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Bioengineering

Vivo दृश्य और Intravital विश्लेषण में के लिए एक Zebrafish भ्रूण मॉडल-संबंधित Staphylococcus aureus संक्रमण

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58523
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Summary

वर्तमान अध्ययन vivo दृश्य में के लिए एक zebrafish भ्रूण मॉडल का वर्णन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के आधार पर समय के साथ-साथ संबंधित संक्रमण के intravital विश्लेषण. इस मॉडल में एक होनहार प्रणाली है जैसे कि vivo में भौतिक-संबद्ध संक्रमण का अध्ययन करने के लिए माउस मॉडल के रूप में स्तनधारी पशु मॉडल पूरित ।

Abstract

जैव-पदार्थ से जुड़े संक्रमण (बाई) की विफलता का एक प्रमुख कारण है बायोमेडिकल डिवाइस/ Staphylococcus aureus बाई में प्रमुख रोगजनकों में से एक है । वर्तमान प्रयोगात्मक बाई स्तनधारी माउस मॉडल जैसे पशु मॉडल महंगा और समय लेने वाली हैं, और इसलिए उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है । इस प्रकार vivo में बाई की जांच के लिए पूरक सिस्टम के रूप में उपन्यास पशु मॉडल वांछित हैं । वर्तमान अध्ययन में, हम vivo दृश्य में के लिए एक zebrafish भ्रूण मॉडल विकसित करने के उद्देश्य से और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के आधार पर आधारित intravital की उपस्थिति में बैक्टीरियल संक्रमण का विश्लेषण. इसके साथ ही इसमें रूठा मैक्रोफेज रिस्पॉन्स का अध्ययन किया गया । इस अंत करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त एस aureus और ट्रांसजेनिक zebrafish उनके मैक्रोफेज में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त भ्रूण और एक प्रक्रिया विकसित करने के लिए अकेले या एक साथ जीवाणुओं सुई में मांसपेशियों में microspheres के साथ इस्तेमाल किया भ्रूण के ऊतक । समय के साथ जीवित भ्रूण में जीवाणु संक्रमण की प्रगति की निगरानी करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की सूक्ष्म स्कोरिंग के एक सरल लेकिन विश्वसनीय विधि तैयार की । सूक्ष्म स्कोरिंग से परिणाम से पता चला है कि 20 से अधिक कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) बैक्टीरिया की एक सकारात्मक फ्लोरोसेंट संकेत उपज के साथ सभी भ्रूण । संक्रमण पर सामग्री के संभावित प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, हम aureus के साथ और बिना 10 µm polystyrene microspheres (PS10) के CFU संख्या भ्रूण में मॉडल के रूप में भौतिक विज्ञान का निर्धारण किया । इसके अलावा, हम ObjectJ परियोजना फ़ाइल "Zebrafish-Immunotest" ImageJ में ऑपरेटिंग के साथ और समय के साथ पुनश्च10 बिना एस प्रतिदीप्ति संक्रमण के aureus तीव्रता मात्रा का इस्तेमाल किया । दोनों तरीकों से परिणाम microspheres के बिना भ्रूण की तुलना में microspheres के साथ संक्रमित भ्रूण में aureus के उच्च संख्या में दिखाया गया है, एक वृद्धि हुई संक्रमण संवेदनशीलता का संकेत है की उपस्थिति में सामग्री । इस प्रकार, वर्तमान अध्ययन zebrafish भ्रूण मॉडल की क्षमता से पता चलता है कि यहां विकसित तरीकों के साथ बाई का अध्ययन ।

Introduction

चिकित्सा उपकरणों की एक किस्म ("के रूप में जैव" निर्दिष्ट) तेजी से आधुनिक चिकित्सा में इस्तेमाल कर रहे है बहाल करने के लिए या मानव शरीर के अंगों1की जगह । हालांकि, प्रत्यारोपण के आरोपण एक रोगी संक्रमण के लिए संवेदनशील है, कहा जाता है एक सामग्री से जुड़े संक्रमण (बाई), जो सर्जरी में प्रत्यारोपण की एक प्रमुख जटिलता है । Staphylococcus aureus और Staphylococcus epidermidis बाई2,3,4,5,6के लिए जिंमेदार दो सबसे प्रचलित जीवाणु प्रजातियों हैं । प्रत्यारोपित एक जीवाणु संरचना की सतह के गठन के लिए अतिसंवेदनशील सामग्री फार्म । इसके अलावा, स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रत्यारोपित सामग्री द्वारा विक्षिप्त हो सकता है, बैक्टीरियल निकासी के कम प्रभावशीलता के कारण । बैक्टीरिया को संक्रमित करने की प्रारंभिक मंजूरी न्यूट्रोफिल, जो दृढ़ता से एक डाला या प्रत्यारोपित जीवाणुनाशक की उपस्थिति में क्षमता कम हो गई है घुसपैठ द्वारा मुख्य रूप से किया जाता है7. इसके अलावा, मैक्रोफेज न्यूट्रोफिल की प्रारंभिक आमद के बाद ऊतक घुसपैठ शेष बैक्टीरिया phagocytose जाएगा, लेकिन प्रभावी ढंग से उन्हें intracellularly को मार नहीं सकता, विक्षिप्त प्रतिरक्षा संकेतन कि संयुक्त उपस्थिति का एक परिणाम है के कारण इस सामग्री और बैक्टीरिया8। इस प्रकार, की उपस्थिति intracellular बैक्टीरिया9,10,11,12,13 और प्रत्यारोपित पर फिल्म के गठन के अस्तित्व की सुविधा कर सकते हैं 4,14. नतीजतन, बाई विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते है और प्रत्यारोपित के प्रतिस्थापन के लिए की जरूरत है, वृद्धि की रुग्णता और मृत्यु के कारण और अतिरिक्त लागत के साथ लंबे समय तक अस्पताल में भर्ती2,15।

एंटी बाई रणनीतियों की बढ़ती संख्या2,16,17विकसित किया जा रहा है । संबंधित पशु मॉडलों में इन रणनीतियों की प्रभावकारिता के vivo मूल्यांकन में आवश्यक है । हालांकि, पारंपरिक प्रयोगात्मक बाई पशु मॉडल (जैसे, माउस मॉडल) आम तौर पर महंगा है, समय लेने वाली, और इसलिए कई रणनीतियों18के उच्च प्रवाह परीक्षण के लिए उपयुक्त नहीं है । bioluminescent/मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया की लगातार निगरानी के लिए अनुमति दे सकता है के आधार पर जैव ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीकों के हाल के विकास बाई प्रगति और मेजबान के सतत मॉनिटरिंग-रोगज़नक़/मेजबान एक छोटे जानवरों में सामग्री बातचीत जैसे चूहों18,19,20,21. हालांकि, इस तकनीक अपेक्षाकृत जटिल है और अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, और कई मुद्दों बाई18के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए संबोधित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, एक उच्च चैलेंज खुराक बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण कल्पना करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, प्रकाश कैटरिंग और स्तनधारी परीक्षण पशुओं के ऊतकों में bioluminescence/प्रतिदीप्ति संकेतों के सोखना भी18,19,21को संबोधित किया जाना चाहिए । इसलिए, उपंयास, लागत प्रभावी पशु intravital दृश्य और समय पर मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति मॉडल vivo में बाई का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान पूरक प्रणाली हैं ।

Zebrafish (भ्रूण) एक विच्छेदन के लिए vivo उपकरण में बहुमुखी के रूप में इस्तेमाल किया गया है-रोगज़नक़ बातचीत और संक्रमण रोगजनन के रूप में कई जीवाणु प्रजातियों के आइसोलेटों22, Pseudomonas aeruginosa23, ई कोलाई२४, Enterococcus faecalis२५, व staphylococci२६,२७. Zebrafish भ्रूण ऐसे ऑप्टिकल पारदर्शिता के रूप में कई फायदे हैं, एक अपेक्षाकृत कम रखरखाव लागत, और एक प्रतिरक्षा प्रणाली के कब्जे के अत्यधिक है कि स्तनधारियों में28,29के समान । यह zebrafish भ्रूण एक अत्यधिक आर्थिक, intravital दृश्य और संक्रमण प्रगति और संबद्ध मेजबान के विश्लेषण के लिए मॉडल जीव जीवित बनाता है28,29। vivo में सेल व्यवहार के दृश्य की अनुमति देने के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के साथ ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों (जैसे, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल) और यहां तक कि फ्लोरोसेंट टैग उपसेलुलर संरचनाओं के साथ28 विकसित किया गया है ,29. इसके अलावा, zebrafish की उच्च प्रजनन दर स्वचालित रोबोट इंजेक्शन की विशेषता उच्च प्रवाह परीक्षण प्रणालियों के विकास की संभावना प्रदान करता है, स्वचालित प्रतिदीप्ति ठहराव, और आरएनए अनुक्रम विश्लेषण27, 30.

वर्तमान अध्ययन में, हम प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर के लिए एक zebrafish भ्रूण जुड़े संक्रमण के लिए मॉडल का विकास करने का उद्देश्य । इस अंत करने के लिए, हम एक प्रक्रिया विकसित करने के लिए बैक्टीरिया (एस aureus) zebrafish भ्रूण की मांसपेशियों के ऊतकों में microspheres की उपस्थिति में इंजेक्शन । हम एस aureus RN4220 mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस aureus-mCherry), जो एक और एस aureus तनाव10,31के लिए कहीं और वर्णित के रूप में निर्माण किया गया था व्यक्त करते थे । ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन (mpeg1: यूएएस/Kaede) Kaede३२ और ब्लू फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज polystyrene में microspheres ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस इस्तेमाल किया गया । पिछले एक अध्ययन में, हमें पता चला है कि zebrafish भ्रूण में microspheres के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए सामग्री आरोपण नकल है व्यवहार्य३३। मात्रात्मक बाई की प्रगति और समय के साथ एक भ्रूण में जुड़े सेल घुसपैठ का विश्लेषण करने के लिए, हम "Zebrafish-Immunotest" परियोजना फ़ाइल जो "ObjectJ" के भीतर संचालित है (एक प्लग में ImageJ के लिए) का इस्तेमाल किया प्रतिदीप्ति तीव्रता यों तो बैक्टीरिया रहने और मैक्रोफेज microspheres३३के इंजेक्शन साइट के आसपास में घुसपैठ । इसके अलावा, हम कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) की उपस्थिति और भ्रूण में microspheres की अनुपस्थिति में बैक्टीरिया की संख्या का निर्धारण करने के लिए संक्रमण पर सामग्री के संभावित प्रभावों का अध्ययन । हमारे वर्तमान अध्ययन से यह दर्शाता है कि यहां विकसित तरीकों के साथ, zebrafish भ्रूण vivo में एक होनहार, उपंयास हड्डीवाला पशु मॉडल के अध्ययन के लिए है ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में, वयस्क zebrafish के रखरखाव स्थानीय पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित के रूप में स्थानीय पशु कल्याण नियमों के अनुपालन में है । भ्रूण के साथ प्रयोगों 2010/63/यूरोपीय संघ के निर्देश के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. "बैक्टीरिया केवल" और बैक्टीरिया-microspheres सस्पेंशन की तैयारी

नोट: एस aureus RN4220 तनाव mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस aureus-mCherry) व्यक्त किया जाता है । एस aureus RN4220 तनाव डाह नियामक जीन आगरा (गौण जीन नियामक ए)३४में रूपांतरित किया गया है, और इसलिए zebrafish भ्रूण मॉडल में अपेक्षाकृत कम डाह हो सकता है । बाई के लिए अन्य एस aureus उपभेदों या अन्य जीवाणु प्रजातियों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. एस aureus RN4220 बैक्टीरिया की 4 से 5 कालोनियों लो tryptic सोया आगर संस्कृति प्लेटें 10 µ g/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल और संस्कृति के साथ पूरक के 10 मिलीलीटर tryptic सोया शोरबा 10 एमएल में के मध्य लघुगणक विकास चरण के साथ पूरक झटकों के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर क्लॉरॅंफेनिकोल ।
    1. संस्कृति के दौरान, पतला १०० µ एल में जीवाणु निलंबन की ९०० µ एल में बाँझ फॉस्फेट (पंजाब) की एक cuvette (चौड़ाई 1 सेमी) के लिए ६२० एनएम (आयुध डिपो में) माप पर एक ऑप्टिकल घनत्व (ओडी६२०) । संस्कृति जब तक जीवाणु आयुध डिपो६२० 0.4 – 0.8 तक पहुँचता है ।
      नोट: एक आयुध डिपो६२० ०.१ आम तौर पर ३.० x 107 CFU/एमएल एस aureusसे मेल खाती है । मध्य लघुगणकीय विकास चरण में बैक्टीरिया की एक इनोक्युलम के आयुध डिपो६२० 0.4-0.8 के बीच है । संवर्धन के लिए अलग समय अवधि अन्य प्रजातियों और बैक्टीरिया के उपभेदों के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  2. 10 मिनट के लिए ३,५०० x g पर बैक्टीरिया केंद्रापसारक और पुनः निलंबित बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में छर्रों बैक्टीरिया । बाद में बाँझ पंजाबियों के साथ बैक्टीरिया धो 2 बार, और अंत में फिर से १.१ मिलीलीटर में बैक्टीरिया को निलंबित 4% (डब्ल्यू/वी) polyvinylpyrrolidone४० (PVP४०) पंजाब में समाधान ।
  3. भंवर इस जीवाणु निलंबन और पतला १०० µ एल में निलंबन के ९०० µ l में बाँझ पंजाबियों के आयुध डिपो६२० माप के लिए एक cuvette. PVP४० समाधान के साथ बैक्टीरियल निलंबन की एकाग्रता को समायोजित करें । यह "केवल जीवाणु" निलंबन है ।
  4. सामग्री आसानी से जीवाणु निलंबन के साथ मिश्रण करने के लिए चुना जा सकता है । वर्तमान अध्ययन में, वाणिज्यिक polystyrene (पीएस) microspheres (ब्लू फ्लोरोसेंट, 10 µm) का उपयोग किया जाता है । एक बैक्टीरिया-Microspheres निलंबन उत्पंन करने के लिए, १,००० x g, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए Microspheres केंद्रापसारक, supernatant त्यागें और फिर से Microspheres को निलंबित "बैक्टीरिया केवल" निलंबन (PVP४० समाधान में) ।
  5. आदेश में उपस्थिति में और microspheres के अभाव में बैक्टीरिया की लगभग बराबर खुराक इंजेक्षन करने के लिए, बैक्टीरिया की एकाग्रता-microspheres निलंबन "केवल जीवाणु" निलंबन की एकाग्रता के दो तिहाई होने की जरूरत है (बिना microspheres) । इस कमजोर द्वारा प्राप्त की है बैक्टीरिया-Microspheres निलंबन PVP४० समाधान की मात्रा के साथ । सस्पेंशन को भंवरी बनाकर मिक्स कर दें । नोट की, इस अनुपात (दो तिहाई) एस aureusके लिए मूल्यांकन किया गया है । यह भी एस epidermidisके लिए उपयुक्त है, लेकिन यह जांच करने की सलाह दी है कि यह अनुपात भी अंय जीवाणु प्रजातियों और अंय आकार (से 10 µm) या (से microspheres) के आकार के लिए लागू होता है इंजेक्शन हो ।
  6. की एकाग्रता की जांच करें "केवल बैक्टीरिया" और बैक्टीरिया-Microspheres निलंबन मात्रात्मक संस्कृति के द्वारा 10-गुना सीरियल कमजोर पड़ने के नीचे के रूप में: स्थानांतरण १०० µ l के निलंबन के एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट और प्रश्नपत्र पतला स्थानांतरित करके 10 µ l aliquots बाँझ पंजाबियों के ९० µ l में सस्पेंशन. प्लेट डुप्लिकेट 10 µ l aliquots agarose प्लेटों पर पतला और पतला सस्पेंशन का, रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें, कॉलोनियों गिनती और बैक्टीरिया की संख्या की गणना (कॉलोनी बनाने इकाइयों । CFU) ।

2. प्रजनन, कटाई, और Zebrafish भ्रूण के रखरखाव

  1. सामान्य प्रक्रियाओं पहले वर्णित का पालन करें३५,प्रजनन के लिए३६ , कटाई, और zebrafish भ्रूण के रखरखाव, संशोधनों के साथ नीचे वर्णित. जंगली प्रकार Tupfel के एक परिवार के पार लंबे पंख (TL) zebrafish या चयनित ट्रांसजेनिक लाइन के zebrafish (यहां, Mpeg1: Kaede) के साथ एक टैंक में एक शुद्ध करने के लिए वयस्क महिलाओं को प्रेरित करने के बाद प्रकाश पर जाता है अंडे का उत्पादन जोड़ा जाता है, तो उत्पादित अंडे से अलग वयस्कों ।
  2. अगले दिन भ्रूण इकट्ठा और गैर पारदर्शी जो व्यवहार्य नहीं है त्यागें । पेट्री डिश प्रति लगभग ६० भ्रूण रखो (व्यास में १०० मिमी) E3 मध्यम३७ और 28 डिग्री सेल्सियस पर मशीन में । मृत और असामान्य भ्रूण निकालें, और E3 मध्यम दैनिक ताज़ा करें ।

3. इंजेक्शन सुई की तैयारी

  1. एक micropipette खींचने साधन का उपयोग कर इंजेक्शन के लिए गिलास microcapillary सुई तैयार करते हैं । निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: हीट: ७७२, pull: १००, vel: २००, समय: ४०, गैस: ७५.
  2. स्थिति जहां सुई लगभग 20 µm (10 µm microspheres के लिए) के एक बाहरी व्यास है पर संदंश के साथ सुई टिप तोड़, नेत्र में एक पैमाने पर पट्टी के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । एक बहुत बड़ी खोलने के आकार के साथ सुई से बचें, के रूप में वे भ्रूण के अस्तित्व का समझौता होगा ।
    नोट: खोलने के लिए छोटे या बड़े होना चुना जा सकता है, आकार और इंजेक्शन के लिए किया जा करने के लिए सामग्री की आकृति पर निर्भर करता है । साहित्य में, लगभग ५० µm के एक खोलने के साथ सुई का उपयोग इंजेक्शन के लिए भ्रूण अस्तित्व३८में एक महत्वपूर्ण कमी का कारण बताया गया है ।

4. इंजेक्शन के "बैक्टीरिया केवल" या बैक्टीरिया-microspheres निलंबन Zebrafish भ्रूण में

  1. हीट agarose समाधान (डेमी में 1-1.5% (wt)-पानी) एक माइक्रोवेव ओवन का उपयोग कर और एक १०० मिमी पेट्री डिश में डालना । उचित पदों में भ्रूण रखने के लिए agarose में इंडेंटेशन बनाने के लिए पेट्री डिश में agarose समाधान के शीर्ष पर एक प्लास्टिक मोल्ड टेम्पलेट रखें, इंजेक्शन की सुविधा । कमरे के तापमान पर गर्मी और मोल्ड हटाने जब agarose समाधान जम गया है ।
  2. 3 डी पर निषेचन के बाद, एक १०० मिमी पेट्री डिश में भ्रूण प्लेस ०.०२% युक्त (डब्ल्यू/वी) 3-aminobenzoic एसिड (Tricaine) के लिए उंहें anaesthetize । 5 मिनट के बाद, agarose प्लेट के लिए भ्रूण हस्तांतरण ०.०२% (डब्ल्यू/वी) Tricaine युक्त E3 माध्यम से मढ़ा और उंहें इंजेक्शन के लिए एक अभिविन्यास में संरेखित करें । Mpeg1 के लिए: Kaede ट्रांसजेनिक लाइन पहले E3 माध्यम में anaesthetize भ्रूण ०.०२% (डब्ल्यू/वी) tricaine । फिर एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त भ्रूण का चयन करें ।
  3. लगभग 10 µ एल के साथ सुई लोड "बैक्टीरिया केवल" या बैक्टीरिया-Microspheres एक microloader पिपेट टिप का उपयोग कर निलंबन. एक माइक्रो इंजेक्टर से जुड़े micromanipulator पर सुई माउंट । इंजेक्शन के लिए यहां इस्तेमाल किया (सामग्री की तालिका देखें), इंजेक्शन के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें 2 – 3 nL: दबाव: 300 – 350, वापस दबाव: 0, समय: 2 ms.
    नोट: माइक्रो इंजेक्टर के लिए सेटिंग्स का उपयोग इंजेक्टर पर निर्भर करते हैं । इंजेक्टर सेटिंग्स को अन्य आकृतियों या आकारों के साथ मिश्रित जीवाणुओं के इंजेक्शन के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
    1. "बैक्टीरिया केवल" निलंबन और बैक्टीरिया-Microspheres निलंबन के इंजेक्शन के लिए एक ही खोलने के साथ सुई का प्रयोग करें । सुई टूट गया है या भरा हुआ है, तो हमेशा आगे इंजेक्शन के लिए एक नई सुई के लिए बदल जाते हैं ।
  4. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की मांसपेशी ऊतक में सुई डालें (चित्रा 1), 45 के कोण पर-सुई और भ्रूण के शरीर के बीच 60 °. धीरे से इसे आगे और पीछे ले जाकर ऊतक में सुई की स्थिति को समायोजित करें । एक पैर माइक्रो इंजेक्टर से जुड़े पेडल का उपयोग कर भ्रूण सुई ।
  5. फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के इंजेक्शन के बाद, एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत सफल संक्रमण के लिए भ्रूण स्कोर । त्यागें भ्रूण नकारात्मक रन बनाए (कोई दिखाई फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया या नहीं दिखाई फ्लोरोसेंट microspheres) । ४८-अच्छी तरह से प्लेटों में E3 माध्यम में व्यक्तिगत रूप से भ्रूण बनाए रखें । मीडियम को रोज़ रिफ्रेश करें ।

5. भ्रूण के कुचल, सूक्ष्म स्कोरिंग, और बैक्टीरिया की मात्रात्मक संस्कृति

  1. एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, इंजेक्शन के तुरंत बाद शुरू, और प्रत्येक बाद के दिन जब तक भ्रूण बेतरतीब ढंग से मात्रात्मक संस्कृति के लिए चयनित कर रहे हैं फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की उपस्थिति के लिए सभी भ्रूण microscopically स्कोर.
  2. बेतरतीब ढंग से कुछ जीवित संक्रमित भ्रूण का चयन करें (वर्तमान अध्ययन में 5 से 6) शीघ्र ही इंजेक्शन के बाद और उंहें अलग से 2 मिलीलीटर microtubes बाँझ सुझावों का उपयोग कर हस्तांतरण । मध्यम निकालें, एक बार बाँझ पंजाबियों के साथ धीरे भ्रूण धोने और बाँझ पंजाबियों के १०० µ एल जोड़ें ।
  3. जोड़ें 2 – 3 बाँझ zirconia मोती (व्यास में 2 मिमी) प्रत्येक शीशी के लिए और homogenizer का उपयोग कर भ्रूण को कुचलने ( सामग्री की तालिकादेखें) 30 s. Culture homogenate मात्रात्मक रूप में १.३ चरण में वर्णित के लिए ३,५०० rpm पर ।
    नोट: अंय homogenizers भिंन सेटिंग्स की आवश्यकता हो सकती है ।
  4. अनियमित मात्रात्मक संस्कृति के लिए इंजेक्शन के बाद बाद के दिनों पर एकाधिक भ्रूण का चयन ५.३ कदम के अनुसार ।

6. संक्रमण प्रगति की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और Zebrafish भ्रूण में सेल घुसपैठ भड़काया

  1. चरण ४.२ में बताए गए अनुसार भ्रूण को Anaesthetize । पिपेट ५०० एक पंजाबियों के µ एल-2% (wt) एक पेट्री डिश के साथ ०.०२% (डब्ल्यू/वी) Tricaine के साथ E3 माध्यम युक्त पकवान में मिथाइल फाइबर समाधान । मिथाइल फाइबर समाधान में भ्रूण रखें और उन्हें सीधे और क्षैतिज रखने के लिए ।
    नोट: मिथाइल फाइबर समाधान एक "गोंद", जो अपनी चिपचिपाहट के कारण के रूप में प्रयोग किया जाता है, अस्थाई रूप से इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा उंमुखीकरण में भ्रूण स्थिर कर सकते हैं ।
  2. उज्ज्वल क्षेत्र, mCherry, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), और यूवी फिल्टर के साथ एक समान अनुकूलित सेटिंग्स के तहत व्यक्तिगत भ्रूण छवि के लिए एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें (जैसे, तीव्रता, लाभ, और जोखिम समय) 160x आवर्धन पर . फोकल विमान ऐसी है कि ऊतक इंजेक्शन की वजह से नुकसान ध्यान में है सेट, उज्ज्वल फील्ड फिल्टर का उपयोग कर । 3 लगातार छवियों की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है जो 5 µm, पर 10 µm और चरण आकार पर Z-स्टैक गहराई सेट करें ।
  3. छवि व्यक्तिगत भ्रूण एक बार 5 से दैनिक एच पोस्ट इंजेक्शन 2 दिनों तक के बाद इंजेक्शन । आगे इमेजिंग और विश्लेषण के लिए मृत भ्रूण (कोई दिल की धड़कन या आंशिक रूप से नीचा) के बाहर । ४८-अच्छी तरह से प्लेटों में E3 माध्यम में व्यक्तिगत रूप से भ्रूण बनाए रखें । मीडियम को रोज़ रिफ्रेश करें ।

7. संक्रमण की प्रगति की प्रतिदीप्ति तीव्रता का मात्रात्मक विश्लेषण और वस्तु जंमू परियोजना फ़ाइल "Zebrafish-Immunotest" का उपयोग सेल घुसपैठ भड़काया

  1. डाउनलोड "Zebrafish-Immunotest" और लिंक से विस्तृत मैनुअल: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL >, के रूप में एक पिछले अध्ययन३३में वर्णित है । संक्षेप में, "Zebrafish-Immunotest" के साथ विश्लेषण के लिए खुला छवियों, फ्रीवेयर प्रोग्राम छवि जे के तहत ऑपरेटिंग प्रत्येक भरी हुई छवि में, मैन्युअल इंजेक्शन भ्रूण के मनाया ऊतक क्षति के आधार पर साइट चिह्नित.
    नोट: चिह्नित साइट "Zebrafish-Immunotest" द्वारा प्रयोग किया जाता है केंद्र बिंदु के रूप में ५० µm की दूरी के भीतर प्रतिदीप्ति चोटी का पता लगाने के लिए । पता चला प्रतिदीप्ति पीक तो प्रतिदीप्ति माप के लिए एक मानकीकृत क्षेत्र (१०० µm के व्यास) के केंद्र के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
  2. क्लिक करें "गणना" वस्तु जंमू मेनू में एकाधिक चैनलों के लिए फ्लोरोसेंट माप चलाने के लिए, यदि लागू हो, स्वचालित रूप से सभी छवियों के लिए । डेटा निर्यात करें और उचित सांख्यिकीय परीक्षण विधियों द्वारा विश्लेषण ।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन में एक उपंयास हड्डीवाला पशु मॉडल के रूप में zebrafish भ्रूण की प्रयोज्यता की जांच के लिए मूल्यांकन जुड़े संक्रमण का आकलन किया । Microinjection तकनीकआमतौर पर zebrafish भ्रूण में विभिंन जीवाणु प्रजातियों इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है संक्रमण का कारण22,26,27,30,३६। चित्र 1, एस aureus अकेले या 10 µm पुनश्च microspheres (ps10) के साथ एक साथ में चित्रित की प्रक्रिया का उपयोग वर्तमान अध्ययन में zebrafish भ्रूण की मांसपेशी ऊतक में इंजेक्शन थे । एस aureus के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन भ्रूण में खुराक पर निर्भर संक्रमण का कारण बना (चित्रा 2). इंजेक्शन खुराक उद्देश्य चैलेंज खुराक ( चित्रा 2में दिन 0) के करीब थे । केवल समूहों के भीतर मामूली भिन्नताएं देखी गईं । भ्रूण उच्च चैलेंज खुराक के साथ इंजेक्शन 1 दिन और 2 दिनों के बाद इंजेक्शन (चित्रा 2, ६००० और २००० CFU) में चर संक्रमण प्रगति दिखाया । इंजेक्शन एस aureus बैक्टीरिया या तो उंमूलन या proliferated था और बाद में भ्रूण के भीतर संक्रमण के उच्च स्तर की स्थापना की । यह zebrafish भ्रूण26में नसों में इंजेक्शन के बाद एस aureus संक्रमण की रिपोर्ट प्रगति के समान है । एस aureus के कम चैलेंज खुराक के साथ इंजेक्शन भ्रूण बैक्टीरिया (चित्रा 2, ६०० और २०० CFU) को मंजूरी दे दी । इन परिणामों से संकेत दिया कि एस aureus की चुनौती खुराक दृढ़ता से zebrafish भ्रूण में उनके संक्रमण प्रगति को प्रभावित करता है ।

बैक्टीरिया और microspheres के सह इंजेक्शन बैक्टीरिया के इंजेक्शन की तुलना में अधिक संख्या में परिणाम केवल (दिखाया नहीं डेटा) । जीवाणु इनोक्युलम के लिए जीवाणुओं को तैयार करके एक उच्च एकाग्रता (लगभग १.५ गुना अधिक) में इंजेक्शन बैक्टीरिया-Microspheres निलंबन से, हम CFU इंजेक्शन की संख्या में अंतर को दूर करने में सक्षम थे. इस तरह, यह उपस्थिति में और पी एस10 (0 दिन, चित्रा 3) के अभाव में भ्रूण में बैक्टीरिया के समान संख्या इंजेक्षन करने के लिए संभव है । इंजेक्शन प्रति microspheres की संख्या विविध । एक उदाहरण के रूप में, हमारे प्रयोगों में से एक में, भ्रूण के आधे इंजेक्शन के प्रति 1 से 2 microspheres प्राप्त ( एस aureus + PS10 समूह में 25 भ्रूण में से 12), कुछ प्राप्त 3 से 4 (8 से 25 भ्रूण), और कुछ प्राप्त 5 से 7 microspheres (5 से बाहर 25 em bryos) । हालांकि, इस तरह की विविधताओं उकसाया सेलुलर प्रतिक्रियाओं के स्तर को प्रभावित नहीं किया, के रूप में एक पिछले अध्ययन३३में रिपोर्ट ।

अगले, हम जांच की है कि microspheres की उपस्थिति zebrafish भ्रूण में संक्रमण प्रगति पर एक प्रभाव एस aureusकी कम खुराक के साथ चुनौती दी है । इस अंत करने के लिए, हम के साथ या PS10के बिना एस aureus-mCherry के लगभग ६०० CFU इंजेक्शन । हम संक्रमण प्रगति का अध्ययन करने के लिए दो तरीकों का इस्तेमाल किया: (i) कुचलने के बाद संक्रमित भ्रूण की पारंपरिक मात्रात्मक संस्कृति, और (द्वितीय) सूक्ष्म पता लगाने के स्कोरिंग ("सूक्ष्म स्कोरिंग") फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया (एस aureus-mCherry) की. हम इन दो तरीकों से परिणामों की तुलना में । स्कोर के रूप में परिभाषित किया गया था "हां या नहीं" भ्रूण में फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की दृश्यता, प्रतिदीप्ति तीव्रता की परवाह किए बिना । हमारे परिणामों से पता चला है कि एस aureus-mCherry के 20 से अधिक CFU के साथ सभी भ्रूण सूक्ष्म स्कोरिंग ( चित्रा 3में लाल डॉट्स) में सकारात्मक थे । भ्रूण के प्रति एस aureus के ६०० CFU के लिए,10 PS की उपस्थिति के लिए काफी संक्रमण प्रगति को प्रभावित नहीं लग रहा था । हर समय बिंदुओं पर, दोनों संक्रमित भ्रूण की आवृत्ति ( चित्रा 3, कम चुनौती खुराक के शीर्ष पर संकेत) और कुचल के बाद CFU की संख्या के साथ या PS10 बिना भ्रूण के लिए अलग नहीं थे (आंकड़ा 3, कम चैलेंज खुराक). यह सुझाव दिया है कि उच्च एस aureus के चैलेंज खुराक zebrafish भ्रूण में संक्रमण प्रगति पर के संभावित प्रभावों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं । इसलिए, हम की उपस्थिति और PS10 में भ्रूण में अनुपस्थिति में एस aureus के लगभग १,००० CFU इंजेक्शन । सूक्ष्म स्कोरिंग के साथ और किसी भी समय बिंदु (चित्रा 3, उच्च चैलेंज खुराक) में PS10 के बिना संक्रमित भ्रूण की आवृत्ति में मतभेद नहीं दिखा था । मात्रात्मक संस्कृति, तथापि, उच्च CFU एस aureus में भ्रूण से प्राप्त संख्या + PS10 समूह से प्राप्त उन एस aureusकेवल समूह में 2 दिनों के बाद इंजेक्शन (चित्रा 3, उच्च दिखाया चैलेंज खुराक) ।

उपस्थिति में संक्रमण की हद तक और zebrafish भ्रूण में छवि विश्लेषण के द्वारा भौतिक विज्ञान के अभाव में, हम उपस्थिति में एस aureus-mCherry (भ्रूण प्रति १,००० CFU) की संक्रमण प्रगति दिखा छवियों की एक श्रृंखला दर्ज की और समय पर जीना भ्रूण में पुनश्च10 की अनुपस्थिति (आंकड़ा 4a) । हम भी Kaede ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की उकसाया घुसपैठ दर्ज की भ्रूण में मैक्रोफेज व्यक्त प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रिया (चित्रा 4B) यों तो । Kaede फ्लोरोसेंट प्रोटीन यूवी प्रकाश के लिए जोखिम के तहत हरी से लाल रंग के रूपांतरण से गुजरना हो सकता है, जोखिम समय और प्रकाश की तीव्रता३९पर निर्भर करता है । हालांकि, इस तरह के रंग रूपांतरण वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त प्रयोगात्मक शर्त के तहत नहीं देखा गया था । संक्रमित बैक्टीरिया के प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में अच्छी तरह से इंजेक्शन साइट के आसपास एक मानकीकृत क्षेत्र के भीतर घुसपैठ मैक्रोफेज के रूप में हमारी ObjectJ परियोजना फ़ाइल द्वारा मापा गया था "Zebrafish-Immunotest", छवि J के भीतर संचालन. " Zebrafish-Immunotest "इंजेक्शन के एक संकेत बिंदु के आसपास १०० µm ( चित्रा 4में पीले घेरे) के एक व्यास के साथ एक मानकीकृत क्षेत्र को परिभाषित करता है । भ्रूण में, इस क्षेत्र में फ्लोरोसेंट इंजेक्शन microspheres की निकटता में रहने वाले बैक्टीरिया के बहुमत, साथ ही साथ घुसपैठ मैक्रोफेज शामिल थे । एक सामग्री की उपस्थिति के लिए संक्रमण और प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रियाओं को दोनों प्रारंभिक संवेदनशीलता को प्रभावित दिखाया गया था । 5 एच के बाद इंजेक्शन, एस aureus के जवाब में मैक्रोफेज घुसपैठ केवल एस aureus + पुनश्च10 (चित्रा 5, मैक्रोफेज घुसपैठ, 5 hpi) के जवाब में से काफी अधिक था । 1 दिन में पोस्ट-पी एस10 के साथ इंजेक्शन भ्रूण एस10 (चित्रा 5, संक्रमण प्रगति, 1 डीपीआई) के बिना भ्रूण की तुलना में aureus संक्रमण के काफी उच्च स्तर दिखाया । इस प्रकार, इन मात्रात्मक परिणामों का प्रदर्शन किया है कि प्रतिदीप्ति छवि रिकॉर्डिंग और ObjectJ परियोजना फ़ाइल "Zebrafish-Immunotest" के संयोजन के लिए संक्रमण की प्रगति और भड़काने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक की उपस्थिति में प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया उकसाया zebrafish भ्रूण मॉडल में सामग्री । मॉडल में प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रियाओं और vivo में जीवाणु संक्रमण के स्तर में छोटे मतभेदों का आकलन करने के लिए अनुमति देता है, और यह केवल एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है (छवि रिकॉर्डिंग के साथ) और मूल्यांकन के लिए खुला उपयोग "Zebrafish-Immunotest".

Figure 1
चित्रा 1: के योजनाबद्ध प्रक्रिया सह बैक्टीरिया के इंजेक्शन-Microspheres निलंबन zebrafish भ्रूण की पूंछ मांसपेशी में । इस आंकड़े को झांग एट अल.३३ से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: zebrafish भ्रूण inocula के साथ इंजेक्शन से प्राप्त एस aureus के CFU की संख्या, ६,००० से २०० भ्रूण प्रति CFU से लेकर और 0 में 2 दिनों के बाद इंजेक्शन का आकलन किया । लाल लाइनों CFU की औसत संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: mCherry भ्रूण में CFU और mCherry प्रोटीन-व्यक्त एस. aureus (एस aureus-zebrafish) के सूक्ष्म स्कोरिंग की संख्या, अलग समय बिंदुओं पर मूल्यांकन किया गया । कम चैलेंज खुराक: ६०० भ्रूण प्रति CFU; उच्च चैलेंज खुराक: १,००० भ्रूण प्रति CFU; ps10: 10 µm ps microspheres; "+", भ्रूण के साथ इंजेक्शन एस aureus-mCherry PS10के साथ एक साथ; "-", भ्रूण एस aureusके साथ इंजेक्शन-mCherry ही है, तो10पुनश्च बिना । भ्रूण microscopically फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के लिए बनाए गए थे और बेतरतीब ढंग से इंजेक्शन के दिन (0 दिन) और दिन में 1 और दिन 2 पोस्ट इंजेक्शन के भ्रूण के कुचलने के बाद बैक्टीरिया की मात्रात्मक संस्कृति के लिए चुना । भ्रूण microscopically सकारात्मक और फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के लिए नकारात्मक बनाए गए लाल और काले डॉट्स में दिखाया गया है, क्रमशः । microscopically सकारात्मक स्कोरिंग भ्रूण की कुल संख्या से विभाजित भ्रूण की संख्या हर समय बिंदु पर (संक्रमित भ्रूण की आवृत्ति) बनाए गए ग्राफ के शीर्ष पर संकेत कर रहे हैं । संक्रमित भ्रूण की आवृत्तियों में और एस aureus के बीच CFU की संख्या में अंतर + PS10 और एस aureus केवल समूहों के प्रत्येक समय बिंदु पर ' फिशर सटीक परीक्षण और मान-Whitney परीक्षण, क्रमशः द्वारा विश्लेषण किया गया । *p ≤ ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि छवियों की उपस्थिति और 10 µm पुनश्च microspheres की अनुपस्थिति में mCherry-व्यक्त एस aureus (ए, लाल) की संक्रमण प्रगति रिकॉर्डिंग (ps10, नीला) और Kaede प्रोटीन का भड़का घुसपैठ-व्यक्त मैक्रोफेज (बी, ग्रीन) भ्रूण में, 5 एच पोस्ट इंजेक्शन (hpi) से 2 दिनों के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) । गैर इलाज भ्रूण (NT) नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । पीले हलकों (व्यास में १०० µm) ObjectJ परियोजना फ़ाइल का उपयोग कर प्रतिदीप्ति ठहराव के लिए इंजेक्शन साइट पर मानकीकृत क्षेत्र इंगित "Zebrafish-Immunotest '. बैक्टीरिया और मैक्रोफेज के quantified प्रतिदीप्ति को चित्रा 5में दर्शाया गया है । स्केल बार्स = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एस aureus संक्रमण प्रगति और प्रतिदीप्ति ठहराव की उपस्थिति और अनुपस्थिति में चाहेगी मैक्रोफेज घुसपैठ 10 µm ps microspheres (ps10) में zebrafish भ्रूण 5 घंटे से पोस्ट इंजेक्शन (hpi) 2 दिनों के लिए पोस्ट-इंजेक्शन (dpi), ObjectJ प्रोजेक्ट फ़ाइल का उपयोग करते हुए "Zebrafish-Immunotest" । इंजेक्शन साइट पर एक मानकीकृत क्षेत्र प्रतिदीप्ति ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया था (१०० µm के व्यास के साथ, 4 चित्रामें पीले घेरे के रूप में संकेत). गैर इलाज भ्रूण (NT) नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक दो समूहों के बीच अंतर मान-Whitney परीक्षण, *p ≤ ०.०५, * *p < ०.०१, * * *p < ०.००१ द्वारा विश्लेषण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

(बाई) संक्रमण से संबंधित एक गंभीर नैदानिक जटिलता है । vivo में बाई की रोगजनन की बेहतर समझ, बाई की रोकथाम और इलाज में सुधार के लिए नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी । हालांकि, murine मॉडल जैसे वर्तमान प्रयोगात्मक बाई पशु मॉडल महंगा, श्रम गहन हैं, और जटिल शल्य चिकित्सा तकनीकों में प्रशिक्षित विशेष कर्मियों की आवश्यकता होती है । इसलिए, इन मॉडलों उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं । zebrafish भ्रूण मॉडल के लिए आवश्यकताओं के बाद से कम जटिल है और सामांय में लागत murine मॉडल के लिए की तुलना में कम कर रहे हैं, वर्तमान अध्ययन कि क्या zebrafish भ्रूण एक उपंयास हड्डीवाला के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है vivo में बाई की जांच के लिए पशु मॉडल, पूरक स्तनधारी मॉडल ।

आदेश में zebrafish भ्रूण बाई मॉडल स्थापित करने के लिए, हम सह के एक प्रोटोकॉल विकसित बैक्टीरिया और microspheres के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए एक विधि पर आधारित के इंजेक्शन भ्रूण में३३से पहले वर्णित है । इस तरह, बैक्टीरिया के अधिकांश भ्रूण में microspheres के आसपास में मौजूद हैं, बैक्टीरिया की नकल उतार--भौतिक संपर्क है कि दौरान या कुछ ही समय के दौरान जगह लेता है मनुष्यों में और स्तनधारियों के आरोपण/

करने के लिए उपस्थिति में संक्रमण की प्रगति और zebrafish भ्रूण में microspheres के अभाव में तुलना करने में सक्षम हो, भ्रूण के साथ और microspheres के बिना बैक्टीरिया के समान प्रारंभिक संख्या के साथ चुनौती दी जानी चाहिए । हालांकि, हमारे अनुभव के अनुसार, सह बैक्टीरिया के इंजेक्शन-Microspheres अधिक बैक्टीरिया में निलंबन के परिणाम "बैक्टीरिया केवल" निलंबन के इंजेक्शन की तुलना में इंजेक्शन किया जा रहा है. इस समस्या को हल करने के लिए, जीवाणुओं की एकाग्रता के बीच अनुपात "बैक्टीरिया-केवल" निलंबन (microspheres के बिना) और बैक्टीरिया-microspheres सस्पेंशन में सिलवाया जाना चाहिए । वर्तमान अध्ययन में, एस aureus की एकाग्रता "जीवाणु-केवल" निलंबन में बैक्टीरिया-Microspheres निलंबन की एकाग्रता की तुलना में लगभग १.५ गुना अधिक होना चाहिए । यह अनुपात भी अन्य जीवाणु प्रजातियों और अन्य सामग्री के लिए लागू होता है कि क्या परीक्षण किया जा करने के लिए रहता है. नोट के साथ और microspheres के बिना बैक्टीरिया के समान संख्या इंजेक्षन करने के लिए, या तो निलंबन के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया सुइयों के खोलने के रूप में संभव के रूप में समान के करीब होना चाहिए.

आकार और आकार के रूप में एक सामग्री के कई गुण अपने इंजेक्शन और बैक्टीरिया के साथ सह इंजेक्शन का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । वर्तमान अध्ययन में, हमने 10 µm polystyrene microspheres (PS10) को मॉडल के रूप में प्रयुक्त किया है । हमारे अनुभव के अनुसार, 15 µm के एक आकार के microspheres वर्तमान अध्ययन३३में विकसित प्रोटोकॉल के बाद 3 दिन पुराने भ्रूण के लिए इंजेक्शन हैं । एक अपेक्षाकृत बड़े आकार के microspheres के लिए (जैसे, ≥ 10 µm), हम गैर के उपयोग को हतोत्साहित monodispersed या अनियमित आकार microspheres/microparticles जो सुई के कॉलेस्ट्रॉल पैदा करते हैं । यदि गोल से अंय आकारों में और विभिंन आकारों में भौतिक सामग्री का इस्तेमाल किया जा चुना है, उनके इंजेक्शन की जरूरत है परीक्षण किया जाना है । microspheres और बैक्टीरिया के (सह) इंजेक्शन के लिए, हम फैलाव की सुविधा के लिए एक 4% polyvinylpyrrolidone (PVP) समाधान का इस्तेमाल किया । यह के साथ और सामांय में भ्रूण में बैक्टीरिया के बिना के इंजेक्शन के लिए उपयोगी हो सकता है ।

के रूप में microspheres के इंजेक्शन के लिए मामला था केवल३३,४०, microspheres इंजेक्शन प्रति विभिंन भ्रूण में बैक्टीरिया के साथ एक साथ इंजेक्शन की संख्या, ज्यादातर 1 से लेकर 4 भ्रूण के प्रति microspheres । हालांकि, के बाद से इस तरह के रूपांतरों भ्रूण३३में उकसाया प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया के स्तर में मतभेद में परिणाम नहीं किया था, वे भी संक्रमण प्रगति पर microspheres के संभावित प्रभाव को प्रभावित करने की उम्मीद नहीं थे. फिर भी, उपंयास एक एकल microsphere के इंजेक्शन की अनुमति दृष्टिकोण (अकेले या बैक्टीरिया के साथ एक साथ) वांछित होगा ।

हमने आकलन किया कि फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की उपस्थिति के सूक्ष्म स्कोरिंग एक "हां या नहीं" स्कोरिंग प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जीने के भ्रूण में संक्रमण प्रगति का विश्लेषण । एक सकारात्मक सूक्ष्म स्कोर की कसौटी दिखाई फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की उपस्थिति के रूप में परिभाषित किया गया था, प्रतिदीप्ति तीव्रता की परवाह किए बिना । बैक्टीरिया की मात्रात्मक संस्कृति की तुलना में, हमारे प्रतिनिधि परिणामों का सुझाव दिया है कि सूक्ष्म स्कोरिंग CFU या कोई संक्रमण की कम संख्या के साथ भ्रूण से एस aureus बैक्टीरिया के 20 या अधिक CFU के साथ भ्रूण भेद कर सकते हैं. इस प्रकार, बैक्टीरिया की केवल कम संख्या के बाद से एक सकारात्मक स्कोर के लिए आवश्यक हैं, इस विधि लगभग मात्रात्मक संस्कृति के रूप में संवेदनशील है । के बाद से भ्रूण को बलि की जरूरत नहीं है और कोई उच्च अंत सूक्ष्मदर्शी या प्रतिदीप्ति के लिए सिस्टम छंटाई के लिए इस पद्धति का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन की आवश्यकता है, हम सूक्ष्म एक सरल लेकिन विश्वसनीय विधि स्कोरिंग पर विचार के संक्रमण की प्रगति की निगरानी जीवित भ्रूण में बैक्टीरिया । संक्रमण के स्तर के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए (के बजाय "हां या नहीं" स्कोरिंग प्रणाली के रूप में ऊपर वर्णित) और एक जीवित भ्रूण में प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया, हम ObjectJ परियोजना फ़ाइल लागू "Zebrafish-Immunotest" के प्रतिदीप्ति तीव्रता यों तो फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया और फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज समय के साथ दर्ज की गई । हम एक मानकीकृत क्षेत्र का इस्तेमाल किया (१०० मीटर के व्यास के साथ) इंजेक्शन साइट आसपास प्रतिदीप्ति को मापने के लिए, के बाद से इस क्षेत्र में बैक्टीरिया और घुसपैठ मैक्रोफेज के बहुमत शामिल दिखाया गया था । "Zebrafish-Immunotest" की एक विस्तृत पुस्तिका पहले३३,४०प्रकाशित किया गया था । नोट के, "Zebrafish-Immunotest" ImageJ के लिए एक खुला पहुंच प्लग में है, जो उपयोगकर्ता द्वारा सिलवाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, विश्लेषण और "Zebrafish-Immunotest" के अन्य मापदंडों के क्षेत्र का व्यास आज़ादी से अध्ययन सेटअप के अनुसार बदला जा सकता है (प्रोटोकॉल में चरण 7 में दिए गए लिंक में उदाहरण देखें).

आदेश में zebrafish भ्रूण के संभावित संक्रमण को बढ़ाने के प्रभाव को दिखाने के लिए, बैक्टीरिया की चुनौती खुराक का आकलन करने की जरूरत है । वर्तमान अध्ययन में, हमने पाया है कि भ्रूण या उच्चतर के प्रति एस aureus की १,००० CFU की एक चुनौती की खुराक की आवश्यकता है । एस के उच्च स्तर के साथ भ्रूण में aureus संक्रमण ps 10 के बिना उन लोगों की तुलना में10 पी एस में इंजेक्शन के बाद पहले 2 दिनों पर पाया गया, यह दर्शाता है कि सामग्री क्षणिक की उपस्थिति S. aureus की वृद्धि की सुविधा भ्रूण में । क्या संक्रमण के बाद के समय अंक में उच्च स्तर पर माल की उपस्थिति में रहता है नैतिक अनुमोदन के तहत पुराने भ्रूण का प्रयोग लागू नियमों के अनुसार अध्ययन किया जाना चाहिए । zebrafish भ्रूण में एस aureus की मंजूरी के बाद से मुख्य रूप से phagocytosis और मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल23,24, जीवाणुओं की वृद्धि द्वारा हत्या पर निर्भर है की एक कम प्रभावशीलता द्वारा समझाया जा सकता है फ़ैगोसाइट की उपस्थिति के कारण बैक्टीरिया को मारने के लिए । यह अच्छी तरह से ज्ञात संक्रमण के साथ लाइन में है-रोगियों में2,4,15, भी सामांयतः अधिक जटिल पशु मॉडल जैसे माउस और अंय पशु मॉडल 10 के रूप में मनाया से जोखिम वृद्धि ,११,१२,१३. एस aureus संक्रमण के अलावा, एस epidermidis या अंय रोगजनकों की उपस्थिति में संक्रमण की प्रगति वर्तमान अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद की जांच की जा सकती है । जैव भौतिकवाद के मुद्दे से, कई सामग्री गुण (जैसे, रासायनिक संरचना, hydrophobicity, असभ्यता, और सतह शुल्क) सेलुलर प्रतिक्रियाओं और/या बैक्टीरिया-सामग्री बातचीत ४१ को प्रभावित कर सकते हैं, ४२. हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि एक (pvp की उपस्थिति में) सामग्री के इंजेक्शन zebrafish भ्रूण में केवल PVP के इंजेक्शन की तुलना में एक मजबूत मैक्रोफेज घुसपैठ भड़काया । इसके अलावा, zebrafish भ्रूण microspheres के लिए अलग ढंग से प्रतिक्रिया पाली (-caprolactone) और polystyrene३३के बने । इसलिए, विभिन्न प्रकृति के microspheres के इंजेक्शन भी संक्रमण की वृद्धि पर अंतर प्रभाव हो सकता है, जो अपेक्षाकृत आसानी से यहाँ वर्णित विधि द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.

आगे के विकास के लिए, इस zebrafish भ्रूण बाई मॉडल स्वचालित रोबोट इंजेक्शन27,४३, जटिल वस्तु पैरामीट्रिक विश्लेषण और छँटाई (कोपा) प्रणालियों, और उच्च प्रवाह की विशेषता एक उच्च प्रवाह प्रणाली के लिए संशोधित किया जा सकता है आरएनए अनुक्रम विश्लेषण27,४४. इस तरह के zebrafish भ्रूण आधारित उच्च प्रवाह बाई मॉडलों के लिए vivo स्क्रीनिंग और परीक्षण के लिए पूरे पशु प्रणालियों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (उपंयास) विरोधी संक्रामक सामग्री के रूप में अच्छी तरह से एंटीबायोटिक उपचार या अंय विरोधी बाई रणनीतियों की प्रभावकारिता के परीक्षण के रूप में । इसके अलावा, intracellular अस्तित्व जीवाणुओं कीएक प्रमुख रणनीति है9,10,11,12,13की उपस्थिति में जीवित रहने के लिए । intracellular संक्रमण के अध्ययन के लिए zebrafish भ्रूणों की उपयोगिता३६,४६कई अध्ययनों में दिखाई गई है. इस प्रकार, हमारे भ्रूण मॉडल staphylococci या अंय intracellular रोगजनकों की उपस्थिति में intracellular अस्तित्व का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और रणनीतियों ऐसे intracellular संक्रमण के इलाज के लिए । इसके अलावा, में सीटू संकरण४५ तकनीक मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बैक्टीरिया या सामग्री या उनके संयोजन पर विशेष जीन की अभिव्यक्ति इंजेक्शन साइट है, जो के लिए मार्कर जीन की खोज करने के लिए मददगार हो सकता है बाई.

सारांश में, वर्तमान अध्ययन के लिए यहां विकसित तरीकों के साथ zebrafish भ्रूण की क्षमता से पता चलता है vivo में वास्तविक समय में सामग्री से जुड़े संक्रमण का अध्ययन । इस zebrafish भ्रूण मॉडल इसलिए उपंयास संक्रमण प्रतिरोधी सामग्री और का वादा निवारण और बाई के उपचार रणनीतियों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इन विट्रो अध्ययन और बड़ा जानवर मॉडल के बीच अंतर को बंद करने के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के वित्तीय इबीसा परियोजना द्वारा जैव चिकित्सा सामग्री (बीएमएम) कार्यक्रम और सह आर्थिक मामलों के डच मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया । लेखक zebrafish ट्रांसजेनिक लाइन (mpeg1: Gal4/यूएएस: Kaede) प्रदान करने के लिए मोनाश विश्वविद्यालय, ऑस्ट्रेलिया से प्रो Dr. ग्राहम Lieschke शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic soya agar BD Difco 236950 Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth BD Difco 211825
Polyvinylpyrrolidone40 Applichem A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) Life technology/ThemoFisher F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) Harvard Apparatus 30-0038
Micropipette puller instrument Sutter Instrument Inc Flaming p-97
Light microscope LM 20 Leica MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine) Sigma-Aldrich E10521-50G
Agarose MP Roche 11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80 Leica MDG3610450126
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand World Precision Instruments 00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector Eppendorf 5248ZO100329
Microtrube 2 mL pp Sarstedt 72.693.005
Zirconia beads Bio-connect 11079124ZX
MagNA lyser Roche 41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) Biomerieux 43671 Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich MO512-250G
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth) New Brunswick Scientific G10
Zebrafish incubator VWR Incu-line
Cuvettes BRAND 759015
Centrifuge Hettich-Zentrifugen ROTANTA 460R
Spectrometer Pharmacia biotech Ultrospec®2000
Forceps Sigma-Aldrich F6521-1EA
48 well-plates Greiner bio-one 677180
96 well-plates Greiner bio-one 655161
Petri dish Falcon 353003
Petri dish Biomerieux NL-132
ImageJ Not applicable Not applicable link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0 Prism Not applicable

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References

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इंजीनियरिंग अंक १४३ Zebrafish भ्रूण सामग्री से जुड़े संक्रमण Staphylococcus aureus पॉलिमर microspheres vivo दृश्य में intravital विश्लेषण प्रतिदीप्ति ठहराव
Vivo दृश्य और Intravital विश्लेषण में के लिए एक Zebrafish भ्रूण मॉडल-संबंधित <em>Staphylococcus aureus</em> संक्रमण
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Zhang, X., de Boer, L., Stockhammer, … More

Zhang, X., de Boer, L., Stockhammer, O. W., Grijpma, D. W., Spaink, H. P., Zaat, S. A. J. A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (143), e58523, doi:10.3791/58523 (2019).

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