In vivo fasergekoppelte präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) von Hippocampus-Kapillaren bei wachen Mäusen

Summary

Während die Multiphotonen-Bildgebung nur in begrenzten Tiefen von der Gewebeoberfläche aus effektiv ist, ist es möglich, eine Bildgebung mit einer Auflösung von 3 μm in jeder Tiefe über pCLE zu erreichen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von pCLE-Bildgebung zur Messung der mikrovaskulären Dynamik im Hippocampus von iktalen und Wildtyp-Mäusen vor.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) in ihrer spezifischen Anwendung zur Aufklärung von kapillaren Blutflusseffekten während Anfällen, die von Wandzellen angetrieben werden, zu beschreiben. Die kortikale Bildgebung in vitro und in vivo hat gezeigt, dass Kapillarverengungen, die durch Perizyten ausgelöst werden, sowohl durch funktionelle lokale neuronale Aktivität als auch durch die Anwendung von Medikamenten bei gesunden Tieren verursacht werden können. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, wie mit Hilfe von pCLE die Rolle der mikrovaskulären Dynamik bei der neuronalen Degeneration bei Epilepsie in jeder Gewebetiefe (insbesondere im Hippocampus) bestimmt werden kann. Wir beschreiben eine Kopfstützentechnik, die angepasst wurde, um pCLE bei wachen Tieren aufzuzeichnen, um mögliche Nebenwirkungen von Anästhetika auf die neuronale Aktivität zu adressieren. Mit diesen Methoden können elektrophysiologische und bildgebende Aufnahmen über mehrere Stunden in tiefen neuronalen Strukturen des Gehirns durchgeführt werden.

Introduction

Im Gegensatz zu anderen mikroskopischen bildgebenden Verfahren 1,2,3,4,5,6,7,8 ermöglicht die faseroptische konfokale In-vivo-Mikroskopie die Messung der Blutflussdynamik in jeder Hirnregion, in jeder Tiefe^, mit hoher Geschwindigkeit (bis zu 240 Hz je nach Sichtfeldgröße⁹). Eine faseroptische Sonde ermöglicht konfokale In-vivo-Laserscanning-Bildgebung mit einer Auflösung von 3 μm, da die Spitze der Sonde (ein linsenloses Objektiv, das aus einem Bündel von 5000-6000 einzelnen Fasern mit einem Durchmesser von 3 μm besteht) mit der Genauigkeit einer Mikroelektrode innerhalb von 15 μm vom interessierenden Fluoreszenzziel positioniert werden kann. Wie bei der In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung müssen zuvor Fluorophore in das Bildgebungsziel eingebracht werden. Zum Beispiel können Fluorescein-Dextran (oder Quantenpunkte) in das Gefäßsystem injiziert werden, oder genetisch kodierte fluoreszierende Proteine können in Zellen transfiziert werden, oder Fluoreszenzfarbstoffe wie Oregon Green BAPTA-1 können vor der Bildgebung in Zellen geladen werden.

Neuere Forschungen mit diesen Techniken haben ergeben, dass die motorische Aktivität von Wandzellen, die zu iktalen kapillaren Vasospasmen führt – plötzliche Verengungen, die während der Anfälle an der Position der Wandzellen auftreten⁹ – zur Neurodegeneration im iktalen Hippocampus beitragen^{kann 9}. Während frühere bildgebende Studien in vitro und in vivo Perizytenverengungen im Zusammenhang mit der Anwendung von Medikamenten^zeigten 6,7,10,11,12^, fanden Leal-Campanario et al. den ersten Hinweis auf in vivo spontane Kapillarverengungen im murinen Gehirn. Um die Relevanz für die menschliche Temporallappenepilepsie zu ermitteln, untersuchten sie männliche (P30-40 alte) Kv1.1 (kcna1-null) Mäuse ^14,15 (JAX stock #003532), ein genetisches Modell der menschlichen episodischen Ataxie Typ 1¹⁵. Perizyten führten sowohl zu pathologischen als auch zu physiologischen Vasokonstriktionen im Hippocampus⁹ bei den spontan epileptischen Tieren und ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern. Diese Beobachtungen wurden in WT-Tieren repliziert, die mit Kainsäure epileptisch gemacht wurden, was auf ihre Generalisierung auf andere Formen der Epilepsie hindeutet. Leal-Campanario et al. stellten außerdem mit Hilfe neuartiger sterelogischer Mikroskopie-Ansätze fest, dass apoptotische, aber nicht gesunde Neuronen bei epileptischen Tieren räumlich an das hippocampale Mikrogefäßsystem gekoppelt waren. Da die Exzitotoxizität keine bekannte räumliche Assoziation mit dem Gefäßsystem hat, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass eine abnorme kapillare vasospasmische Ischämie-induzierte Hypoxie zur Neurodegeneration bei Epilepsie beiträgt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des allgemeinen Aufbaus.

Protocol

Das Protokoll folgt den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Barrow Neurological Institute genehmigt.

1. Stereotaktische Positionierung bei der Kraniotomie

1. Die Maus wird gewogen und dann mit einem Ketamin-Xylazin-Cocktail (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.) betäubt. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt ist, indem Sie seine mangelnde Reaktion auf das Einklemmen von Schwanz und/oder Zehen beobachten.
2. Legen Sie ein Heizkissen unter die Maus und verwenden Sie ein Rektalthermometer, um die Körpertemperatur während der ersten anästhesierten Implantationsoperation kontinuierlich zu überwachen (Abbildung 2A).
3. Tragen Sie Augensalbe auf, um Augentrockenheit zu verhindern.
4. Stabilisieren Sie den Kopf des Tieres in einem stereotaktischen Nagetierrahmen, der mit einem Mausadapter ausgestattet ist. Um die Maus im stereotaktischen Rahmen richtig auszurichten, werden die Zähne des Tieres in das Loch der Beißleiste eingesetzt (Abbildung 2A und Abbildung 3A, Punkt g). Ziehen Sie die Nasenklemme fest, bis sie fest sitzt (Abbildung 2A, B und Abbildung 3A, Punkt h). Die Körperhaltung der Maus sollte so gerade wie möglich sein (wie in Abbildung 2A).
   1. Sichern Sie den Kopf des Tieres weiter mit Maus-Ohrbügeln mit Kieferhaltermanschetten (Abbildung 2A und Abbildung 3A, Punkt i), um die Jochbeinfortsätze des Schädels fest einzuklemmen.
      HINWEIS: Nach dem Befestigen sollte der Kopf der Maus keinen horizontalen Bewegungsbereich mehr haben.
5. Sobald die Maus auf den stereotaktischen Rahmen eingestellt ist (Abbildung 3B, Punkt j), reinigen und sterilisieren Sie die Kopfhaut, indem Sie sie 2-3 Mal mit einem Chlor-Hexedin-Peeling abwischen, gefolgt von einer Alkoholspülung. Tragen Sie dann topisches Lidocain auf den Kopf auf.
6. Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie von hinten nach vorne (beginnen Sie den Schnitt an der Schädelbasis und schließen Sie ihn zwischen den Augen; 12-15 mm) entlang der sagittalen Mittellinie des Schädels, entweder mit einer feinen Schere oder einer Klinge. Ziehen Sie die Ränder der Kopfhaut mit vier 28-mm-Bulldoggen-Serrefine-Klemmen zurück, um den Schädel freizulegen und den Arbeitsbereich zu maximieren (Abbildung 2B und Abbildung 3C).
7. Verwenden Sie ein Skalpell oder einen Mikrospatel (Abbildung 3C), um das Periost bis zu den Rändern des Einschnitts abzukratzen. Verwenden Sie eine gewebetrennende Schere oder Pinzette (Abbildung 3C), um die Muskeln im Nacken vorsichtig zurückzuziehen (Abbildung 2B).
8. Trocknen Sie die Oberseite des Schädels mit einem Applikator mit Wattespitze, der mit Alkohol oder 30%igem Wasserstoffperoxid angefeuchtet ist, um die Visualisierung der Schädelnähte zu optimieren. Tragen Sie Kochsalzlösung auf den Schädel auf, sobald das Bindegewebe entfernt wurde.
9. Sobald der Kopf der Maus im stereotaktischen Gerät stabilisiert ist, wird eine Spritzennadelspitze (21 G) in den Elektrodenhalter (Abbildung 3B, Punkt l) eingesetzt und der Elektrodenhalter am stereotaktischen Mikromanipulator befestigt, wobei die Nadelspitze auf die Höhe des Schädels abgesenkt wird (Abbildung 2D).
10. Passen Sie die medial-laterale Richtung des Schädels an, indem Sie die Höhe des Schädels in einem beliebigen Abstand hinter dem Bregma (d. h. -2,0 mm) und zwei gleiche seitliche Abstände von der Mittellinie auf beiden Seiten des Schädels (d. h. ± 1,5 mm) messen (Abbildung 2D). Streben Sie einen Höhenunterschied zwischen den Stellen an, der weniger als 0,05 mm in dorsal-ventraler Richtung beträgt.
    1. Bei einer Größe von mehr als 0,05 mm drehen Sie den Schädel der Maus mit der Beißstange oder positionieren Sie den Kopf der Maus neu, indem Sie die Ohrbügel vorsichtig lösen, den Kopf und die Ohrbügel nach Bedarf seitlich verschieben und dann die Ohrstangen wieder anziehen.
11. Sobald der Schädel im stereotaktischen Gerät positioniert ist, bestimmen und zeichnen Sie die stereotaktischen Koordinaten der Bregma- und Lambda-Schädelnähte entlang der anteroposterioren (AP), medialen lateralen (ML) und dorsalen ventralen (DV) Achsen auf.
12. Identifizieren Sie den Zielpunkt (rechter Hippocampus) mit Hilfe eines stereotaktischen Atlas. Dann finden Sie auf dem Schädel die Zielpunktkoordinaten relativ zum Bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (Abbildung 2E).
13. Markieren Sie mit einem chirurgischen Marker vier Ecken eines 1,4 mm x 2 mm großen Bildgebungsfensters auf dem Schädel mit Punkten, die um den Zielpunkt direkt über dem Hippocampus zentriert sind (Abbildung 2F), für die anschließende Kraniotomie.
14. Verwenden Sie die chirurgische Markierung, um zwei zusätzliche Punkte zu zeichnen: einen über dem oberen linken Scheitelknochen (Abbildung 2G) und einen weiteren über dem rechten Stirnknochen (Abbildung 2H), um die zukünftige Platzierung von zwei Knochenschrauben (Abbildung 3A, Punkt b) anzuzeigen, die die Kopfkappe (Abbildung 3B, Punkt m) am Schädel verankern werden.
15. Verwenden Sie die chirurgische Markierung, um drei weitere Punkte zu zeichnen, die anzeigen, wo die Epidural-EEG-Aufzeichnungselektroden eingeführt werden: ein Punkt, der 1 mm auf jeder Seite der Mittellinie positioniert ist, und ein zusätzlicher Punkt auf der Mittellinie, der 1 mm hinter Lambda positioniert ist (Abbildung 2E, Abbildung 4A und Abbildung 5B).

2. Einbau der Head-Cap

1. Bohren Sie mit einem Fräser mit einem Durchmesser von 0,7 mm (Abbildung 3C) vorsichtig zwei kleine Löcher in den Schädel an den Punktpositionen, die die Platzierung der Knochenschrauben anzeigen (siehe Schritt 1.15 oben). Dann nehmen Sie zwei Knochenschrauben (Edelstahl mit Schlitz, Länge: 4 mm; Durchmesser: 0,85 mm), die zuvor zu 70-80 % mit Ethanol desinfiziert wurden, und schrauben Sie sie an den Schädel, um die Stabilität der Kopfkappe zu erhöhen (Abbildung 2I-J und Abbildung 3A, Punkt b).
   1. Achten Sie darauf, dass die Schraubenspitzen nicht über die Unterseite des Knochens hinaus in die Schädelhöhle ragen, wodurch eine Schädigung des Gehirns riskiert wird. Beachten Sie, dass sich eine der beiden Knochenschrauben vor den beiden Kopfschrauben und die andere hinter ihnen befindet (Abbildung 2G-J).
2. Spritzen Sie Kochsalzlösung über den Schädel, um ihn abzukühlen und zu reinigen. Trocknen Sie dann den Schädel vollständig ab und tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat um die Schrauben auf.
3. Verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Ausrichtungsstück (Abbildung 3A, Punkt c), das an das Mikrolaufwerk geklemmt ist, das an dem stereotaktischen Gerät montiert ist (Abbildung 2F-J und Abbildung 3A, Punkt d), so dass die Position der Kopfkappe entlang der Mittellinie ausgerichtet ist, wobei der vordere Grat über dem Bregma liegt. Dieses maßgefertigte Edelstahlstück ist L-förmig (um 90° abgewinkelt) und hat zwei Löcher im Abstand von 4 mm (Abbildung 2F-J und Abbildung 3A, Punkt c).
   1. Verwenden Sie den stereotaktischen Manipulator, um das L-förmige Ausrichtungsstück zu positionieren, wobei zwei Schlitzschrauben mit Füllkopf angebracht sind (M1,6 x 0,35 Metrisch grob, 12 mm Länge; Abbildung 3A, Punkt a) über das Bregma legen, bis die Basis der Schrauben flach auf dem Schädel aufliegt, wobei darauf zu achten ist, keinen Druck auf den Schädel auszuüben (Abbildung 2I-J).
4. Tragen Sie Cyanacrylat gefolgt von Zahnzement auf, um die Basis der Schrauben am Schädel zu befestigen. Achten Sie darauf, dass die Referenzmarken des Bildfensters über dem Hippocampus nicht verdeckt werden (Abbildung 2K).

3. Bildgebende Fensterkraniotomie

1. Bohren Sie an jeder Position der Kraniotomie-Referenzmarken, die die Ecken des Bildgebungsfensters anzeigen (siehe Schritt 1.14 oben), ein Gratloch mit einem Durchmesser von 0,7 mm, gefolgt von einer vorsichtigen Abgrenzung des Umfangs des 1,4 mm x 2 mm großen Kraniotomiefensters mit dem Bohrer mit iterativ tieferen Schnitten (Abbildung 2L).
2. Achten Sie darauf, nicht zu tief oder mit zu viel Kraft auf den Schädel zu bohren, der dünn und zerbrechlich ist und eine Dicke von ca. 300 μm hat. Sobald der Knochenlappen vollständig ist, hebeln Sie den losen Lappen mit der Spitze eines Skalpells nach oben und achten Sie darauf, die darunter liegende Dura mater nicht zu beschädigen.
3. Bedecken Sie das geöffnete Fenster mit Knochenwachs (Abbildung 2M).
4. Bohren Sie mit einem Fräser mit einem Durchmesser von 0,9 mm drei Löcher für die zukünftige Platzierung der epiduralen EEG-Elektroden (siehe Schritt 1.15 oben) und achten Sie darauf, die Dura mater nicht zu durchtrennen (Abbildung 2E,L).
5. Die drei Löcher mit Knochenwachs bedecken.
6. Tragen Sie Cyanacrylat vorsichtig an den Rändern des mit Knochenwachs bedeckten Bildgebungsfensters und der EEG-Löcher auf und achten Sie darauf, die Kraniotomien nicht zu versiegeln (Abbildung 2L).
7. Bauen Sie eine Wand aus Zahnzement, die das Bildgebungsfenster und die EEG-Löcher umschließt und mit der zuvor zementierten Kopfkappe verbindet (Abbildung 2M und Abbildung 3B, Punkt m).
8. Lassen Sie den Zement mindestens 10 Minuten trocknen.
9. Schließen Sie lose Wundränder mit einfachen unterbrochenen Nähten mit 4-0 oder 5-0 schwarz geflochtener Seide (Abbildung 2N und Abbildung 3C).

4. Nach der Operation

1. Verwenden Sie einen Applikator mit Wattespitze, um Lidocain-Salbe auf die freiliegende Haut aufzutragen, um das Gefühl am Rand der Wunde zu dämpfen.
2. Verwenden Sie einen sterilen Applikator mit Wattespitze, um Neosporin auf die exponierte Haut aufzutragen.
3. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen (Abbildung 2N).
4. Injizieren Sie Ketoprofen (5 mg/kg) IP oder IM zur postoperativen Analgesie.
5. Beobachte das Tier, bis es wach ist und sich bewegt (dies geschieht in der Regel innerhalb von Minuten).
6. Setzen Sie das Tier in einen warmen Käfig und beobachten Sie seine Genesung, bis es trinkt oder frisst und bereit ist, in den Tierstall gebracht zu werden.
7. Kontrollieren Sie das Tier mindestens einmal täglich für etwa eine Woche nach der Operation und achten Sie auf Anzeichen von lustlosem Verhalten und/oder unzureichendem Fressen/Trinken (Abbildung 2O).

5. Farbstoffinjektion und EEG-Aufzeichnung

1. Warten Sie mindestens einen Tag nach der Kopfkappenimplantation, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen.
2. Legen Sie die Maus in eine schaumfixierende Vorrichtung, die an ihren Körper angepasst ist, innerhalb des stereotaktischen Rahmens (Abbildung 3B, Punkte n und j).
3. Befestigen Sie die Kopfkappe (Abbildung 3 B-I, Punkt m) an einer speziellen Montagestange, die am stereotaktischen Rahmen befestigt ist (Abbildung 3A, B, Punkte e und j sowie Abbildung 4A). Der lange Abschnitt von Punkt e (Abbildung 3A,B) sollte eine Länge zwischen 9,4 und 13 mm haben. Befestigen Sie Artikel f (eine Montageplatte mit den Maßen 1,5 cm x 0,5 cm, mit zwei Löchern im Abstand von 4 mm von Mitte zu Mitte) an Artikel e (Bild 3A,B, Artikel e, f und k). Dieses Ausrichtungssystem positioniert die wache Maus während der gesamten Bildgebungssitzungen sicher am stereotaktischen Rahmen (Abbildung 4).
4. Setzen Sie die Epidural-EEG-Aufzeichnungselektroden (Abbildung 5A) ein, indem Sie die Masseelektroden (weiße Drähte) in das hintere zentrale Loch und die Aufzeichnungselektroden (rote Drähte) in das vordere linke und rechte Loch (Abbildung 2E, Abbildung 4E und Abbildung 5E) legen. Positionieren Sie jeden der Drähte L-förmig zwischen dem Schädel und der Dura mater (Abbildung 5C), um den elektrischen Kontakt zu optimieren.
5. Injizieren Sie die Schwanzvene mit grünem Fluorescein-Lysin-fixierbarem Dextran (0,2 ml/25 g Körpergewicht Fluorescein 5 % w/w), um den Blutfluss innerhalb des Hippocampus zu visualisieren.
   1. Um die Erweiterung der zentralen Vena des Mausschwanzes vor der Injektion zu verbessern, wenden Sie eine oder mehrere der folgenden Strategien an: a) Tragen Sie 70%iges Ethanol mit einem Applikator mit Wattespitze auf die zentrale Vene auf; b) Tauchen Sie den Schwanz für 1-3 Minuten in warmes Wasser (35-40 °C); c) Setzen Sie den Schwanz einige Minuten lang einer Heizlampe aus.
   2. Befestigen Sie den Schwanz der Maus mit zwei Fingern und lokalisieren Sie die zentrale Vene, die direkt unter der Haut liegt. Führen Sie die Nadel (ultrafeine Insulinspritze mit integrierter Nadel 30G) mit der Abschrägung nach oben etwa zur Hälfte bis zu zwei Dritteln vom Schwanzansatz in die Vene ein. Halten Sie die Nadel während der Injektion parallel zum Schwanz.
   3. Injizieren Sie den Farbstoff langsam und gleichmäßig und achten Sie darauf, dass sich die Position der Nadel oder des Schwanzes nicht verändert.
      HINWEIS: Beim Drücken des Spritzenkolbens sollte kein Widerstand auftreten.
   4. Nach Beendigung der Injektion ziehen Sie die Nadel zurück und üben Sie sanften Druck auf die Einstichstelle aus, um das Gefäß zu versiegeln.
   5. Lassen Sie die Gerinnung zu.

6. Präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) in vivo mit faseroptischen Bündeln gekoppelt

1. Direkt nach der Schwanzveneninjektion (Schritt 5.5.3 oben) klemmen Sie das 300 μm lange, abgeschrägte Glasfaserbündel (mit 5000–7000 3-μm-Fasern in jedem Bündel) in der Abwärtsausrichtung an den beweglichen Arm des stereotaktischen Roboterantriebs.
2. Entfernen Sie das Knochenwachs aus der Kraniotomie.
3. Entfernen Sie die Dura mit der gebogenen Spitze einer Spritzennadel.
4. Bewegen Sie mit dem Roboter-Positionierungssystem zunächst das Faserobjektiv an die entsprechende stereotaktische Stelle anterior-posterior und links-rechts, wobei die Spitze in der z-Achse auf der Oberfläche des Kortex auf Null gestellt wird.
5. Initiieren Sie die EEG-Aufzeichnung (Abbildung 5D).
6. Initiieren Sie ein konfokales Laserscanning der Rückwand des Faserobjektivs, gefolgt von einem langsamen Absenken des Objektivs in der z-Achse mit den Z-Steuerungen des Roboter-Mikroantriebs, bis es die Zieltiefe im Gehirn erreicht (Abbildung 4C). Sehen Sie sich die Bildgebungsergebnisse in der mikroskopischen Software an, während Sie absteigen.
   1. Wenn sich die Faserspitze innerhalb des X-Y-Z-Aufzeichnungsbereichs des Ziels befindet und zwei oder mehr Schiffe in das Sichtfeld des Bildfensters gelangen, stoppen Sie den Sinkflug und starten Sie die Videoaufzeichnungen. Erhalten Sie Live-Zeitrafferfilme des Blutflusses bei 11,7 Hz mit der Bildgebungssoftware von Cellvizio Lab. (Höhere Geschwindigkeiten können mit einem kleineren Sichtfeld erreicht werden). Die Aufzeichnungen können jeweils 4-5 Stunden dauern, bei Bedarf auch an aufeinanderfolgenden Tagen.
7. Füttern Sie das Tier während der Aufzeichnungen mit einer 10-ml-Spritze mit abgeschrägtem Silikonschlauch, der an der Spitze der Nadel befestigt ist, indem Sie regelmäßig Paste aus mit Wasser gemahlenen Mäusepellets verabreichen.
8. Beenden Sie am Ende der Bildbearbeitungssitzung die Aufzeichnungen.
9. Entfernen Sie vorsichtig die EEG-Elektroden und reinigen Sie sie mit Tergazyme.
10. Entferne das Glasfaserbündel langsam aus dem Gehirn des Tieres, indem du die Faser entlang der z-Eintrittsachse umkehrst.
11. Befreien Sie das Tier von der Kopfstütze und den Körperfesseln.
12. Befolgen Sie gegebenenfalls die erforderlichen Euthanasie- und Gewebeaufbereitungsprotokolle, um Blutgefäße sichtbar zu machen und Immunhistochemie durchzuführen.
13. Wenn Sie planen, in einer zukünftigen Sitzung mit demselben Tier aufzunehmen, decken Sie das Bildgebungsfenster mit Knochenwachs oder Silastik ab.

Representative Results

Wir haben diese Methoden entwickelt, um zu beurteilen, ob abnorme perizytengetriebene kapillare Vasospasmen im Hippocampus – die als Folge von Anfällen auftreten – eine offene Hypoxie verursachen können, die zum Zelltod im iktalen Fokus beiträgt ^9,13.

Die Entwicklung der Kopfkappe und ihre korrekte Installation sorgten für eine hohe Stabilität in den Aufnahmen, die eine gleichzeitige Aufzeichnung von EEG und Blutfluss tief im Hippocampus von Wildtyp- und epileptischen Wachmäusen sowohl während der iktalen als auch der interiktalen Periode ermöglichten. Die Erfassung von Blutflussereignissen im Zusammenhang mit Anfällen erfordert eine Aufzeichnung über längere Zeiträume, so dass aperiodische Blutflussereignisse (wie Vasospasmen) sowohl als Reaktion auf induzierte als auch natürlich auftretende epileptische Anfälle erfasst werden können. Das Rückhaltesystem ermöglichte stabile Blutflussaufzeichnungen von tiefen Hirnmikrogefäßen und ihren proximalen Wandzellen über viele Stunden (Abbildung 6A-R). Wir fanden heraus, dass in ganzen Mikrogefäßen Blutflussstopps an den Positionen markierter Wandzellen auftraten.

Wir lokalisierten zuverlässig Gefäße im Hippocampus mit einem stereotaktischen Robotergerät, das mit internen Koordinaten aus einem stereotaktischen Standardatlas anvisiert wurde. Wir verifizierten die Qualität der Faseraufzeichnungen, indem wir sie mit hochauflösenden Zwei-Photonen-Bildaufzeichnungen des Blutflusses und äquivalenter Vasospasmen aus kortikalem Gewebe in Tiefen verglichen, die die Zwei-Photonen-Bildgebung erreichen kann (Abbildung 6S-AA). Darüber hinaus verifizierten wir die pCLE-Ergebnisse mit Hilfe der Immunhistochemie an Aufnahmestellen, um mit traditioneller konfokaler Mikroskopie zu zeigen, dass die Hippocampus-Wandzellen korrekt anvisiert wurden und dass sie nicht nur verengend, sondern auch räumlich mit Strikturen in Mikrogefäßen fernab der Arteriolen assoziiert waren¹⁵ (Abbildung 7).

Die veröffentlichten Ergebnisse mit diesen Methoden zeigen in der Tat abnorme Kapillarvasospasmen im Hippocampus, die durch Krampfanfälle ausgelöst werden, sowie einen korrelierten Zelltod in Kv1.1-epileptischen mutierten Mäusen und epileptischen Kainatmodellmäusen ^9,13. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle der lokalen iktalen Ischämie/Hypoxie beim Zelltod während der Anfälle aufgrund abnormaler Vasospasmen hin und tragen zu einer wachsenden Anzahl von Arbeiten bei, die die potenziellen Mechanismen des iktalen Zelltods erweitern.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsplans. Wir zeichneten EEG auf, während wir konfokale Mikroskopie in den Kapillaren des Hippocampus sowohl von wachen epileptischen Mäusen als auch von WT-Wurfgeschwistern durchführten. Nach der Injektion von Fluorescein in die Schwanzvene verwendeten wir eine neuartige präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) mit einem Faserobjektiv mit einem Spitzendurchmesser von 0,3 mm, um die kapillare Blutflussdynamik tief im Gehirn aufzuzeichnen. Gelb zeigt einen erhöhten Blutfluss an, und Rot zeigt einen gleichmäßigen oder reduzierten Blutfluss an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Protokoll für die Implantation der Kopfkappe. A) Das betäubte Tier wurde auf ein Heizkissen gelegt und innerhalb des stereotaktischen Rahmens positioniert (siehe Abbildung 3B, Punkt j) und mit Maus-Ohrstangen (Abbildung 3A, Punkt i) und Kieferhaltermanschetten (Abbildung 3A, Punkte g, h) über einem Heizkissen gesichert. B) Freilegung der Schädelnähte. C-D) Messungen von Bregma und Lambda. E) Visualisierung der Bohrstellen über dem Schädel des Tieres. Die schwarzen Punkte und das Quadrat zeigen das Fenster über dem Hippocampus an, das das Einsetzen von pCLE ermöglicht. Die beiden roten Kreise markieren die Einführpositionen für die EEG-Aufzeichnungsdrähte. Der weiße Punkt markiert den Einführpunkt der EEG-Erdungsdrähte. F) Die vier schwarzen Punkte auf dem Schädel markieren die zukünftigen Ecken der Kraniotomie des Bildgebungsfensters über dem Hippocampus. Das kundenspezifische Ausrichtungsstück (Abbildung 3A, Punkt c) mit den Kopfpfostenimplantaten (Abbildung 3A, Punkt a), die am stereotaktischen Mikroantriebspositionierer (Abbildung 3A, Punkt d) befestigt sind. G-H) Zwei zusätzliche Punkte, ein hinterer (G) und ein vorderer (H), markieren die zukünftige Position der Kopfkappen-Ankerschrauben (Abbildung 3A, Punkt b). I-J) Zwei kleine Schrauben verankern die Kopfkappe am Schädel (Abbildung 3A, Punkt b). K) Cyanacrylat und Dentalzement werden auf die Ankerschrauben der Paneele I und J aufgetragen. L) Die Kraniotomie des Bildgebungsfensters über dem Hippocampus und die drei Löcher für die EEG-Elektroden wurden gebohrt. M) Die Bildgebungskammer wird gebaut (Abbildung 3B, Punkte i, m), indem eine Berme mit zusätzlichem Zahnzement geformt wird, um die drei EEG-Löcher und das Bildgebungsfenster zu umgeben. N) Draufsicht auf die fertige Kopfkappe. O) Die genesene Maus ist nach der Implantation wieder in ihrem Käfig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Im Protokoll verwendete Materialien (spezifische Elemente, die in Kleinbuchstaben aufgezählt sind). A) Materialien, die für den Bau der Kopfkappe verwendet werden. (a) Zwei Maschinenschrauben M1,6 x 12 mm (die Kopfpfostenimplantate). b) Zwei kleine Schrauben, um die Kopfkappe am Schädel zu befestigen. (c) Ein kundenspezifisches L-förmiges Ausrichtungsstück aus Edelstahl mit zwei Löchern im Abstand von 4 mm, das die beiden M1,6-Schrauben während der Operation sichert. (d) Ein Standard-Mikroantrieb, der auf einem stereotaktischen Gerät montiert ist, enthält Artikel c. (e) Eine kundenspezifische Montagestange mit einem (f) Ausrichtungsstück, das zu den beiden Löchern von Punkt c passt. (g) Eine Beißstange und (h) eine Nasenklemme zur Stabilisierung der Position des Kopfes des Tieres. B) Einrichtung während der Aufnahmen. (i) Die Kopfkappe wird während der anästhesierten Implantationsoperation an Punkt f befestigt. (j) Ein stereotaktischer Rahmen positioniert das Mikrolaufwerk (Punkt d). l) Eine 21G-Nadel wird am Mikroantrieb (Punkt d) befestigt und zur Bestimmung der Positionen der Bregma- und Lambda-Schädelnähte verwendet. (m) Hier ist eine simulierte Kopfkappe abgebildet, die an Punkt f angebracht ist, um die Positionierung der Maus in (n) dem mit Schaumstoff ausgekleideten Rückhalterohr zu demonstrieren (Maus nicht vorhanden). Item n passt sich der Form des Mauskörpers an. C) Instrumente und Verbrauchsmaterialien, die für die Durchführung der Operation benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Einrichtung der Aufzeichnungssitzung. A) Der Kopf des Tieres ist fixiert. B) Lage der EEG-Aufzeichnungsleitungen. Weiße EEG-Drähte werden separat auf jeder Seite des Schädels platziert. Rote EEG-Drähte werden zusammen in das mittlere untere (Masse-)Loch gelegt. C) Das Glasfaserbündel wird in das Zielfenster eingelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: EEG-Aufzeichnungen. A) Epidurale EEG-Aufzeichnungen werden mit Physiotel F20-EET-Sendern gleichzeitig mit den faseroptischen pCLE-Aufzeichnungen im wachen Tier durchgeführt. B) Lage der Bohrungen zum Einsetzen der Elektroden für EEG-Aufzeichnungen. Die beiden roten Ableitungen führen zu den beiden Löchern, die durch rote Punkte gekennzeichnet sind. Die beiden weißen Leitungen werden zusammen in das Loch gesteckt, das durch den weißen Punkt gekennzeichnet ist. Das rote Quadrat kennzeichnet das Zielfenster über dem Hippocampus des Tieres. Der Buchstabe "B" auf dem Schädel der Maus weist auf das Bregma hin. C) Die EEG-Aufzeichnungsdrähte sind L-förmig gebogen, um den elektrischen Kontakt zwischen Schädel und Dura zu verbessern. D) Beispiele für EEG-Aufzeichnungen bei wachen Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Aufzeichnungen von Vasokonstriktionen von Wandzellen bei Mäusen. A-R) In-vivo-faseroptisches Dualband-pCLE-Bild des kapillaren Vasospasmus (Gefäße in grün, markiert mit 2MD-Fluorescein-konjugiertem Dextran), der an Wandzellen kolokalisiert ist (rot, markiert durch intravenöse Venenschwanzinjektion von Alexa Fluor 647) in wachen Knockout-Mäusen während des Anfalls (Pfeil zeigt Wandzelle und assoziierten Vasospasmus). Siehe Video 1 und Video 2. S-W) In vivo Zwei-Photonen-Scanning-Lasermikroskopie (TPLSM) Stapel von Kapillargefäßen (grün) und Wandzellen (rot) einer Wildtyp-Maus. Siehe Video 3. X-Z) In vivo TPLSM einer mural-zell-lokalisierten (roten) Kapillarverengung von kainischen Mäusen. Siehe Video 4. AA) Quantifizierung der Gefäßverengung aus den Panels X-Z, gemessen an der weißen Linie. Skalen für Paneele A-R= 5 μm; S-W = 25 μm; X-Z= 5 μm. Die Videos wurden mit 11,7 Hz aufgenommen. Von Leal-Campanario et ^al.8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Immunhistochemie des aufgezeichneten Gehirns. A-B) Gefäße mit unterschiedlichen Vergrößerungen, die mit Fluorescein-Dextran (grün) injiziert wurden. DAPI-gefärbte Zellkerne in Blau (weiße Pfeile). Maßstabsleiste für A= 200 μm; Maßstabsbalken für B = 100 μm. C) Verschiedene Abschnitte des Gehirns, denen Fluorescein injiziert wurde, wobei ein rotes Blutkörperchen (roter Pfeil) deutlich zu sehen ist. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Vasospasmus und Blutfluss der Wandzellen aufgezeichnet (11,7 Hz) in einer KO-Hippocampus-Kapillare. Siehe Frames aus derselben Aufzeichnung in Abbildung 6A-H. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Vasospasmus, Leukozytenblockaden, Blutfluss und Wandzellen in einer WT-Hippocampus-Kapillare (11,7 Hz). Siehe Frames aus derselben Aufnahme in Abbildung 6I-R. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 3: Ungleichmäßiger Blutfluss im in vivo WT-parietalen Kortex der Maus, aufgezeichnet mit TPLSM. Siehe Frames aus derselben Aufnahme in Abbildung 6S-W. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 4: Murale zellgetriebene (rote) kapillare (grüne) Verengung aus dem parietalen Kortex des ergreifenden kainischen Tieres, aufgezeichnet mit TPLSM. Siehe Frames aus derselben Aufnahme Abbildung 6X-Z. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Discussion

Wir haben ein Kopfkappen-Rückhaltesystem für simultane elektrophysiologische und faseroptische pCLE-Experimente an wachen Mäusen entwickelt, um eine mögliche Kontamination durch Anästhetika zu reduzieren. Die Kopfkappe und die Montagevorrichtung sind einfach zu konstruieren und für chronische Bildgebungsexperimente im Wachzustand wiederverwendbar. Wir überprüften die Qualität der Aufnahmen anhand des Goldstandards für die mikroskopische Blutflussbildgebung in vivo, TPLSM.

Kompetente chirurgische Fähigkeiten sind notwendig, um das hier beschriebene Protokoll umzusetzen. Die Operation muss unter aseptischen Bedingungen und immer unter dem Operationsmikroskop durchgeführt werden, wobei darauf zu achten ist, dass die Dura mater intakt bleibt, wenn das Fenster über den Hippocampus gebohrt wird. Die Vertrautheit mit dem darunter liegenden Gefäßsystem ist unerlässlich, da das Durchtrennen eines großen Blutgefäßes das Risiko unerwünschter Blutungen birgt.

Durch die korrekte Platzierung des Tieres in stereotaktischer Ausrichtung wird sichergestellt, dass die vordere und hintere Ebene waagerecht ist, bevor die Kopfkappe angebracht wird. Diese Absicherung erleichtert das Auffinden von Gehirnloci mit Hilfe eines Gehirnatlasses.

Mausbewegungen können zu Schäden an Gefäßen oder zu fehlerhaften Aufzeichnungen von Vasospasmen führen (d. h. Faserbewegung statt echter Vasobewegung), daher ist es wichtig, die Bewegungen der Tiere während der Aufzeichnungen zu reduzieren. Die Schaumstoffpolsterung innerhalb des Rückhalterohrs trägt dazu bei, die Dauer der Aufnahmesitzungen zu verlängern und gleichzeitig Stress und Bewegungen der Maus zu minimieren. Mäuse bevorzugen es, eng in den Schaumstoff zu passen, so dass die richtige Passform übermäßige Bewegungen reduziert. Ohne diese Vorsichtsmaßnahme können Mäuse Schwierigkeiten haben. Wenn die Maus Anzeichen von Schwierigkeiten zeigt, sollte die Aufnahmesitzung beendet werden. Die Aufzeichnungen können am nächsten Tag wieder aufgenommen werden, sobald die physiologischen Stressreaktionen abgeklungen sind. In unseren Aufnahmen waren die Tiere offensichtlich die meiste Zeit ruhig.

Wir stellen fest, dass die Bewegung, die sich am negativsten auf die pCLE-Bildgebungsmethode auswirkt, auftritt, wenn sich die Sonde differentiell zum Hirngewebe bewegt. Atmung, Krampfanfälle und Bewegungen des Tieres sind irrelevant, es sei denn, sie verschieben die Fasersonde in Bezug auf das Gewebe. Das heißt, wenn sich die bildgebende Sonde differentiell zum Gewebe bewegt, bewegt sich das gesamte Bildgebungsfeld als Einheit, wodurch Bewegungsartefakte sichtbar werden. Daher ist es wichtig, immer von zwei oder mehr Gefäßen gleichzeitig aufzuzeichnen: Wenn sich alle Gefäße gleichzeitig bewegen, kann dies auf eine Faserinstabilität zurückzuführen sein, während die in anderen Gefäßen beobachteten Veränderungen wahrscheinlich auf tatsächliche Schwankungen des Blutflusses, einschließlich Vasospasmen, zurückzuführen sind, wenn sich mindestens ein Gefäß nicht verändert.

Eine Einschränkung des pCLE-Bildgebungsverfahrens im Vergleich zum TPLSM besteht darin, dass die Fasersonde die Pia punktiert und somit invasiv in das Gehirn eingreift. Wenn die Sonde absinkt, verursacht sie eine gewisse Schädigung des Nervengewebes, das sie durchdringt. Daher kann es äußerst schwierig sein, an zwei aufeinanderfolgenden Tagen vom selben Schiff aus aufzuzeichnen, selbst wenn in beiden Sitzungen die gleichen exakten Koordinaten verwendet werden (und oft nur möglich, wenn die erste Aufnahmesitzung eine kurze Dauer hat). Es ist daher von entscheidender Bedeutung, bei chronischen Aufzeichnungsstudien in den nachfolgenden Aufzeichnungssitzungen immer tiefer aufzuzeichnen.

Die Ergebnisse der Blutflussexperimente deuten darauf hin, dass die Exzitotoxizität nicht der einzige mechanistische Weg für den iktalen Zelltod und die Hippocampus-Sklerose ist¹³. Die Erkenntnis, dass die kapillare Blutflussrestriktion eine Rolle bei der iktalen Neurodegeneration spielt, ebnet den Weg für die Erweiterung der hier beschriebenen Methoden auf die Identifizierung mikroskopischer Blutflussänderungen in jeder Tiefe des Körpers und in jedem Gewebe für klinisch-diagnostische Zwecke.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121