Endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pCLE) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées

Summary

Alors que l’imagerie multiphotonique n’est efficace qu’à des profondeurs limitées de la surface du tissu, il est possible d’obtenir une imagerie d’une résolution de 3 μm à n’importe quelle profondeur via pCLE. Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser une imagerie pCLE pour mesurer la dynamique microvasculaire dans l’hippocampe de souris ictales et de souris de type sauvage.

Abstract

L’objectif de ce protocole est de décrire l’endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des faisceaux de fibres optiques (pCLE) dans son application spécifique pour élucider les effets du flux sanguin capillaire pendant les crises, entraînés par les cellules murales. L’imagerie corticale in vitro et in vivo a montré que les constrictions capillaires induites par les péricytes peuvent résulter d’une activité neuronale locale fonctionnelle, ainsi que de l’application de médicaments, chez des animaux sains. Ici, un protocole est présenté sur la façon d’utiliser la pCLE pour déterminer le rôle de la dynamique microvasculaire dans la dégénérescence neurale dans l’épilepsie, à n’importe quelle profondeur tissulaire (en particulier dans l’hippocampe). Nous décrivons une technique d’appuie-tête qui a été adaptée pour enregistrer la pCLE chez les animaux éveillés, afin de traiter les effets secondaires potentiels des anesthésiques sur l’activité neuronale. Grâce à ces méthodes, des enregistrements électrophysiologiques et d’imagerie peuvent être effectués pendant plusieurs heures dans les structures neuronales profondes du cerveau.

Introduction

Contrairement à d’autres méthodes d’imagerie microscopique 1,2,3,4,5,6,7,8, la microscopie confocale in vivo à base de fibres optiques permet de mesurer la dynamique du flux sanguin dans n’importe quelle région du cerveau, à n’importe quelle profondeur^, à grande vitesse (jusqu’à 240 Hz selon la taille du champ de vision⁹). Une sonde à fibre optique permet l’imagerie confocale à balayage laser in vivo à une résolution de 3 μm, car la pointe de la sonde (un objectif sans lentille composé d’un faisceau de 5000 à 6000 fibres individuelles de 3 μm de diamètre) peut être positionnée avec la précision d’une microélectrode, à moins de 15 μm de la cible fluorescente d’intérêt. Comme pour l’imagerie in vivo à deux photons, les fluorophores doivent être préalablement introduits dans la cible d’imagerie. Par exemple, du dextran de fluorescéine (ou des points quantiques) peut être injecté dans le système vasculaire, ou des protéines fluorescentes génétiquement codées peuvent être transfectées dans les cellules, ou des colorants fluorescents tels que le vert d’Oregon BAPTA-1 peuvent être chargés en vrac dans les cellules, avant l’imagerie.

Des recherches récentes utilisant ces techniques ont montré que l’activité motrice des cellules murales conduisant à des vasospasmes capillaires ictaux – des constrictions soudaines qui se produisent à la position des cellules murales pendant les crises 9 – peut contribuer à la neurodégénérescence de l’hippocampe ictal⁹. Alors que des études d’imagerie antérieures ont montré des constrictions péricytaires in vitro et in vivo liées à des applications médicamenteuses 6,7,10,11,12^, Leal-Campanario et al. ont trouvé la première preuve de constrictions capillaires spontanées in vivo dans le cerveau murin. Pour établir la pertinence de l’épilepsie du lobe temporal humain, ils ont étudié des souris mâles (P30-40 old) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) ^14,15 (JAX stock #003532), un modèle génétique de l’ataxie épisodique humaine de type 1¹⁵. Les péricytes ont entraîné des vasoconstrictions murales de l’hippocampe pathologiques et physiologiques⁹ chez les animaux spontanément épileptiques et leurs compagnons de portée de type sauvage (WT). Ces observations ont été reproduites chez des animaux WT rendus épileptiques avec de l’acide kaïnique, indiquant ainsi leur généralisation à d’autres formes d’épilepsie. Leal-Campanario et al. ont en outre déterminé, à l’aide de nouvelles approches de microscopie stéréologique, que les neurones apoptotiques – mais pas sains – chez les animaux épileptiques étaient spatialement couplés à la microvascularisation de l’hippocampe. Étant donné que l’excitotoxicité n’a pas d’association spatiale connue avec le système vasculaire, ce résultat indique que l’hypoxie anormale induite par l’ischémie vasospasmique capillaire anormale contribue à la neurodégénérescence dans l’épilepsie. La figure 1 montre un schéma de la configuration générale.

Protocol

Le protocole suit les directives des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut neurologique Barrow.

1. Positionnement stéréotaxique pour la craniotomie

1. Peser puis anesthésier la souris avec un cocktail de kétamine-xylazine (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.). Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié en observant son absence de réaction au pincement de la queue et/ou des orteils.
2. Placez un coussin chauffant sous la souris et utilisez un thermomètre rectal pour surveiller en permanence sa température corporelle pendant la chirurgie d’implantation anesthésiée initiale (Figure 2A).
3. Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse oculaire.
4. Stabilisez la tête de l’animal dans un cadre stéréotaxique pour rongeurs, équipé d’un adaptateur de souris. Pour orienter correctement la souris dans le cadre stéréotaxique, placez les dents de l’animal à l’intérieur du trou de la barre de morsure (Figure 2A et Figure 3A, élément g). Serrez le serre-nez jusqu’à ce qu’il soit bien ajusté (Figure 2A, B et Figure 3A, point h). Le positionnement du corps de la souris doit être aussi droit que possible (comme dans la figure 2A).
   1. Fixez davantage la tête de l’animal à l’aide de barres auriculaires de souris munies de brassards de maintien de la mâchoire (figure 2A et figure 3A, point i), afin de serrer fermement les apophyses zygomatiques du crâne.
      REMARQUE : Une fois fixée, la tête de la souris ne doit pas avoir d’amplitude de mouvement horizontal.
5. Une fois que la souris est ajustée au cadre stéréotaxique (Figure 3B, point j), nettoyez et stérilisez le cuir chevelu en l’essuyant avec un gommage au chlore-hexédine 2 à 3 fois, suivi à chaque fois d’un rinçage à l’alcool. Ensuite, appliquez de la lidocaïne topique sur le dessus de la tête.
6. Faites une incision le long de la ligne médiane de l’arrière vers l’avant (commencez l’incision à la base du crâne et complétez-la entre les yeux ; 12-15 mm) le long de la ligne médiane sagittale du crâne, à l’aide de ciseaux fins ou d’une lame. Rétractez les bords du cuir chevelu à l’aide de quatre pinces serrefine bouledogue de 28 mm pour exposer le crâne et maximiser la zone de travail (Figure 2B et Figure 3C).
7. À l’aide d’un scalpel ou d’une microspatule (figure 3C), grattez le périoste jusqu’aux bords de l’incision. Utilisez des ciseaux ou une pince pour séparer les tissus (figure 3C) pour rétracter soigneusement les muscles à l’arrière du cou (figure 2B).
8. Séchez le sommet du crâne à l’aide d’un applicateur à embout en coton, humidifié avec de l’alcool ou du peroxyde d’hydrogène à 30 %, afin d’optimiser la visualisation des sutures crâniennes. Appliquez une solution saline sur le crâne une fois que le tissu conjonctif a été retiré.
9. Une fois que la tête de la souris est stabilisée dans l’appareil stéréotaxique, placez une pointe d’aiguille de seringue (21 G) dans le porte-électrode (Figure 3B, article l) et fixez le porte-électrode au micromanipulateur stéréotaxique, en abaissant la pointe de l’aiguille au niveau du crâne (Figure 2D).
10. Ajustez la direction médiale-latérale du crâne en mesurant la hauteur du crâne à n’importe quelle distance postérieure au bregma (c.-à-d. -2,0 mm) et à deux distances égales latérales de la ligne médiane de chaque côté du crâne (c.-à-d. ± 1,5 mm) (Figure 2D). Visez une différence de hauteur entre les emplacements inférieure à 0,05 mm dans la direction dorsale-ventrale.
    1. S’il est supérieur à 0,05 mm, faites pivoter le crâne de la souris à l’aide de la barre de morsure, ou repositionnez la tête de la souris en desserrant soigneusement les barres auriculaires, en déplaçant latéralement la tête et les barres auriculaires au besoin, puis en resserrant les barres auriculaires.
11. Une fois que le crâne est positionné dans le dispositif stéréotaxique, déterminez et enregistrez les coordonnées stéréotaxiques des sutures crâniennes bregma et lambda le long des axes antéropostérieur (AP), latéral médial (ML) et dorsal ventral (DV).
12. Identifiez le point cible (hippocampe droit) à l’aide d’un atlas stéréotaxique. Ensuite, trouvez sur le crâne les coordonnées du point cible par rapport au bregma (AP : -2,7 mm, ML : -2,7 mm) (Figure 2E).
13. À l’aide d’un marqueur chirurgical, marquez les quatre coins d’une fenêtre d’imagerie de 1,4 mm x 2 mm sur le crâne avec des points, centrés autour du point cible directement au-dessus de l’hippocampe (Figure 2F), pour une craniotomie ultérieure.
14. À l’aide du marqueur chirurgical, tracez deux points supplémentaires : l’un sur l’os pariétal supérieur gauche (figure 2G) et l’autre sur l’os frontal droit (figure 2H), pour indiquer l’emplacement futur de deux vis à os (figure 3A, élément b) qui ancreront la tête (figure 3B, élément m) au crâne.
15. À l’aide du marqueur chirurgical, tracez trois autres points indiquant l’endroit où les électrodes d’enregistrement de l’EEG péridural seront insérées : un point positionné à 1 mm de chaque côté de la ligne médiane et un point supplémentaire sur la ligne médiane positionné à 1 mm derrière Lambda (Figure 2E, Figure 4A et Figure 5B).

2. Installation du capuchon de tête

1. À l’aide d’une fraise de 0,7 mm de diamètre (figure 3C), percez soigneusement deux petits trous dans le crâne, à la position des points indiquant l’emplacement des vis à os (voir l’étape 1.15 ci-dessus). Ensuite, prenez deux vis en os (fendues en acier inoxydable, longueur : 4 mm ; diamètre : 0,85 mm) préalablement désinfectées à l’éthanol à 70-80 % et vissez-les sur le crâne pour une stabilité supplémentaire de la tête (Figure 2I-J et Figure 3A, point b).
   1. Assurez-vous que les pointes des vis ne dépassent pas du bas de l’os dans la cavité crânienne, ce qui risquerait d’endommager le cerveau. Notez que l’une des deux vis à os sera antérieure aux deux vis tête-capuchon et l’autre postérieure à celles-ci (Figure 2G-J).
2. Vaporisez du sérum physiologique sur le crâne pour le refroidir et le nettoyer. Ensuite, séchez complètement le crâne et appliquez une fine couche de cyanoacrylate autour des vis.
3. Utiliser une pièce d’alignement personnalisée (figure 3A, article c) fixée au microentraînement monté sur le dispositif stéréotaxique (figure 2F-J et figure 3A, élément d), de manière à ce que la position de l’embout de tête soit alignée le long de la ligne médiane, avec la crête antérieure recouvrant le bregma. Cette pièce en acier inoxydable sur mesure est en forme de L (inclinée à 90°), avec deux trous séparés de 4 mm (figure 2F-J et figure 3A, article c).
   1. Utilisez le manipulateur stéréotaxique pour positionner la pièce d’alignement en forme de L, avec deux vis d’entraînement à fente à tête cylindrique fixées (M1,6 x 0,35 métrique grossière, longueur de 12 mm ; Figure 3A, point a) au-dessus du bregma, jusqu’à ce que la base des vis repose à plat sur le crâne, en prenant soin de ne pas exercer de pression sur le crâne (Figure 2I-J).
4. Appliquez du cyanoacrylate suivi d’un ciment dentaire pour fixer la base des vis au crâne. Veillez à ne pas obstruer les repères de référence de la fenêtre d’imagerie au-dessus de l’hippocampe (Figure 2K).

3. Chirurgie de craniotomie de fenêtre d’imagerie

1. À chacune des positions des repères de craniotomie qui indiquent les coins de la fenêtre d’imagerie (voir l’étape 1.14 ci-dessus), percez un trou de bavure de 0,7 mm de diamètre, puis délimitez doucement la périphérie de la fenêtre de craniotomie de 1,4 mm x 2 mm avec la perceuse, avec des coupes itératives plus profondes (Figure 2L).
2. Veillez à ne pas percer trop profondément ou avec trop de force sur le crâne, qui est mince et fragile, ayant une épaisseur d’environ 300 μm. Une fois que le lambeau osseux est terminé, soulevez le lambeau lâche avec la pointe d’un scalpel, en veillant à ne pas endommager la dure-mère sous-jacente.
3. Recouvrez la fenêtre ouverte avec de la cire d’os (figure 2M).
4. À l’aide d’une fraise de 0,9 mm de diamètre, percez trois trous pour la mise en place future des électrodes EEG péridurales (voir l’étape 1.15 ci-dessus) en prenant soin de ne pas couper la dure-mère (Figure 2E,L).
5. Couvrez les trois trous avec de la cire d’os.
6. Appliquez délicatement du cyanoacrylate sur les bords de la fenêtre d’imagerie recouverte de cire d’os et des trous EEG, en prenant soin de ne pas sceller les craniotomies (Figure 2L).
7. Construisez un mur de ciment dentaire qui englobe la fenêtre d’imagerie et les trous EEG et le lie à l’embout de tête préalablement cimenté (Figure 2M et Figure 3B, élément m).
8. Laissez sécher le ciment pendant au moins 10 minutes.
9. Fermez les bords lâches de la plaie avec de simples sutures interrompues, en utilisant de la soie tressée noire 4-0 ou 5-0 (Figure 2N et Figure 3C).

4. Post-chirurgie

1. Utilisez un applicateur à embout de coton pour appliquer une pommade à la lidocaïne autour de la peau exposée afin d’atténuer la sensation autour du bord de la plaie.
2. Utilisez un applicateur stérile à embout de coton pour appliquer Neosporin sur la peau exposée.
3. Retirez l’animal du cadre stéréotaxique (Figure 2N).
4. Injecter du kétoprofène (5 mg/kg) IP ou IM pour l’analgésie post-chirurgicale.
5. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il soit alerte et en mouvement (cela se produit généralement en quelques minutes).
6. Placez l’animal dans une cage chaude et continuez à surveiller son rétablissement jusqu’à ce qu’il boive ou mange et qu’il soit prêt à être transféré dans un logement pour animaux.
7. Surveillez l’animal au moins une fois par jour pendant environ une semaine après l’opération, en surveillant tout signe de comportement apathique et/ou de nourriture/boisson inadéquate (Figure 2O).

5. Injection de colorant et enregistrement EEG

1. Attendez au moins un jour après la chirurgie d’implantation du capuchon de tête pour commencer les enregistrements.
2. Placez la souris dans un dispositif de retenue en mousse moulé à son corps, à l’intérieur du cadre stéréotaxique (figure 3B, éléments n et j).
3. Fixez le capuchon de tête (Figure 3 B-I, article m) à une barre de montage personnalisée qui est fixée au cadre stéréotaxique (Figure 3A, B, éléments e et j et Figure 4A). La section longue de l’article e (figure 3A,B) doit avoir une longueur comprise entre 9,4 et 13 mm. Fixez l’élément f (une plaque de montage de dimensions 1,5 cm x 0,5 cm, avec deux trous séparés de 4 mm d’un centre à l’autre) à l’élément e (Figure 3A, B, éléments e, f et k). Ce système d’alignement positionnera la souris éveillée en toute sécurité sur le cadre stéréotaxique tout au long des séances d’imagerie (Figure 4).
4. Insérez les électrodes d’enregistrement EEG péridurale (Figure 5A), en plaçant les électrodes de masse (fils blancs) dans le trou central postérieur et les électrodes d’enregistrement (fils rouges) dans les trous antérieurs gauche et droit (Figure 2E, Figure 4E et Figure 5E). Positionnez chacun des fils en forme de L entre le crâne et la dure-mère (figure 5C) pour optimiser le contact électrique.
5. Injecter dans la veine caudale du dextran fixable à la lysine à la fluorescéine verte (0,2 mL/25 g en poids corporel de fluorescéine à 5 % p/p), pour visualiser le flux sanguin dans l’hippocampe.
   1. Pour améliorer la dilatation de la veine centrale de la queue de la souris avant l’injection, utilisez une ou plusieurs des stratégies suivantes : a) Appliquer de l’éthanol à 70 % sur la veine centrale à l’aide d’un applicateur à embout en coton ; b) Trempez la queue dans de l’eau tiède (35-40 °C) pendant 1 à 3 minutes ; c) Exposez la queue à une lampe chauffante pendant quelques minutes.
   2. Fixez la queue de la souris avec deux doigts et localisez la veine centrale, qui se trouve immédiatement sous la peau. Insérez l’aiguille (seringue à insuline ultrafine avec aiguille intégrée 30G), avec le biseau vers le haut, dans la veine, à environ mi-chemin ou aux deux tiers de la base de la queue. Gardez l’aiguille parallèle à la queue pendant l’injection.
   3. Injectez le colorant lentement et régulièrement, en prenant soin d’éviter tout changement de position de l’aiguille ou de la queue.
      REMARQUE : Il ne doit y avoir aucune résistance lorsque vous appuyez sur le piston de la seringue.
   4. Une fois l’injection terminée, retirez l’aiguille et appliquez une légère pression sur le site de ponction pour sceller le vaisseau.
   5. Permettre à la coagulation de se produire.

6. Endomicroscopie confocale confocale à balayage laser (pCLE) confocale in vivo couplée à des faisceaux de fibres optiques

1. Directement après l’injection de la veine caudale (étape 5.5.3 ci-dessus), serrez le faisceau de fibres optiques biseautées de 300 μm (contenant 5000 à 7000 fibres de 3 μm dans chaque faisceau) dans l’orientation vers le bas du bras mobile du variateur stéréotaxique robotisé.
2. Retirez la cire osseuse de la craniotomie.
3. Retirez la dure-mère à l’aide de l’extrémité pliée d’une aiguille de seringue.
4. À l’aide du système de positionnement robotisé, déplacez d’abord l’objectif de la fibre à l’emplacement stéréotaxique antéro-postérieur et gauche-droite approprié, avec la pointe mise à zéro sur l’axe z à la surface du cortex.
5. Lancez l’enregistrement EEG (Figure 5D).
6. Lancez un balayage laser confocal du fond de l’objectif à fibre, suivi directement en descendant lentement l’objectif sur l’axe z à l’aide des commandes z du micromoteur robotique, jusqu’à ce qu’il atteigne la profondeur cible dans le cerveau (Figure 4C). Visualisez les résultats d’imagerie dans le logiciel microscopique pendant la descente.
   1. Si l’extrémité de la fibre se trouve dans la région d’enregistrement cible X-Y-Z et que deux vaisseaux ou plus pénètrent dans le champ de vision de la fenêtre d’imagerie, arrêtez la descente et lancez les enregistrements vidéo. Obtenez des vidéos en accéléré plein champ en direct du flux sanguin à 11,7 Hz à l’aide du logiciel d’imagerie de Cellvizio Lab. (Des vitesses plus élevées peuvent être obtenues avec un champ de vision plus petit). Les enregistrements peuvent avoir lieu pendant 4 à 5 heures d’affilée, en jours consécutifs si nécessaire.
7. À l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’un tube en silicone biseauté fixé à l’extrémité de l’aiguille, nourrir l’animal pendant les enregistrements en lui fournissant périodiquement de la pâte faite de pastilles de souris broyées avec de l’eau.
8. À la fin de la session d’imagerie, mettez fin aux enregistrements.
9. Retirez délicatement les sondes EEG et nettoyez-les avec Tergazyme.
10. Retirez lentement le faisceau de fibres optiques du cerveau de l’animal en inversant la fibre le long de l’axe z d’entrée.
11. Libérez l’animal du poteau de tête et des dispositifs de retenue.
12. S’il y a lieu, suivez les protocoles d’euthanasie et de traitement tissulaire nécessaires pour visualiser les vaisseaux sanguins et effectuer l’immunohistochimie.
13. Si vous prévoyez d’enregistrer à partir du même animal lors d’une session ultérieure, couvrez la fenêtre d’imagerie avec de la cire d’os ou du silastic.

Representative Results

Nous avons développé ces méthodes pour évaluer si des vasospasmes capillaires anormaux induits par le péricyte dans l’hippocampe – survenant à la suite de convulsions – pourraient provoquer une hypoxie franche qui contribue à la mort cellulaire dans le foyer ictal ^9,13.

Le développement de la coiffe et son installation correcte ont permis une grande stabilité dans les enregistrements, permettant l’enregistrement simultané de l’EEG et du flux sanguin dans les profondeurs de l’hippocampe des souris éveillées de type sauvage et épileptiques pendant les périodes ictales et interictales. La capture des événements de flux sanguin liés aux crises nécessite un enregistrement pendant de longues périodes, de sorte que les événements de flux sanguin apériodiques (tels que les vasospasmes) puissent être capturés en réponse aux crises d’épilepsie induites et naturelles. Le système de contention a permis d’enregistrer de façon stable le débit sanguin des microvaisseaux cérébraux profonds et de leurs cellules murales proximales pendant de longues heures (figure 6, de A à R). Nous avons constaté que, dans des microvaisseaux entiers, des arrêts du flux sanguin se produisaient aux positions des cellules murales marquées.

Nous avons localisé de manière fiable les vaisseaux dans l’hippocampe à l’aide d’un dispositif stéréotaxique robotique ciblé avec des coordonnées internes d’un atlas stéréotaxique standard. Nous avons vérifié la qualité des enregistrements de fibres en les comparant à des enregistrements d’imagerie à deux photons à haute résolution du flux sanguin et des vasospasmes équivalents du tissu cortical, à des profondeurs que l’imagerie à deux photons peut atteindre (Figure 6S-AA). Nous avons ensuite vérifié les résultats de la pCLE en utilisant l’immunohistochimie sur les sites d’enregistrement, afin de montrer avec la microscopie confocale traditionnelle que les cellules murales de l’hippocampe étaient correctement ciblées et qu’elles étaient non seulement constrictrices, mais aussi spatialement associées à des sténoses dans les microvaisseaux éloignés des artérioles¹⁵ (Figure 7).

Les résultats publiés avec ces méthodes montrent en effet des vasospasmes capillaires anormaux de l’hippocampe provoqués par des convulsions, ainsi que la mort cellulaire corrélée chez les souris mutantes épileptiques Kv1.1 et les souris épileptiques modèles kaïnates ^9,13. Ces résultats indiquent un rôle de l’ischémie/hypoxie ictale locale dans la mort cellulaire pendant les crises, due à des vasospasmes anormaux, et contribuent à un nombre croissant de travaux qui approfondissent les mécanismes potentiels de la mort cellulaire ictale.

Figure 1 : Représentation schématique du plan d’expérience. Nous avons enregistré l’EEG lors de la microscopie confocale dans les capillaires de l’hippocampe de souris épileptiques éveillées et de compagnons de portée WT. Après avoir injecté de la fluorescéine dans la veine de la queue, nous avons utilisé une nouvelle endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser (pCLE), avec un objectif à fibre avec un diamètre de pointe de 0,3 mm pour enregistrer la dynamique du flux sanguin capillaire profondément dans le cerveau. Le jaune indique une augmentation du flux sanguin et le rouge indique un débit stable ou réduit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Protocole pour la chirurgie d’implantation du capuchon de tête. A) L’animal anesthésié a été placé sur un coussin chauffant et placé à l’intérieur du cadre stéréotaxique (voir la figure 3B, point j) et fixé avec des barres d’oreille de souris (figure 3A, élément i) et des brassards de maintien de la mâchoire (figure 3A, éléments g, h), sur un coussin chauffant. B) Exposition des sutures crâniennes. C-D) Mesures de Bregma et Lambda. E) Visualisation des emplacements de perçage sur le crâne de l’animal. Les points noirs et le carré indiquent la fenêtre sur l’hippocampe qui permettra l’insertion de la pCLE. Les deux cercles rouges marquent les positions d’insertion des fils d’enregistrement EEG. Le point blanc marque le point d’insertion des fils de terre EEG. F) Les quatre points noirs sur le crâne marquent les futurs coins de la craniotomie de la fenêtre d’imagerie au-dessus de l’hippocampe. La pièce d’alignement personnalisée (figure 3A, article c), avec les implants de la tige de tête (figure 3A, article a) fixés au positionneur de microentraînement stéréotaxique (figure 3A, article d). G-H) Deux points supplémentaires, l’un postérieur (G) et l’autre antérieur (H), marquent l’emplacement futur des vis d’ancrage du capuchon de tête (figure 3A, article b). I-J) Deux petites vis ancrent le capuchon de tête au crâne (figure 3A, pièce b). K) Le cyanoacrylate et le ciment dentaire sont appliqués sur les vis d’ancrage des panneaux I et J. L) La craniotomie de la fenêtre d’imagerie au-dessus de l’hippocampe et les trois trous pour les électrodes EEG ont été percés. M) La chambre d’imagerie est construite (figure 3B, éléments i, m) en sculptant une berme avec du ciment dentaire supplémentaire pour encercler les trois trous EEG et la fenêtre d’imagerie. N) Vue aérienne du capuchon de tête fini. O) La souris récupérée dans sa cage après la chirurgie d’implantation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Matériaux utilisés dans le Protocole (éléments spécifiques énumérés par des lettres minuscules). A) Matériaux utilisés pour construire le capuchon de tête. a) Deux vis à métaux M1,6 x 12 mm (les implants de la tige de tête). (b) Deux petits boulons pour fixer le capuchon de tête au crâne. (c) Une pièce d’alignement en acier inoxydable en forme de L personnalisée, avec deux trous espacés de 4 mm, qui fixe les deux vis M1.6 pendant l’opération. d) Un microentraînement standard monté sur un appareil stéréotaxique contient l’article c. e) Une barre de montage personnalisée avec une pièce d’alignement (f) qui correspond aux deux trous de l’article c. (g) Une barre de morsure et (h) une pince nasale pour stabiliser la position de la tête de l’animal. B) Mise en place pendant les enregistrements. (i) Le capuchon de tête est fixé à l’élément f pendant la chirurgie d’implantation anesthésiée. j) Un cadre stéréotaxique positionne le microentraînement (point d). l) Une aiguille 21G est fixée au microdrive (article d) et utilisée pour déterminer la position des sutures crâniennes Bregma et Lambda. (m) Un capuchon de tête simulé est illustré ici, attaché à l’élément f, pour démontrer le positionnement de la souris dans (n) le tube de retenue doublé de mousse (souris absente). L’élément n se moule à la forme du corps de la souris. C) Instruments et fournitures nécessaires à la réalisation de la chirurgie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Configuration de la session d’enregistrement. A) La tête de l’animal est fixe. B) Emplacement des fils d’enregistrement EEG. Les fils EEG blancs sont placés séparément, de chaque côté du crâne. Les fils EEG rouges sont placés ensemble dans le trou du milieu et du fond (terre). C) Le faisceau de fibres optiques est inséré dans la fenêtre cible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Enregistrements EEG. A) Les enregistrements EEG péridurales sont effectués avec des émetteurs Physiotel F20-ET, simultanément aux enregistrements pCLE à fibre optique chez l’animal éveillé. B) Emplacement des trous percés pour l’insertion des dérivations pour les enregistrements EEG. Les deux fils rouges vont aux deux trous indiqués par des points rouges. Les deux fils blancs sont insérés ensemble dans le trou indiqué par le point blanc. Le carré rouge désigne la fenêtre cible au-dessus de l’hippocampe de l’animal. La lettre « B » sur le crâne de la souris indique le bregma. C) Les fils d’enregistrement EEG sont pliés en forme de L pour améliorer le contact électrique entre le crâne et la dure-mère. D) Exemples d’enregistrements EEG chez des souris éveillées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Enregistrements de vasoconstrictions cellulaires murales chez la souris. A-R) Image pCLE bi-bande à fibre optique in vivo du vasospasme capillaire (vaisseaux en vert, marqués avec du dextron conjugué à la fluorescéine 2MD) colocalisés à des cellules murales (en rouge, marquées par injection intraveineuse d’Alexa Fluor 647 dans la queue de la veine) chez des souris knock-out éveillées pendant la crise (la flèche indique la cellule murale et le vasospasme associé). Voir la vidéo 1 et la vidéo 2. S-W) Microscopie laser à balayage à deux photons (TPLSM) in vivo empilement de vaisseaux capillaires (vert) et de cellules murales (rouge) d’une souris de type sauvage. Voir la vidéo 3. X-Z) TPLSM in vivo d’une constriction capillaire (rouge) localisée par des cellules murales chez des souris kainiques. Voir la vidéo 4. AA) Quantification de la constriction des vaisseaux à partir des panneaux X-Z mesurée à la ligne blanche. Échelles pour panneaux A-R = 5 μm ; S-W = 25 μm ; X-Z = 5 μm. Les vidéos ont été enregistrées à 11,7 Hz. D’après Leal-Campanario et ^al.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Immunohistochimie du cerveau enregistré. A-B) Récipients à différents grossissements injectés avec de la fluorescéine dextran (vert). Noyaux cellulaires colorés par DAPI en bleu (flèches blanches). Barre d’échelle pour A= 200 μm ; barre d’échelle pour B = 100 μm. C) Différentes sections du cerveau injectées avec de la fluorescéine où un globule rouge (flèche rouge) est clairement visible. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Vasospasme et flux sanguin de cellules murales enregistrés (11,7 Hz) dans un capillaire hippocampique KO. Voir les images du même enregistrement à la figure 6A-H. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Vasospasme, blocages leucocytaires, flux sanguin et cellules murales enregistrés dans un capillaire hippocampique WT (11,7 Hz). Voir les images du même enregistrement à la figure 6I-R. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Flux sanguin non uniforme dans le cortex pariétal de souris WT in vivo enregistré avec TPLSM. Voir les images du même enregistrement à la figure 6S-W. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 4 : Constriction capillaire (verte) induite par des cellules murales (rouges) du cortex pariétal d’un animal kainique saisissant enregistré avec TPLSM. Voir les images du même enregistrement Figure 6X-Z. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Nous avons mis au point un système de retenue de la tête pour des expériences simultanées de pCLE électrophysiologique et à fibre optique chez des souris éveillées, réduisant ainsi la contamination potentielle de la réponse due aux médicaments anesthésiques. Le capuchon de tête et l’appareil de montage sont simples à construire et sont réutilisables pour les expériences d’imagerie chronique au comportement éveillé. Nous avons vérifié la qualité des enregistrements par rapport à l’étalon-or de l’imagerie microscopique du flux sanguin in vivo, le TPLSM.

Des compétences chirurgicales compétentes sont nécessaires pour mettre en œuvre le protocole que nous décrivons ici. La chirurgie doit être réalisée dans des conditions aseptiques et toujours sous un microscope opératoire, tout en prenant soin de laisser la dure-mère intacte lors du perçage de la fenêtre au-dessus de l’hippocampe. Il est essentiel de connaître le système vasculaire sous-jacent, car couper au-dessus d’un vaisseau sanguin important crée un risque de saignement indésirable.

En plaçant correctement l’animal dans l’alignement stéréotaxique, on s’assure que le plan antéro-postérieur est de niveau avant de fixer le capuchon de tête. Cette protection facilite la localisation des loci cérébraux à l’aide d’un atlas cérébral.

Le mouvement de la souris peut endommager les vaisseaux ou entraîner des enregistrements erronés de vasospasmes (c’est-à-dire un mouvement des fibres plutôt qu’une véritable vasomotion), il est donc important de réduire les mouvements des animaux pendant les enregistrements. Le rembourrage en mousse à l’intérieur du tube de retenue permet de prolonger la durée des sessions d’enregistrement tout en minimisant le stress et les mouvements de la souris. Les souris préfèrent s’adapter parfaitement à la mousse, de sorte qu’un bon ajustement réduit les mouvements excessifs. Sans cette précaution, les souris peuvent avoir du mal. Si la souris montre des signes de difficulté, la session d’enregistrement doit être interrompue. Les enregistrements peuvent reprendre le lendemain, une fois que les réactions physiologiques de stress se sont atténuées. Dans nos enregistrements, les animaux étaient évidemment calmes la plupart du temps.

Nous remarquons que le mouvement qui a le plus d’impact négatif sur la méthode d’imagerie pCLE se produit lorsque la sonde se déplace différemment vers le tissu cérébral. La respiration, les convulsions et les mouvements de l’animal ne sont pas pertinents, à moins qu’ils ne déplacent la sonde à fibres par rapport aux tissus. C’est-à-dire que lorsque la sonde d’imagerie se déplace différemment vers le tissu, l’ensemble du champ d’imagerie se déplace en tant qu’unité, ce qui rend les artefacts de mouvement évidents. Ainsi, il est essentiel de toujours enregistrer à partir de deux vaisseaux ou plus à la fois : si tous les vaisseaux bougent en même temps, cela peut être dû à l’instabilité des fibres, tandis que si au moins un vaisseau ne change pas, les changements observés dans les autres vaisseaux sont probablement dus à des variations réelles du flux sanguin, y compris les vasospasmes.

L’une des limites de la méthode d’imagerie pCLE par rapport à la TPLSM est que la sonde à fibres perfore le pia et est donc invasive pour le cerveau. Au fur et à mesure que la sonde descend, elle endommage le tissu neural qu’elle traverse. Ainsi, l’enregistrement à partir du même navire sur deux jours consécutifs peut être extrêmement difficile, même en utilisant les mêmes coordonnées exactes dans les deux sessions (et souvent seulement possible si la session d’enregistrement initiale a une courte durée). Il est donc essentiel, lors de la réalisation d’études d’enregistrement chronique, d’enregistrer à des profondeurs de plus en plus grandes lors des sessions d’enregistrement ultérieures.

Les résultats des expériences sur le flux sanguin suggèrent que l’excitotoxicité n’est pas la seule voie mécanistique de la mort des cellules ictales et de la sclérose de l’hippocampe¹³. La découverte que la restriction du flux sanguin capillaire joue un rôle dans la neurodégénérescence ictale ouvre la voie à l’extension des méthodes décrites ici à l’identification des changements microscopiques du flux sanguin à n’importe quelle profondeur du corps et dans n’importe quel tissu, à des fins de diagnostic clinique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121