-band pCLE billede af kapillær vasospasme (kar i grønt, mærket med 2MD fluorescein-konjugeret dextran) colokaliseret til vægmalericeller (rød, mærket via intravenøs venehaleinjektion af Alexa Fluor 647) i vågne knockout-mus under anfald (pil indikerer vægmalericelle og tilhørende vasospasme). Se video 1 og video 2. S-W) In vivo to-foton scanning lasermikroskopi (TPLSM) stak af kapillære kar (grøn) og vægmalericeller (rød) af en vildtype mus. Se video 3. X-Z) In vivo TPLSM af en vægmaleri-celle-lokaliseret (rød) kapillær indsnævring af kainiske mus. Se video 4. AA) Kvantificering af beholderindsnævring fra panelerne X-Z målt ved hvid linje. Skalaer til paneler A-R= 5 μm; S-W= 25 μm; X-Z= 5 μm. Videoer blev optaget ved 11,7 Hz. Fra Leal-Campanario et ^al.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Immunhistokemi af den registrerede hjerne. A-B) Beholdere med forskellige forstørrelser injiceret med fluorescein dextran (grøn). DAPI-farvede cellulære kerner i blåt (hvide pile). Skalabjælke for A = 200 μm; skalabjælke for B = 100 μm. C) Forskellige dele af hjernen injiceres med fluorescein, hvor en rød blodlegeme (rød pil) ses tydeligt. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Vasospasme og vægmalericelle blodgennemstrømning registreret (11,7 Hz) i en KO hippocampus kapillær. Se billeder fra samme optagelse i figur 6A-H. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Vasospasme, leukocytblokeringer, blodgennemstrømning og vægmalericeller optaget i en WT hippocampus kapillær (11,7 Hz). Se billeder fra samme optagelse i figur 6I-R. Klik her for at downloade denne video.

Video 3: Ikke-ensartet blodgennemstrømning i in vivo WT museparietal cortex registreret med TPLSM. Se billeder fra samme optagelse i figur 6S-W. Klik her for at downloade denne video.

Video 4: Vægmaleri-celledrevet (rød) kapillær (grøn) indsnævring fra parietal cortex af beslaglæggelse af kainisk dyr registreret med TPLSM. Se billeder fra samme optagelse Figur 6X-Z. Klik her for at downloade denne video.

Discussion

Vi udviklede et hovedhættefastholdelsessystem til samtidige elektrofysiologiske og fiberoptiske pCLE-eksperimenter i vågne mus, hvilket reducerede potentiel responsforurening på grund af anæstetiske lægemidler. Hovedhætten og monteringsapparatet er ligetil at konstruere og kan genbruges til billeddannelseseksperimenter med kronisk vågen adfærd. Vi kontrollerede kvaliteten af optagelserne i forhold til guldstandarden for in vivo mikroskopisk blodgennemstrømningsbilleddannelse, TPLSM.

Dygtige kirurgiske færdigheder er nødvendige for at implementere den protokol, vi beskriver her. Operationen skal udføres under aseptiske forhold og altid under et operationsmikroskop, samtidig med at man sørger for at lade dura mater være intakt, når vinduet bores over hippocampus. Kendskab til den underliggende vaskulatur er afgørende, da skæring over et større blodkar skaber risiko for uønsket blødning.

Korrekt placering af dyret i stereotaksisk justering sikrer, at det forreste og bageste plan er plant, før hovedhætten fastgøres. Denne beskyttelse letter lokalisering af hjerne loci ved hjælp af en hjerne atlas.

Musens bevægelse kan resultere i skader på kar eller fejlagtige optagelser af vasospasmer (det vil sige fiberbevægelse snarere end ægte vasomotion), så det er vigtigt at reducere dyrebevægelse under optagelserne. Skumpolstring i fastholdelsesrøret hjælper med at forlænge varigheden af optagelsessessionerne, samtidig med at stress og bevægelse fra musen minimeres. Mus foretrækker at passe tæt ind i skummet, så korrekt montering reducerer overdreven bevægelse. Uden denne forholdsregel kan mus kæmpe. Hvis musen viser tegn på kamp, skal optagelsessessionen afsluttes. Optagelserne kan genoptages næste dag, når fysiologiske stressreaktioner er aftaget. I vores optagelser var dyrene åbenbart rolige det meste af tiden.

Vi bemærker, at den bevægelse, der mest negativt påvirker pCLE-billeddannelsesmetoden, opstår, når sonden bevæger sig forskelligt til hjernevævet. Vejrtrækning, anfald og bevægelse af dyret er irrelevante, medmindre de fortrænger fibersonden i forhold til vævet. Det vil sige, når billeddannelsessonden bevæger sig forskelligt til vævet, bevæger hele billeddannelsesfeltet sig som en enhed, hvilket gør bevægelsesartefakter tydelige. Det er således vigtigt altid at registrere fra to eller flere skibe ad gangen: Hvis alle skibe bevæger sig på én gang, kan det skyldes fiberstabilitet, mens hvis mindst et fartøj ikke ændres, skyldes de ændringer, der ses i andre kar, sandsynligvis faktiske variationer i blodgennemstrømningen, herunder vasospasmer.

En begrænsning ved pCLE-billeddannelsesmetoden sammenlignet med TPLSM er, at fibersonden punkterer pia og dermed er invasiv for hjernen. Når sonden falder ned, forårsager den en vis skade på det neurale væv, den passerer igennem. Således kan optagelse fra det samme fartøj på to på hinanden følgende dage være yderst vanskelig, selv når der anvendes de samme nøjagtige koordinater i begge sessioner (og ofte kun muligt, hvis den indledende optagelsessession har en kort varighed). Det er derfor afgørende, når der udføres kroniske optagelsesundersøgelser, at optage på stadig større dybder i efterfølgende optagelsessessioner.

Resultaterne af blodgennemstrømningseksperimenterne tyder på, at excitotoksicitet ikke er den eneste mekanistiske vej til ictal celledød og hippocampus sklerose¹³. Konstateringen af, at begrænsning af kapillær blodgennemstrømning spiller en rolle i ictal neurodegeneration, baner vejen for at udvide de metoder, der er beskrevet her, til identifikation af mikroskopiske blodgennemstrømningsændringer i enhver dybde af kroppen og i ethvert væv til kliniske diagnostiske formål.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121