Summary
Qui, presentiamo un protocollo per studiare la preferenza di impupamento delle larve mature di Ectropis grisescens in risposta a fattori di terreno (ad es., substrato tipo e contenuto di umidità) utilizzando analisi biologiche scelta. Presentiamo anche un protocollo di analisi biologiche no-scelta per determinare i fattori che influenzano i comportamenti di impupamento e sopravvivenza di E. grisescens.
Abstract
Molti insetti vivono sopra la terra come larve e adulti e come pupate sotto terra. Rispetto alle fasi sopra-terra dei loro cicli di vita, meno attenzione su influenza di fattori ambientali come questi insetti quando si impupano all'interno del suolo. Il looper di tè, Ectropis grisescens Warren (Lepidoptera: Geometridae), è una grave peste di piante da tè e ha causato le perdite economiche enormi in Cina del sud. I protocolli descritti qui proponiamo di indagare, attraverso analisi biologiche a scelta multipla, se maturo ultimo-instar E. grisescens larve possono discriminare variabili del suolo come il contenuto di tipo e l'umidità del substrato e determinare, attraverso no-scelta le analisi biologiche, l'impatto del contenuto substrato tipo e umidità sui comportamenti impupamento e il successo di emersione del E. grisescens. I risultati sarebbero migliorare la comprensione dell'ecologia impupamento di E. grisescens e possono portare intuizioni tattiche di gestione del suolo per la soppressione E. grisescens popolazioni. Inoltre, queste analisi biologiche possono essere modificate per studiare le influenze di vari fattori sui comportamenti impupamento e sopravvivenza dei parassiti del terreno-pupating.
Introduction
Rispetto agli stadi larvali e adulti di insetti, stadio pupale è altamente vulnerabile a causa della limitata capacità mobile delle pupe, che non possono sfuggire rapidamente da situazioni pericolose. Pupating sotto la terra è una strategia comune utilizzata da diversi gruppi di insetti (ad es., negli ordini Diptera1,2,3,4,5di coleotteri, imenotteri6, Tisanotteri7e lepidotteri8,9,10,11,12) per proteggerli dai predatori fuoriterra e pericoli per l'ambiente. Molti di loro sono gravi agricolo e forestale parassiti1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12. Le larve mature di questi insetti del suolo-pupating solitamente lasciano loro padroni di casa, cadono a terra, vagano per trovare un sito idoneo, traforare il suolo e costruire una camera di pupal per pupating8,10.
Il looper di tè, Ectropis grisescens Warren (Lepidoptera: Geometridae), è uno dei più significativi defogliatore parassiti del tè pianta Camellia sinensis L.13. Anche se questa specie venne descritta nel 1894, è stato erroneamente identificato come Ectropis obliqua Prout (Lepidoptera: Geometridae) in passato decenni14,15. Le differenze nella morfologia, biologia e distribuzione geografica tra le due specie di pari livello sono stati descritti in alcuni recenti studi14,15,16. Per esempio, Zhang et al. 15 riferito che obliquo E. si è verificato principalmente ai confini di tre province (Anhui, Jiangsu e Zhejiang) della Cina, mentre E. grisescens ha una distribuzione molto più ampia rispetto ai obliquo E.. Pertanto, le perdite economiche causate da E. grisescens sono in gran parte trascurate, e la conoscenza di questo parassita deve essere ampiamente rivista e rinnovata16,17,18,19 . Nostri studi precedenti hanno mostrato che E. grisescens preferiscono pupate all'interno del terreno, ma potrebbe anche pupate quando il terreno non è disponibile (no-impupamento-substrato condizioni)11,12.
Questo documento fornisce una procedura dettagliata per (1) determinare la preferenza di impupamento di E. grisescens in risposta a fattori quali il tipo di substrato e umidità contenuti utilizzando analisi biologiche a scelta multipla e (2) determinare l'impatto dei fattori abiotici sui comportamenti di impupamento e successo di emersione di E. grisescens utilizzando analisi biologiche no-scelta. Tutte queste analisi biologiche sono condotte in condizioni di laboratorio ben controllato. Inoltre, queste analisi biologiche sono adattate per valutare l'influenza di altri fattori sui comportamenti impupamento e la sopravvivenza di diversi insetti del suolo-pupating.
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Protocol
1. umidità-scelta le analisi biologiche per determinare impupamento preferenza di E. grisescens
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Come ottenere mature ultimo-instar larve di E. grisescens
- Tagliare i germogli freschi (30-40 cm di lunghezza) di piante di tè (Camellia sinensis L.). Inserire 25-30 germogli in un matraccio da triangolare a 250 mL. Riempire il pallone con acqua del rubinetto. Mettere 3-4 boccette (con germogli di tè) in una bacinella di plastica (lato superiore: 51 cm di diametro; lato inferiore: diametro 40 cm; altezza: 16 cm).
- Rilasciare le larve di 1.000-2.000 (secondo al quinto instar) della Colonia laboratorio di E. grisescens sulle foglie dei germogli di tè in ogni bacino. Mantenere queste larve alle condizioni di laboratorio controllate [un fotoperiodo di 14 h di luce seguita da 10 h di buio (14:10 L:D), 60-90% di umidità relativa (RH) e 24-28 ° C]. Trasferire con cautela le larve su foglie fresche di mano ogni 1-2 d. Ogni giorno rimuovere feci e detriti dal fondo dei bacini.
- Selezionare mature ultimo-instar larve che cadono dalle foglie dei germogli tè e vagano attivamente sul fondo del bacino. Ottenere almeno 240 larve mature per garantire che abbastanza larve sono disponibili per le analisi biologiche.
Nota: Selezionare solo le larve attivamente errante per gli esperimenti. Non selezionare le larve che rimangono sulle foglie, perché queste non sono pronte a pupate. Inoltre, non selezionare membranose con attività limitate mobile perché essi non attivamente cerca le giuste condizioni dopo essere stato rilasciato in arene analisi biologica.
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Preparazione del substrato
- Raccogliere e identificare 4 tipi di substrato (ad es., sabbia, terriccio sabbioso 1, sabbia terriccio 2 e limo del terriccio) utilizzando il metodo di Idrometro20. Sterilizzare il terreno e la sabbia a 80 ° C forno essiccatore per > 3 d e quindi asciugare completamente il terreno e la sabbia a 50 ° C per diverse settimane fino a quando il peso a secco dei campioni substrato non cambia piu ' nel tempo.
- Terreno il terreno asciutto con mortai e pestelli di legno. Setacciare la sabbia e il terreno con messa a terra attraverso un setaccio di 3 mm e conservarle in sacchetti di plastica sigillabili.
- Calcolare il contenuto di umidità di ogni substrato (sabbia, sabbia terriccio 1, sabbia terriccio 2 o limo terriccio) come segue2:
- Aggiungere la quantità necessaria di acqua distillata in sacchetti di plastica sigillabili contenente il terreno asciutto o sabbia per preparare 5%-, 20%-, 35%-, 50%, 65% e 80%-umidità del substrato. Mescolare bene l'acqua distillata e il terreno o sabbia.
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Preparazione di analisi biologica arena
- Dividere equamente i contenitori in polipropilene (lato superiore: 20,0 cm di lunghezza x 13.5 cm in larghezza, lato inferiore: 17,0 cm di lunghezza x 10.0 cm di larghezza, altezza: 6,5 cm) in 6 camere con lenzuola impermeabile cloruro di polivinile (PVC) (altezza: 3,5 cm). Difficoltà i fogli di PVC e sigillare le fessure con colla a caldo.
Nota: Sigillare completamente ogni crepa per evitare acqua permeazione. - Per ogni test, riempire le 6 camere utilizzando lo stesso tipo di substrato con contenuto di umidità differenti (5%-, 20%-, 35%-, 50%, 65% e 80% umidità) (Figura 1a).
Nota: Utilizzare solo 1 tipo di substrato del contenuto di umidità in ogni test. Assegnare in modo casuale l'ordine delle sezioni che contengono il substrato con il contenuto di umidità 6. - Incollare 4-6 pezzi di foglie di tè fresco usando piccoli pezzi di nastro per coprire la superficie interna dei coperchi dei contenitori in polipropilene (Figura 1b).
- Dividere equamente i contenitori in polipropilene (lato superiore: 20,0 cm di lunghezza x 13.5 cm in larghezza, lato inferiore: 17,0 cm di lunghezza x 10.0 cm di larghezza, altezza: 6,5 cm) in 6 camere con lenzuola impermeabile cloruro di polivinile (PVC) (altezza: 3,5 cm). Difficoltà i fogli di PVC e sigillare le fessure con colla a caldo.
Figura 1: esempi di arene di analisi biologica per i test scelta. (un) impermeabile fogli di cloruro di polivinile (PVC) vengono utilizzati per dividere equamente i contenitori in polipropilene in 6 camere. Fogli di PVC sono fissati con colla a caldo, e tutte le crepe sono accuratamente sigillate. In questo esempio, terriccio sabbioso 2 con contenuto di umidità differenti (5%, 20%, 35%, 50%, 65% e 80% umidità) vengono utilizzati per riempire le camere negli ordini assegnati in modo casuale. (b) il tè fresco foglie vengono incollate sul lato interno delle palpebre dove il maturo Ectropis grisescens larve saranno rilasciate. (c) PVC fogli vengono utilizzati per dividere equamente i contenitori in polipropilene in 4 alloggiamenti, che sono pieni di 4 tipi di substrati (sabbia, sabbia terriccio 1, sabbia terriccio 2 e limo del terriccio) al 50% di umidità. Questa figura è stata modificata da Wang et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Impostazione di analisi biologica e registrazione dati
- Versione 30 mature ultimo-instar larve (ottenute al passaggio 1.1.3) sulle foglie di tè fresco incollate sul coperchio del contenitore in polipropilene. Capovolgere con cautela il coperchio e coprire ermeticamente il contenitore in polipropilene.
- Ripeti ogni prova 8x. Mantenere le arene di analisi biologica in un ambiente di camera ambientale presso un fotoperiodo di 14:10 (L:D) e 26 ° C.
- Il giorno 5, contare il numero di pupe sulla superficie del terreno in ogni camera. Inoltre, smantellare le analisi biologiche e contare il numero di pupe all'interno del substrato.
Nota: Solo contare le pupe dal vivo su o all'interno del substrato. Verificare la fattibilità di pupe osservando movimenti addominali dopo aver toccato le pupe usando il forcipe.
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Analisi dei dati
- Per ogni test, calcolare la percentuale di pupe trovato in ogni alloggiamento di ogni replica. Trasferire i dati di percentuale per il rapporto di log utilizzando il metodo fornito da Kucera e Malmgren21.
- Compara la percentuale delle pupe (dati trasformati) in ogni camera usando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). Impostare i livelli di significatività a α = 0.05 per ogni test.
2. analisi biologiche substrato-scelta per determinare la preferenza di impupamento di E. grisescens
- Ripetere il passaggio 1.1 ottenere mature ultimo-instar larve e passo 1.2 per preparare il substrato con contenuto di umidità diversi. Questa volta, sono necessari solo 20%, 50% e 80%-umidità del substrato.
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Preparazione delle arene analisi biologica
- Simile al punto 1.3.1, ugualmente dividere i contenitori in polipropilene in 4 sezioni utilizzando teli in PVC. Difficoltà i fogli di PVC e sigillare le fessure con colla a caldo.
- Per ogni test, riempire le camere con i 4 tipi di substrati (sabbia, sabbia terriccio 1, sabbia terriccio 2 e limo del terriccio) che hanno lo stesso contenuto di umidità (20%, 50% o 80% umidità) con casualmente assegnato ordini (Figura 1C). Ripetere il passaggio 1.3.3 per preparare i coperchi.
- Ripetere il passaggio 1.4 per impostare analisi biologiche e registrare i dati e passo 1,5 per analizzare i dati.
3. No-scelta le analisi biologiche per determinare il comportamento del suolo-burrowing e il successo di emersione di E. grisescens
- Ripetere il passaggio 1.1 per ottenere le larve di ultimo-instar mature e passo 1.2 per preparare i 4 substrati (sabbia, sabbia terriccio 1, sabbia terriccio 2 e limo del terriccio) alle 3 contenuto di umidità (20%, 50% e 80% umidità).
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Impostazione di analisi biologica
- Aggiungere il substrato in un contenitore di plastica (lato superiore: 11,5 cm di diametro; lato inferiore: 8,5 cm di diametro; altezza: 6,5 cm) ad una profondità di 3 cm. In totale, assicurarsi che non ci saranno 12 trattamenti (le combinazioni di 4 tipi di substrato e 3 contenuti di umidità). Ripetere ogni trattamento 7 x.
- Versione 15 mature ultimo-instar larve sul substrato di ogni arena di analisi biologica. Sigillare i contenitori ermeticamente coprendo i coperchi. Mantenere le analisi biologiche in un ambiente di camera ambientale presso un fotoperiodo di 14:10 (L:D) e 26 ° C.
Nota: Non ci sarà alcun bisogno di incollare le foglie di tè fresco sui coperchi come accennato nelle analisi biologiche scelta.
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Analisi e registrazione dei dati
- Il giorno 3, contare il numero di pupe e qualsiasi larve morte sulla superficie del substrato di ogni replica. Calcolare la percentuale di individui E. grisescens che scavava nel substrato come segue:
- Registrare il numero di adulti emergenti ogni giorno fino a quando non più adulto è emerso per 15 d. calcolare il successo di emergere come segue:
- Confrontare la percentuale di individui rintanati e il successo di emergere tra i trattamenti utilizzando One-way ANOVA. Impostare i livelli di significatività a α = 0.05.
- Il giorno 3, contare il numero di pupe e qualsiasi larve morte sulla superficie del substrato di ogni replica. Calcolare la percentuale di individui E. grisescens che scavava nel substrato come segue:
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Representative Results
Le analisi biologiche di umidità-scelta ha mostrato che significativamente più individui E. grisescens popolate su o entro il 5% e 35% umidità sabbia rispetto alla sabbia umidità del 80% (Figura 2a). Tuttavia, significativamente più individui preferiscono pupate su o all'interno del suolo (terriccio sabbioso 1 e 2 e del terriccio limo) che aveva un contenuto di umidità intermedia (figure 2b - 2d).
Figura 2: risultati da analisi biologiche umidità-scelta. Questi pannelli mostrano le percentuali di pupe live trovati in ogni alloggiamento contenente il contenuto di umidità differenti (5%, 20%, 35%, 50%, 65% e 80% umidità) di (un) sabbia, (b) terriccio terriccio sabbioso 1, sandy (c) 2 o terriccio limo (d). I dati sono presentati come media ± SE. Le lettere diverse indicano differenze significative (P < 0,05). Questa figura è stata modificata da Wang et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le analisi biologiche del substrato-scelta ha mostrato che sabbia era significativamente più preferito da E. grisescens individui rispetto al terriccio sabbioso (1 e 2) sotto la condizione di umidità del 20% (Figura 3a). Non c'era differenza significativa nelle percentuali di pupe trovati in sezioni contenenti i 4 substrati ad un contenuto di umidità del 50% (Figura 3b). Significativamente più individui popolate su o all'interno di sabbia che il o gli altri substrati sotto la condizione di umidità del 80% (Figura 3C).
Figura 3: risultati da analisi biologiche substrato-scelta. Questi pannelli mostrano le percentuali di pupe live trovati in ogni camera contenente sabbia, terriccio sabbioso 1, terriccio sabbioso 2, o limo del terriccio a (un) un 20%-, (b) un 50%-, o (c), un contenuto di umidità del 80%. I dati sono presentati come media ± SE. Le lettere diverse indicano differenze significative (P < 0,05). Questa figura è stata modificata da Wang et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Contenuto di umidità differenti di sabbia non ha colpito significativamente la percentuale di individui rintanate e successo di emersione di E. grisescens (Figura 4a e 4b). Significativamente meno E. grisescens sono rintanate a secco (20% di umidità) o terreno bagnato (80% umidità) per pupating (Figura 4a). Inoltre, significativamente meno adulti emersero dall'umidità 20% terriccio sabbioso 2 e limo del terriccio rispetto a quelli che erano popolate nel 50% - 80%-umidità o sabbia terriccio 2 e del terriccio di limo (Figura 4b).
Figura 4: risultati da analisi biologiche scelta no. Questi pannelli mostrano (un) le percentuali di individui rintanati e (b), il successo di emersione di Ectropis grisescens in risposta a qualsiasi tipologia di substrato tipi (sabbia, sabbia terriccio 1, sabbia terriccio 2 e limo del terriccio) e contenuto di umidità (20%, 50% e 80%). I dati sono presentati come media ± SE. Le lettere diverse indicano differenze significative (P < 0,05). Questa figura è stata modificata da Wang et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Preferenze di impupamento rispondendo alle variabili differenti del terreno sono state studiate in pochi parassiti6,9,22,23. Ad esempio, per studiare la preferenza delle larve mature di Bactrocera tryoni (Froggatt) (Diptera: Tephritidae) tra condizioni di umidità del terreno, Hulthen e Clarke22 set contenente 9 contenitori riempiti con un design del latino-Piazza 3 x 3 terreno a 0%, 75% o 100% capacità di campo e 25 larve mature sono stati rilasciati sulla superficie di ogni contenitore. Alyokhin et al. 23 posti 100 contenitori (riempiti con terreno) in una cornice in legno, con i contenitori di 36 centro (asciutti o bagnati) disposto in un reticolo di "scacchiera" e 350-450 fine terza-instar larve di Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) sono stati rilasciati sul centro dei 36 contenitori. Questi studi sono adatti per le larve tryoni b. e b. dorsalis perché la maggior parte di loro sono stata recuperata all'interno del suolo nei biotest arene22,23. Tuttavia, queste arene non sono stati coperti. Di conseguenza, vagando larve con una forte capacità di movimento può viaggiare a lunga distanza e la fuga dalle arene. Qui, abbiamo fornito un metodo semplice per studiare la preferenza degli insetti del suolo-pupating indipendentemente dalle loro dimensioni e capacità mobile. Rispetto agli studi precedenti, queste analisi biologiche sono facili da impostare. Inoltre, i livelli multipli (ad es., > 4) della variabile del terreno possono essere studiati in relativamente piccole arene.
Vale la pena notare che i dati ottenuti dai test di scelta qui descritte non possono essere direttamente analizzati mediante ANOVA, perché i dati di percentuale non sono indipendenti (la somma della percentuale di pupe in ogni aula è sempre uguale a 1 e, di conseguenza, l'aumento di la percentuale di pupe in 1 camera causerà la diminuzione della percentuale in quelle rimanenti). Qui, abbiamo effettuato la trasformazione del rapporto di log, perché è una procedura semplice che "rimuove efficacemente il CSC (somma costante vincolo) da qualsiasi dati composizionali e contemporaneamente mantiene la loro struttura di covarianza vero"21. Nello studio presente, la sopravvivenza di pupe E. grisescens era alta e abbiamo registrato solo la percentuale di pupe diretta in ogni camera. Tuttavia, alcuni parassiti del terreno-pupating come la processionaria del pino, Thaumetopoea pityocampa (Denis & Schiffermüller) (Lepidoptera: Thaumetopoeidae), solitamente presentano un'alta mortalità durante pupating24. In tal caso, sarebbe corretto contare pupe sia dal vivo che morti.
No-scelta le analisi biologiche sono stati ampiamente usate per studiare l'effetto delle variabili del terreno per il successo di emersione dei parassiti del terreno-impupamento. I tipi di substrato e contenuto di umidità era i fattori più frequentemente studiati in questi studi2,3,4,5,9,10,11 , 12. E. grisescens può pupate sia all'interno o sui substrati. Di conseguenza, abbiamo registrato la percentuale di individui rintanate. Questo risultato sarebbe importante per aiutare a comprendere i modelli di impupamento di E. grisescens.
Sia la scelta e le analisi biologiche no-scelta possono essere modificate per studiare l'impatto di altri fattori di terreno (ad esempio densità del terreno, compattezza superficiale, contenuto di materia organica, ecc.) sulla preferenza e la prestazione di vari insetti del suolo-pupating. In un recente lavoro, abbiamo modificato queste analisi biologiche per lo studio (1) se il terreno trattato con un antiparassitario chimico o agente di biocontrollo respingere pupating E. grisescens (sia dal vivo che morti pupe sono stati contati) e (2) l'effetto di tali trattamenti sull'impupamento comportamenti (ad esempio, la percentuale di individui rintanate) e il successo di emersione di grisescens E..
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Yuzhen Wen, Shiping Liang, Shengzhe Jian e Li Yanjun (College of Forestry e architettura del paesaggio, South China Agricultural University) per il loro aiuto nel insetto allevamento e set-up sperimentale. Questo lavoro è stato finanziato dal National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31600516), la Fondazione di scienze naturali di Guangdong (Grant No. 2016A030310445) e la scienza e tecnologia pianificazione progetto della provincia di Guangdong (Grant No. 2015A020208010) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triangular flask | Bomex Chemical (Shanghai) Co., LTD | 99 | 250 mL |
| Plastic basin | Chahua, Fuzhou, China | 100 | upper side: 51 cm in diameter; bottom side: 40 cm in diameter; height: 16 cm |
| Zip lock bags | Glad, Guangzhou, China | 126/133 | |
| Polypropylene containers | Youyou Plastic Factory, Taian, China | 139/155/160/161/190 | upper side: 20.0 cm [L] × 13.5 cm [W], bottom side: 17.0 cm [L] × 10.0 cm [W], height: 6.5 cm |
| Waterproof polyviny chloride sheet | Yidimei, Shanghai, China | 141 | |
| Tape | V-tech, Guangzhou, China | VT-710 | |
| Oven drier | Kexi, Shanghai, China | KXH-202-3A | |
| Environmental chamber | Life Apparatus, Ningbo, China | PSX-280H |
References
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