Summary
Multifoton görüntüleme sadece doku yüzeyinden sınırlı derinliklerde etkili olurken, pCLE ile herhangi bir derinlikte 3 μm çözünürlükte görüntüleme elde etmek mümkündür. Burada, iktal ve vahşi tip farelerin hipokampusundaki mikrovasküler dinamikleri ölçmek için pCLE görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Bu protokolün amacı, duvar hücreleri tarafından yönlendirilen nöbetler sırasında kılcal kan akışı etkilerini aydınlatmak için spesifik uygulamasında fiber-optik-demet bağlantılı klinik öncesi konfokal lazer taramalı endomikroskopiyi (pCLE) tanımlamaktır. İn vitro ve in vivo kortikal görüntüleme, perisitler tarafından yönlendirilen kılcal daralmaların, sağlıklı hayvanlarda fonksiyonel lokal nöral aktivitenin yanı sıra ilaç uygulamasından da kaynaklanabileceğini göstermiştir. Burada, epilepside nöral dejenerasyonda mikrovasküler dinamiklerin rolünü belirlemek için pCLE'nin nasıl kullanılacağına dair bir protokol sunulmaktadır, herhangi bir doku derinliğinde (özellikle hipokampusta). Anesteziklerin nöral aktivite üzerindeki potansiyel yan etkilerini ele almak için uyanık hayvanlarda pCLE kaydetmek için uyarlanmış bir baş desteği tekniğini tanımladık. Bu yöntemler kullanılarak, beynin derin sinir yapılarında birkaç saat boyunca elektrofizyolojik ve görüntüleme kayıtları yapılabilir.
Introduction
Diğer mikroskobik görüntüleme yöntemlerinin 1,2,3,4,5,6,7,8 aksine, in vivo fiber optik tabanlı konfokal mikroskopi, herhangi bir beyin bölgesinde, herhangi bir derinlikte, yüksek hızda (görüş alanı boyutuna bağlı olarak 240 Hz'e kadar) kan akış dinamiklerinin ölçülmesine olanak tanır 9 ). Bir fiber optik prob, 3 μm çözünürlükte in vivo konfokal lazer tarama görüntülemeye olanak tanır, çünkü probun ucu (5000-6000 3 μm çapında ayrı liflerden oluşan bir demetten oluşan lenssiz bir objektif) bir mikroelektrot doğruluğu ile ilgilenilen floresan hedefinin 15 μm içinde konumlandırılabilir. İn vivo iki fotonlu görüntülemede olduğu gibi, floroforlar görüntüleme hedefine önceden dahil edilmelidir. Örneğin, floresein dekstran (veya kuantum noktaları) vaskülatüre enjekte edilebilir veya genetik olarak kodlanmış floresan proteinler hücrelere transfekte edilebilir veya Oregon Green BAPTA-1 gibi floresan boyalar, görüntülemeden önce hücrelere toplu olarak yüklenebilir.
Bu teknikleri kullanan son araştırmalar, iktal kılcal vazospazmlara yol açan duvar hücresi motor aktivitesinin - nöbetlersırasında duvar hücrelerinin pozisyonunda meydana gelen ani daralmalar 9 - iktal hipokampusta nörodejenerasyona katkıda bulunabileceğini bulmuştur9. Önceki görüntüleme çalışmaları ilaç uygulamalarına bağlı in vitro ve in vivo perisit daralmalarıgösterirken 6,7,10,11,12, Leal-Campanario ve ark. murin beyninde in vivo spontan kılcal daralmaların ilk kanıtını buldu. İnsan temporal lob epilepsisi ile alaka kurmak için, insan epizodik ataksisi tip 1 15'in genetik bir modeli olan erkek (P30-40 eski) nakavt (KO) Kv1.1 (kcna1-null) fareler14,15 (JAX stok #003532) üzerinde çalıştılar. Perisitler, spontan epileptik hayvanlarda ve onların vahşi tip (WT) yavrularında hem patolojik hem de fizyolojik hipokampal duvar vazokonstriksiyonlarını9 tetikledi. Bu gözlemler, kainik asit ile epileptik hale getirilen WT hayvanlarında tekrarlandı ve böylece diğer epilepsi formlarına genellendiklerini gösterdi. Leal-Campanario ve arkadaşları ayrıca, yeni stereolojik mikroskopi yaklaşımları kullanarak, epileptik hayvanlardaki apoptotik (ancak sağlıklı olmayan) nöronların hipokampal mikrovaskülatüre uzamsal olarak bağlandığını belirlediler. Eksitotoksisitenin vaskülatür ile bilinen bir uzamsal ilişkisi olmadığından, bu sonuç anormal kapiller vazospazmik iskemiye bağlı hipoksinin epilepside nörodejenerasyona katkıda bulunduğunu göstermiştir. Şekil 1, genel kurulumun bir şemasını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Yönergelerini takip eder. Tüm prosedürler Barrow Nöroloji Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Kraniyotomi için stereotaksik konumlandırma
- Fareyi tartın ve ardından bir ketamin-ksilazin (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.) kokteyli ile uyuşturun. Kuyruk ve/veya ayak parmağı sıkışmasına tepki vermediğini gözlemleyerek hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
- Farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin ve ilk anestezi implantasyon ameliyatı sırasında vücut sıcaklığını sürekli olarak izlemek için bir rektal termometre kullanın (Şekil 2A).
- Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürün.
- Hayvanın başını, bir fare adaptörü ile donatılmış kemirgen stereotaksik bir çerçevede sabitleyin. Fareyi stereotaksik çerçevede düzgün bir şekilde yönlendirmek için, hayvanın dişlerini ısırma çubuğunun deliğine yerleştirin (Şekil 2A ve Şekil 3A, madde g). Burun kelepçesini tam oturana kadar sıkın (Şekil 2A,B ve Şekil 3A, madde h). Farenin vücut konumu mümkün olduğunca düz olmalıdır ( Şekil 2A'daki gibi).
- Kafatasının elmacık süreçlerini sıkıca kenetlemek için çene tutucu manşetli fare kulak çubuklarını (Şekil 2A ve Şekil 3A, madde i) kullanarak hayvanın kafasını daha da sabitleyin.
NOT: Sabitlendikten sonra, farenin kafasında yatay hareket aralığı olmamalıdır.
- Kafatasının elmacık süreçlerini sıkıca kenetlemek için çene tutucu manşetli fare kulak çubuklarını (Şekil 2A ve Şekil 3A, madde i) kullanarak hayvanın kafasını daha da sabitleyin.
- Fare stereotaksik çerçeveye ayarlandıktan sonra (Şekil 3B, madde j), kafa derisini 2-3 kez klor-heksedin ovma ile silerek temizleyin ve sterilize edin, ardından her seferinde alkollü durulama yapın. Ardından, başın üstüne topikal lidokain uygulayın.
- İnce makas veya bıçak kullanarak kafatasının sagital orta hattı boyunca posteriordan anteriora orta hat boyunca bir kesi yapın (kesiyi kafatasının tabanından başlatın ve gözler arasında tamamlayın; 12-15 mm). Kafatasını ortaya çıkarmak ve çalışma alanını en üst düzeye çıkarmak için kafa derisinin kenarlarını dört adet 28 mm bulldog serrefine kelepçe ile geri çekin (Şekil 2B ve Şekil 3C).
- Periosteumu insizyonun kenarlarına kazımak için bir neşter veya mikrospatula (Şekil 3C) kullanın. Boynun arkasındaki kasları dikkatlice geri çekmek için doku ayırıcı makas veya forseps kullanın (Şekil 3C) (Şekil 2B).
- Kraniyal sütürlerin görselleştirilmesini optimize etmek için kafatasının üst kısmını alkol veya% 30 hidrojen peroksit ile nemlendirilmiş pamuk uçlu bir aplikatör ile kurulayın. Bağ dokusu çıkarıldıktan sonra kafatasına salin uygulayın.
- Farenin kafası stereotaksik aparatta stabilize edildikten sonra, elektrot tutucusuna bir şırınga iğne ucu (21 G) yerleştirin (Şekil 3B, madde l) ve elektrot tutucuyu stereotaksik mikromanipülatöre takın, iğne ucunu kafatası seviyesine indirin (Şekil 2D).
- Kafatasının yüksekliğini bregmanın arkasındaki herhangi bir mesafede (yani -2.0 mm) ve kafatasının her iki tarafında orta hattan yanal iki eşit mesafede (yani ± 1.5 mm) ölçerek kafatasının medial-lateral yönünü ayarlayın (Şekil 2D). Dorsal-ventral yönde 0,05 mm'den daha az olan konumlar arasında bir yükseklik farkı hedefleyin.
- 0,05 mm'den büyükse, ısırma çubuğunu kullanarak farenin kafatasını döndürün veya kulak çubuklarını dikkatlice gevşeterek, gerektiğinde başı ve kulak çubuklarını yanal olarak kaydırarak ve ardından kulak çubuklarını yeniden sıkarak farenin kafasını yeniden konumlandırın.
- Kafatası stereotaksik cihaza yerleştirildikten sonra, anteroposterior (AP), medial lateral (ML) ve dorsal ventral (DV) eksenler boyunca bregma ve lambda kafatası sütürlerinin stereotaktik koordinatlarını belirleyin ve kaydedin.
- Stereotaksik atlas yardımıyla hedef noktayı (sağ hipokampus) belirleyin. Ardından, kafatasında bregmaya göre hedef nokta koordinatlarını bulun (AP: -2.7 mm, ML: -2.7 mm) (Şekil 2E).
- Cerrahi bir işaretleyici kullanarak, kafatası üzerindeki 1.4 mm x 2 mm'lik bir görüntüleme penceresinin dört köşesini, sonraki kraniotomi için doğrudan hipokampusun (Şekil 2F) üzerindeki hedef noktanın etrafında ortalanmış noktalarla işaretleyin.
- İki ek nokta çizmek için cerrahi işaretleyiciyi kullanın: biri sol üst parietal kemiğin üzerine (Şekil 2G) ve diğeri sağ ön kemiğin üzerine (Şekil 2H), iki kemik vidasının gelecekteki yerleşimini belirtmek için (Şekil 3A, madde b) kafa başlığını (Şekil 3B, madde m) kafatasına sabitleyecek.
- Epidural EEG kayıt elektrotlarının nereye yerleştirileceğini gösteren üç nokta daha çizmek için cerrahi işaretleyiciyi kullanın: orta hattın her iki tarafına 1 mm yerleştirilmiş bir nokta ve Lambda'nın 1 mm arkasına yerleştirilmiş orta hatta bir ek nokta (Şekil 2E, Şekil 4A ve Şekil 5B).
2. Head-Cap kurulumu
- 0.7 mm çapında bir çapak kullanarak (Şekil 3C), kafatasında kemik vidalarının yerleşimini gösteren nokta konumlarında dikkatlice iki küçük delik açın (yukarıdaki adım 1.15'e bakın). Ardından, daha önce %70-80 etanol ile dezenfekte edilmiş iki kemik vidasını (paslanmaz çelik oluklu, uzunluk: 4 mm; çap: 0,85 mm) alın ve ek kafa kapağı stabilitesi için kafatasına vidalayın (Şekil 2I-J ve Şekil 3A, madde b).
- Vida uçlarının kemiğin altından kafatası boşluğuna doğru çıkıntı yapmadığından ve beyne zarar verme riskine girmediğinden emin olun. İki kemik vidasından birinin iki kafa kapağı vidasının önünde, diğerinin ise arkasında olacağına dikkat edin (Şekil 2G-J).
- Kafatasını soğutmak ve temizlemek için üzerine tuzlu su püskürtün. Ardından kafatasını tamamen kurutun ve vidaların etrafına ince bir siyanoakrilat tabakası uygulayın.
- Özel bir hizalama parçası kullanın (Şekil 3A, madde c) clampstereotaksik cihaza monte edilmiş mikro sürücüye (Şekil 2F-J ve Şekil 3A, öğe d), böylece kafa başlığının konumu orta hat boyunca hizalanır, ön çıkıntı bregma üzerinde. Bu özel paslanmaz çelik parça L şeklindedir (90° açılı), 4 mm ile ayrılmış iki delik vardır (Şekil 2FJ ve Şekil 3A, öğe c).
- L şeklindeki hizalama parçasını konumlandırmak için stereotaksik manipülatörü kullanın, iki Dolgu Başlı Oluklu tahrik vidası takılı (M1.6 x 0.35 Metrik Kaba, 12 mm Uzunluk; Şekil 3A, madde a) bregma üzerinde, vidaların tabanı kafatası üzerinde düz durana kadar, kafatasına baskı uygulamamaya dikkat ederek (Şekil 2I-J).
- Vidaların tabanını kafatasına tutturmak için siyanoakrilat ve ardından diş çimentosu uygulayın. Hipokampus üzerindeki görüntüleme penceresi referans işaretlerini engellememeye dikkat edin (Şekil 2K).
3. Görüntüleme penceresi kraniyotomi ameliyatı
- Görüntüleme penceresinin köşelerini gösteren kraniyotomi referans işaretlerinin konumlarının her birinde (yukarıdaki adım 1.14'e bakın), 0,7 mm çapında bir çapak deliği açın, ardından 1,4 mm x 2 mm kraniyotomi penceresinin çevresini matkapla yinelemeli olarak daha derin kesiklerle nazikçe tanımlayın (Şekil 2L).
- İnce ve kırılgan olan, kalınlığı yaklaşık 300 μm olan kafatasını çok derin veya çok fazla kuvvetle delmemeye özen gösterin. Kemik flebi tamamlandıktan sonra, gevşek kanadı bir neşterin ucuyla yukarı kaldırın ve alttaki dura materyale zarar vermemeye dikkat edin.
- Açık pencereyi kemik balmumu ile örtün (Şekil 2M).
- 0.9 mm çapında bir çapak kullanarak, epidural EEG elektrotlarının gelecekteki yerleşimi için üç delik açın (yukarıdaki adım 1.15'e bakın) dura mater'i kesmemeye dikkat edin (Şekil 2E, L).
- Üç deliği kemik mumu ile örtün.
- Kraniyotomileri kapatmamaya dikkat ederek, kemik mumu kaplı görüntüleme penceresinin ve EEG deliklerinin kenarlarına siyanoakrilat uygulayın (Şekil 2L).
- Görüntüleme penceresini ve EEG deliklerini kapsayan ve onu önceden çimentolu başlık başlığına bağlayan bir diş çimentosu duvarı oluşturun (Şekil 2M ve Şekil 3B, madde m).
- Çimentoyu en az 10 dakika kurumaya bırakın.
- Gevşek yara kenarlarını 4-0 veya 5-0 siyah örgülü ipek kullanarak basit kesintili dikişlerle kapatın (Şekil 2N ve Şekil 3C).
4. Ameliyat sonrası
- Yaranın kenarındaki hissi azaltmak için açıkta kalan cildin etrafına lidokain merhem uygulamak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
- Neosporin'i açıkta kalan cilde uygulamak için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
- Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın (Şekil 2N).
- Cerrahi sonrası analjezi için ketoprofen (5 mg / kg) IP veya IM enjekte edin.
- Hayvanı uyanık ve hareket edene kadar gözlemleyin (bu genellikle birkaç dakika içinde gerçekleşir).
- Hayvanı ılık bir kafese koyun ve içene veya yene ve hayvan barınağına transfer edilmeye hazır olana kadar iyileşmesini izlemeye devam edin.
- Ameliyattan sonra yaklaşık bir hafta boyunca hayvanı günde en az bir kez kontrol edin, herhangi bir kayıtsız davranış ve/veya yetersiz yeme/içme belirtisi olup olmadığını izleyin (Şekil 2O).
5. Boya enjeksiyonu ve EEG kaydı
- Kayıtları başlatmak için başlık implantasyonu ameliyatından sonra en az bir gün bekleyin.
- Fareyi, stereotaksik çerçeve içinde, gövdesine kalıplanmış bir köpük tutucu cihaza yerleştirin (Şekil 3B, madde n ve j).
- Başlık kapağını (Şekil 3 B-I, madde m) stereotaksik çerçeveye takılan özel bir montaj çubuğuna sabitleyin (Şekil 3A,B, e ve j öğeleri ve Şekil 4A). E maddesinin uzun kesiti (Şekil 3A,B) 9.4 – 13 mm arasında bir uzunluğa sahip olmalıdır. f öğesini (1.5 cm x 0.5 cm boyutlarında, merkezden merkeze 4 mm ayrılmış iki deliği olan bir montaj plakası) e öğesine sabitleyin (Şekil 3A,B, e, f ve k öğeleri). Bu hizalama sistemi, görüntüleme seansları boyunca uyanık fareyi stereotaksik çerçeveye güvenli bir şekilde konumlandıracaktır (Şekil 4).
- Epidural EEG kayıt elektrotlarını (Şekil 5A), toprak elektrotlarını (beyaz teller) arka merkezi deliğe ve kayıt elektrotlarını (kırmızı teller) ön sol ve sağ deliklere yerleştirin (Şekil 2E, Şekil 4E ve Şekil 5E). Elektrik temasını optimize etmek için tellerin her birini kafatası ile dura mater arasında L şeklinde konumlandırın (Şekil 5C).
- Hipokampus içindeki kan akışını görselleştirmek için kuyruk damarına yeşil floresein lizin ile sabitlenebilir dekstran (0.2 mL / 25 g vücut ağırlıkça %5 w / w) enjekte edin.
- Enjeksiyondan önce farenin kuyruğunun merkezi damarının genişlemesini arttırmak için aşağıdaki stratejilerden birini veya birkaçını kullanın: a) Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak merkezi damara %70 etanol uygulayın; b) Kuyruğu 1-3 dakika ılık suya (35-40 °C) batırın; c) Kuyruğu birkaç dakika ısıtma lambasına maruz bırakın.
- Farenin kuyruğunu iki parmağınızla sabitleyin ve derinin hemen altında bulunan merkezi damarı bulun. İğneyi (entegre iğne 30G'li ultra ince insülin şırıngası), eğim yukarı bakacak şekilde, kuyruğun tabanının yaklaşık yarısı ila üçte ikisi arasında damarın içine sokun. Enjeksiyon sırasında iğneyi kuyruğa paralel tutun.
- İğnenin veya kuyruğun konumunda herhangi bir değişiklik olmamasına dikkat ederek boyayı yavaş ve sabit bir şekilde enjekte edin.
NOT: Şırınga pistonuna basıldığında herhangi bir direnç olmamalıdır. - Enjeksiyonu tamamladıktan sonra, iğneyi geri çekin ve damarı kapatmak için delinme bölgesine hafif bir baskı uygulayın.
- Pıhtılaşmanın gerçekleşmesine izin verin.
6. İn vivo fiber-optik-demet-bağlı klinik öncesi konfokal lazer taramalı endomikroskopi (pCLE)
- Kuyruk damarı enjeksiyonunun hemen ardından (yukarıdaki adım 5.5.3), 300 μm eğimli fiber optik demeti (her demette 5000–7000 3 μm fiber içerir) robotik stereotaksik sürücünün mobil koluna aşağı yönde sıkıştırın.
- Kemik mumunu kraniyotomiden çıkarın.
- Bir şırınga iğnesinin bükülmüş ucunu kullanarak durayı çıkarın.
- Robotik konumlandırma sistemini kullanarak, önce fiber objektifi, ucu korteks yüzeyindeki z ekseninde sıfırlanacak şekilde uygun ön-arka ve sol-sağ stereotaksik konuma taşıyın.
- EEG kaydını başlatın (Şekil 5D).
- Fiber objektifin arka düzleminin konfokal lazer taramasını başlatın, ardından beyindeki hedef derinliğe ulaşana kadar robotik mikro sürücünün z-kontrollerini kullanarak objektifi z ekseninde yavaşça alçaltın (Şekil 4C). Alçalırken görüntüleme sonuçlarını mikroskobik yazılımda görüntüleyin.
- Fiber ucu hedef X-Y-Z kayıt bölgesi içindeyse ve iki veya daha fazla damar görüntüleme penceresinin FOV'una giriyorsa, inişi durdurun ve video kayıtlarını başlatın. Cellvizio Lab'ın görüntüleme yazılımını kullanarak 11,7 Hz'de kan akışının canlı tam alan hızlandırılmış videolarını elde edin. (Daha küçük bir FOV ile daha yüksek hızlar elde edilebilir). Kayıtlar bir seferde 4-5 saat, gerekirse ardışık günlerde yapılabilir.
- İğnenin ucuna sabitlenmiş eğimli silikon borulu 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, su ile öğütülmüş fare peletleri ile yapılan macunu periyodik olarak sağlayarak kayıtlar sırasında hayvanı besleyin.
- Görüntüleme oturumunun sonunda kayıtları sonlandırın.
- EEG derivasyonlarını nazikçe çıkarın ve Tergazyme ile temizleyin.
- Fiberi z giriş ekseni boyunca ters çevirerek fiber optik demeti hayvanın beyninden yavaşça çıkarın.
- Hayvanı baş direğinden ve vücut kısıtlamalarından serbest bırakın.
- Uygunsa, kan damarlarını görselleştirmek ve immünohistokimya yapmak için gerekli ötenazi ve doku işleme protokollerini izleyin.
- Gelecekteki bir oturumda aynı hayvandan kayıt yapmayı planlıyorsanız, görüntüleme penceresini kemik mumu veya silastik ile kapatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemleri, hipokampusta anormal perisit kaynaklı kılcal vazospazmların (nöbetlerin bir sonucu olarak ortaya çıkan) iktal odakta hücre ölümüne katkıda bulunan açık hipoksiye neden olup olmayacağını değerlendirmek için geliştirdik 9,13.
Kafa başlığının geliştirilmesi ve uygun şekilde takılması, kayıtlarda yüksek stabilite sağladı ve hem iktal hem de interiktal dönemlerde vahşi tip ve epileptik uyanık farelerin hipokampusunun derinliklerinde EEG ve kan akışının eşzamanlı olarak kaydedilmesine izin verdi. Nöbetlerle ilgili kan akışı olaylarının yakalanması, hem indüklenen hem de doğal olarak meydana gelen epileptik nöbetlere yanıt olarak aperiyodik kan akışı olaylarının (vazospazmlar gibi) yakalanabilmesi için uzun süreler boyunca kayıt yapılmasını gerektirir. Kısıtlama sistemi, derin beyin mikrodamarlarının ve proksimal duvar hücrelerinin uzun saatler boyunca stabil kan akışı kayıtlarına izin verdi (Şekil 6AR). Tüm mikrodamarlarda, etiketli duvar hücrelerinin pozisyonlarında kan akışı durmalarının meydana geldiğini bulduk.
Standart bir stereotaksik atlastan iç koordinatlarla hedeflenen robotik bir stereotaksik cihaz kullanarak hipokampustaki damarları güvenilir bir şekilde konumlandırdık. Fiber kayıtların kalitesini, iki foton görüntülemenin ulaşabileceği derinliklerde, kortikal dokudan kan akışının ve eşdeğer vazospazmların yüksek çözünürlüklü iki fotonlu görüntüleme kayıtlarıyla karşılaştırarak doğruladık (Şekil 6S-AA). Geleneksel konfokal mikroskopi ile hipokampal duvar hücrelerinin doğru bir şekilde hedeflendiğini ve sadece daralmakla kalmayıp aynı zamanda uzamsal olarak arteriyollerdenuzak mikrodamarlardaki darlıklarla ilişkili olduklarını göstermek için kayıt bölgelerinde immünohistokimya kullanarak pCLE sonuçlarını doğruladık 15 (Şekil 7).
Bu yöntemlerle yayınlanan bulgular gerçekten de nöbetlerin neden olduğu anormal hipokampal kılcal vazospazmların yanı sıra Kv1.1 epileptik mutant farelerde ve kainat model epileptik farelerde ilişkili hücre ölümünü göstermektedir 9,13. Bu sonuçlar, anormal vazospazmlara bağlı nöbetler sırasında hücre ölümünde lokal iktal iskemi / hipoksinin rolünü göstermektedir ve iktal hücre ölümünün potansiyel mekanizmalarını genişleten artan bir çalışma grubuna katkıda bulunmaktadır.
Şekil 1: Deney tasarımının şematik gösterimi. Hem uyanık epileptik farelerin hem de WT yavrularının hipokampal kapillerlerinde konfokal mikroskopi yaparken EEG kaydettik. Kuyruk damarına floresein enjekte ettikten sonra, beynin derinliklerindeki kılcal kan akışı dinamiklerini kaydetmek için 0.3 mm uç çapına sahip bir fiber objektife sahip yeni bir klinik öncesi Konfokal Lazer taramalı Endomikroskopi (pCLE) kullandık. Sarı, kan akışının arttığını ve kırmızı, sabit veya azalan akışı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Başlık implantasyon cerrahisi için protokol. A) Anestezi uygulanan hayvan bir ısıtma yastığına yerleştirildi ve stereotaksik çerçeve içine yerleştirildi (bkz. Şekil 3B, madde j) ve fare kulak çubukları (Şekil 3A, madde i) ve çene tutucu manşetleri (Şekil 3A, madde g,h) ile bir ısıtma yastığı üzerine sabitlendi. B) Kraniyal sütürlerin açığa çıkması. C-D) Bregma ve Lambda ölçümleri. E) Hayvanın kafatası üzerindeki delme yerlerinin görselleştirilmesi. Siyah noktalar ve kare, hipokampus üzerinde pCLE yerleştirilmesine izin verecek pencereyi gösterir. İki kırmızı daire, EEG kayıt telleri için yerleştirme konumlarını işaretler. Beyaz nokta, EEG topraklama kablolarının takılma noktasını işaretler. F) Kafatasındaki dört siyah nokta, hipokampus üzerindeki görüntüleme penceresi kraniotomisinin gelecekteki köşelerini işaret ediyor. Stereotaktik mikro sürücü konumlandırıcıya bağlı başlık implantları (Şekil 3A, öğe a) ile özel hizalama parçası (Şekil 3A, öğe c). G-H) Bir arka (G) ve bir ön (H) olmak üzere iki ek nokta, başlık ankraj vidalarının gelecekteki yerini işaretler (Şekil 3A, madde b). I-J) İki küçük vida, kafa başlığını kafatasına sabitler (Şekil 3A, madde b). K) Siyanoakrilat ve diş çimentosu, I ve J panellerinden ankraj vidalarına uygulanır. L) Hipokampus üzerindeki görüntüleme penceresi kraniotomisi ve EEG elektrotları için üç delik açılmıştır. M) Görüntüleme odası, üç EEG deliğini ve görüntüleme penceresini çevrelemek için ek diş çimentosu ile bir seddenin şekillendirilmesiyle inşa edilir (Şekil 3B, madde i, m). N) Bitmiş başlığın üstten görünümü. O) İmplantasyon ameliyatından sonra iyileşen fare kafesine geri döner. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Protokolde kullanılan malzemeler (küçük harflerle numaralandırılmış belirli öğeler). A) Başlık başlığını yapmak için kullanılan malzemeler. (a) İki adet M1.6 x 12 mm makine vidası (başlık implantları). (b) Kafa başlığını kafatasına sabitlemek için iki küçük cıvata. (c) Ameliyat sırasında iki M4 vidayı sabitleyen, 1.6 mm aralıklı iki deliğe sahip özel L şeklinde paslanmaz çelik hizalama parçası. (d) Stereotaksik bir cihaza monte edilmiş standart bir mikro sürücü, c öğesini tutar. (e) Öğe c'deki iki delikle eşleşen bir (f) hizalama parçasına sahip özel bir montaj çubuğu. (g) Hayvanın kafasının konumunu sabitlemek için bir ısırma çubuğu ve (h) burun kelepçesi. B) Kayıtlar sırasında kurulum. (i) Anestezik implantasyon ameliyatı sırasında başlık f maddesine sabitlenir. (j) Stereotaksik bir çerçeve mikro sürücüyü konumlandırır (öğe d). (l) Mikrosürücüye (madde d) 21G'lik bir iğne takılır ve Bregma ve Lambda kraniyal sütürlerin konumlarını belirlemek için kullanılır. (m) Burada, farenin (n) köpük kaplı sınırlama tüpündeki (fare mevcut değil) konumunu göstermek için f öğesine iliştirilmiş simüle edilmiş bir başlık resmedilmiştir. Öğe n, kendisini farenin gövdesinin şekline göre şekillendirir. C) Ameliyatın yapılabilmesi için gerekli alet ve malzemeler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kayıt oturumu kurulumu. A) Hayvanın kafası sabittir. B) EEG kayıt tellerinin yeri. Beyaz EEG telleri kafatasının her iki yanına ayrı ayrı yerleştirilir. Kırmızı EEG telleri orta-alt (toprak) deliğe birlikte yerleştirilir. C) Fiber optik demet hedef pencereye yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: EEG kayıtları. A) Epidural EEG kayıtları, uyanık hayvandaki fiber optik pCLE kayıtlarıyla eş zamanlı olarak Physiotel F20-EET vericileri ile yapılır. B) EEG kayıtları için derivasyonların yerleştirilmesi için açılan deliklerin yeri. İki kırmızı uç, kırmızı noktalarla gösterilen iki deliğe gider. İki beyaz uç, beyaz nokta ile gösterilen deliğe birlikte yerleştirilir. Kırmızı kare, hayvanın hipokampusu üzerindeki hedef pencereyi belirtir. Farenin kafatasındaki 'B' harfi bregmayı gösterir. C) EEG kayıt telleri, kafatası ile dura maddesi arasındaki elektrik temasını arttırmak için L şeklinde bükülür. D) Uyanık farelerde EEG kayıtlarına örnekler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Farelerde duvar hücresi vazokonstriksiyonlarının kayıtları. A-R) Nöbet sırasında uyanık nakavt farelerde duvar hücrelerine (kırmızı, Alexa Fluor 647'nin intravenöz ven kuyruğu enjeksiyonu ile etiketlenmiş) kolokalize kılcal vazospazmın (yeşil damarlar, 2MD floresein-konjuge dekstran ile etiketlenmiş yeşil damarlar) in vivo fiber optik çift bantlı pCLE görüntüsü (ok, duvar hücresini ve ilişkili vazospazmı gösterir). Video 1 ve Video 2'ye bakın. S-W) İn vivo iki foton taramalı lazer mikroskobu (TPLSM), kılcal damar yığını (yeşil) ve vahşi tip bir farenin duvar hücreleri (kırmızı). Video 3'e bakın. X-Z) İn vivo kainik farelerin duvar hücresi lokalize (kırmızı) kılcal daralmasının TPLSM'si. Video 4'e bakın. AA) Beyaz çizgide ölçülen X-Z panellerinden damar daralmasının ölçülmesi. A-R panelleri için ölçekler= 5 μm; S-W= 25 μm; X-Z= 5 μm olur. Videolar 11.7 Hz'de kaydedildi. Leal-Campanario ve ark.8'den. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Kaydedilen beynin immünohistokimyası. A-B) Farklı büyütme oranlarındaki damarlara floresein dekstran (yeşil) enjekte edilir. Mavi renkte DAPI lekeli hücre çekirdekleri (beyaz oklar). A= 200 μm için ölçek çubuğu; B = 100 μm için ölçek çubuğu. C) Kırmızı kan hücresinin (kırmızı ok) açıkça görüldüğü floresein enjekte edilen beynin farklı bölümü. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: KO hipokampal kılcal damarda vazospazm ve duvar hücresi kan akımı (11.7 Hz) kaydedildi. Şekil 6AH'de aynı kayıttan karelere bakın. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 2: Vazospazm, lökosit tıkanıklıkları, kan akışı ve duvar hücreleri WT hipokampal kılcal damarda (11.7 Hz) kaydedildi. Şekil 6I-R'de aynı kayıttan karelere bakın. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 3: TPLSM ile kaydedilen in vivo WT fare parietal korteksinde düzgün olmayan kan akışı. Şekil 6SW'de aynı kayıttan karelere bakın. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 4: TPLSM ile kaydedilen kainik hayvanı ele geçiren parietal korteksten duvar hücresi güdümlü (kırmızı) kılcal (yeşil) daralma. Aynı kayıttan karelere bakın Şekil 6X-Z. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uyanık farelerde eşzamanlı elektrofizyolojik ve fiber optik pCLE deneyleri için bir baş başlığı kısıtlama sistemi geliştirdik ve anestezik ilaçlara bağlı potansiyel yanıt kontaminasyonunu azalttık. Başlık ve montaj aparatının yapımı kolaydır ve kronik uyanık davranan görüntüleme deneyleri için yeniden kullanılabilir. Kayıtların kalitesini, in vivo mikroskobik kan akışı görüntüleme için altın standart olan TPLSM'ye göre kontrol ettik.
Burada tanımladığımız protokolü uygulamak için yeterli cerrahi beceriler gereklidir. Ameliyat aseptik koşullar altında ve her zaman ameliyat mikroskobu altında yapılmalı, hipokampus üzerindeki pencereyi delerken dura materini sağlam bırakmaya özen gösterilmelidir. Büyük bir kan damarının üzerini kesmek istenmeyen kanama riski oluşturduğundan, altta yatan damar sistemine aşinalık önemlidir.
Hayvanı stereotaksik hizada doğru bir şekilde yerleştirmek, baş başlığını takmadan önce ön-arka düzlemin düz olmasını sağlar. Bu koruma, bir beyin atlası yardımıyla beyin lokuslarının yerini belirlemeyi kolaylaştırır.
Fare hareketi, damarlara zarar verebilir veya vazospazmların hatalı kayıtlarına (yani, gerçek vazohareket yerine lif hareketi) neden olabilir, bu nedenle kayıtlar sırasında hayvan hareketini azaltmak önemlidir. Emniyet borusu içindeki köpük dolgu, farenin stresini ve hareketini en aza indirirken kayıt seanslarının süresini uzatmaya yardımcı olur. Fareler köpüğün içine sıkıca oturmayı tercih eder, bu nedenle uygun montaj aşırı hareketi azaltır. Bu önlem olmadan, fareler mücadele edebilir. Fare mücadele belirtileri gösteriyorsa, kayıt oturumu sonlandırılmalıdır. Kayıtlar, fizyolojik stres reaksiyonları azaldıktan sonra ertesi gün devam edebilir. Kayıtlarımızda, hayvanlar çoğu zaman açıkça sakindi.
pCLE görüntüleme yöntemini en olumsuz etkileyen hareketin, prob beyin dokusuna diferansiyel olarak hareket ettiğinde meydana geldiğini not ediyoruz. Hayvanın nefes alması, nöbetleri ve hareketi, lif probunu dokuya göre değiştirmedikçe önemsizdir. Yani, görüntüleme probu dokuya farklı bir şekilde hareket ettiğinde, tüm görüntüleme alanı bir birim olarak hareket eder ve hareket artefaktlarını belirgin hale getirir. Bu nedenle, her zaman bir seferde iki veya daha fazla damardan kayıt yapmak çok önemlidir: tüm damarlar aynı anda hareket ederse, bunun nedeni lif kararsızlığı olabilir, oysa en az bir damar değişmezse, diğer damarlarda görülen değişiklikler muhtemelen vazospazmlar da dahil olmak üzere kan akışındaki gerçek değişikliklerden kaynaklanmaktadır.
pCLE görüntüleme yönteminin TPLSM ile karşılaştırıldığında bir sınırlaması, fiber probun pia'yı delmesi ve dolayısıyla beyne invaziv olmasıdır. Prob alçalırken, içinden geçtiği sinir dokusunda bir miktar hasara neden olur. Bu nedenle, her iki oturumda da aynı kesin koordinatlar kullanıldığında bile (ve genellikle yalnızca ilk kayıt oturumunun kısa bir süresi varsa mümkündür) art arda iki günde aynı gemiden kayıt yapmak son derece zor olabilir. Bu nedenle, kronik kayıt çalışmaları yürütürken, sonraki kayıt oturumlarında giderek daha fazla derinlikte kayıt yapmak çok önemlidir.
Kan akışı deneylerinin sonuçları, eksitotoksisitenin iktal hücre ölümü ve hipokampal skleroz için tek mekanik yol olmadığını göstermektedir13. Kılcal kan akımı kısıtlamasının iktal nörodejenerasyonda rol oynadığı bulgusu, burada açıklanan yöntemlerin, klinik tanı amacıyla vücudun herhangi bir derinliğinde ve herhangi bir dokuda mikroskobik kan akımı değişikliklerinin tanımlanmasına genişletilmesinin yolunu açmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.
Acknowledgments
Proje, Amerikan Epilepsi Derneği'nden bir Araştırma Girişimi Ödülü ve Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu'ndan SLM'ye bir ödülün yanı sıra Körlüğü Önleme Araştırmaları A.Ş.'den SUNY Downstate Sağlık Bilimleri Üniversitesi Oftalmoloji Bölümü'ne, New York Eyaleti İmparatorluğu İnovasyon Programı'na bir meydan okuma hibesi ile finanse edildi. ve Ulusal Bilim Vakfı (0726113, 0852636, & 1523614), Barrow Nöroloji Vakfı, Bayan Marian Rochelle, Bayan Grace Welton ve Dignity Health SEED ödüllerinden ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (0726113, 0852636, & 1523614) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden (Ödüller R01EY031971 VE R01CA258021), SLM ve SMC'ye federal hibeler. Bu çalışma aynı zamanda Sağlık İşlerinden Sorumlu Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi tarafından da desteklenmiştir. W81XWH-15-1-0138, SLM'ye L.-C., İspanya Eğitim Bakanlığı'ndan José Castillejo bursu ile desteklendi. Teknik tavsiyeleri ve yardımları için O. Caballero ve M. Ledo'ya teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. Mouton, P. R. , John Wiley & Sons, Inc. Ames, USA. (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
