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Bioengineering

Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58523
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Summary

El presente estudio describe un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infecciones asociadas a biomateriales en el tiempo basado en microscopía de fluorescencia. Este modelo es un sistema prometedor complementando modelos animales mamíferos como los modelos de ratón para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.

Abstract

Infecciones asociadas a biomateriales (BAI) es una causa importante del fracaso de los dispositivos médicos y biomateriales. Staphylococcus aureus es uno de los principales patógenos en BAI. Animal mamífero del BAI experimental actual modelos como modelos de ratón son costosos y desperdiciadores de tiempo y por lo tanto no es adecuado para el análisis de alto rendimiento. Por lo tanto, se desean que los nuevos modelos animales como sistemas complementarios para la investigación de BAI en vivo. En el presente estudio, el objetivo fue desarrollar un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infección bacteriana en presencia de biomateriales basados en la microscopía de fluorescencia. Además, se estudió la respuesta de macrófagos provocada. Para ello, utilizan fluorescentes expresando proteína de S. aureus y embriones de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en los macrófagos y desarrolló un procedimiento para inyectar bacterias solas o junto con microesferas en el músculo tejido de embriones. Para supervisar la progresión de la infección bacteriana en embriones vivos con el tiempo, ideamos un método simple pero confiable de puntuación microscópica de bacterias fluorescentes. Los resultados de puntuación microscópica demostraron que todos los embriones con más de 20 unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias dio como resultado una señal fluorescente positiva de las bacterias. Para estudiar los posibles efectos de los biomateriales en la infección, se determinó el número de UFC de S. aureus con y sin 10 μm microesferas de poliestireno (PS10) como biomateriales de modelo en los embriones. Por otra parte, se utilizó el archivo de proyecto ObjectJ "Pez cebra-Immunotest" en ImageJ para cuantificar la intensidad de fluorescencia de la infección de S. aureus con y sin PS10 con el tiempo. Resultados de ambos métodos mostraron mayor números de S. aureus en los embriones infectados con microesferas que en embriones sin microesferas, que indica una susceptibilidad creciente de la infección en presencia de biomaterial. Así, el presente estudio muestra el potencial del modelo de embrión de pez cebra para estudiar BAI con los métodos desarrollados aquí.

Introduction

Una variedad de dispositivos médicos (que se refiere como "biomateriales") se utilizan cada vez más en la medicina moderna para restaurar o reemplazar partes del cuerpo humano1. Sin embargo, la implantación de biomateriales predispone a un paciente a la infección, llamada una infecciones asociadas a biomateriales (BAI), que es una importante complicación de implantes en cirugía. Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis son dos especies bacterianas más frecuentes responsables de BAI2,3,4,5,6. Implantado de forma de biomateriales una superficie susceptible a la formación de biopelículas bacterianas. Por otra parte, respuesta inmune local puede ser trastornada por los biomateriales implantados, que reducirá la eficacia de remoción bacteriana. La separación inicial de infectar a las bacterias se realiza principalmente por infiltración de neutrófilos, que han fuertemente reducido capacidad bactericida en presencia de un insertado o implantan biomaterial7. Por otra parte, los macrófagos que infiltran el tejido después de la llegada inicial de neutrófilos a fagocitar las bacterias restantes pero no efectivamente matan intracelularmente, por desquiciados inmune señalando que es una consecuencia de la presencia combinada de el biomaterial y bacterias8. Así, la presencia de biomateriales puede facilitar la supervivencia intracelular de bacterias9,10,11,12,13 y biofilm formación en los implantados Biomateriales4,14. En consecuencia, BAI puede llevar a la insuficiencia y necesidad de reemplazo de biomateriales implantados, causando aumento de la morbilidad y la mortalidad y la hospitalización prolongada con costes adicionales2,15.

Un número creciente de estrategias anti-BAI está siendo desarrollados2,16,17. Evaluación in vivo de la eficacia de estas estrategias en los modelos animales relevantes es esencial. Sin embargo, tradicional BAI animales modelos experimentales (e.g. modelos del ratón de, ) son generalmente costosos, desperdiciadores de tiempo y por lo tanto no es adecuado para las pruebas de alto rendimiento de múltiples estrategias18. Desarrollo reciente de técnicas de imagen bio-óptico basado en etiquetado fluorescente bioluminiscente de las bacterias y las células del huésped puede permitir el monitoreo continuo de las interacciones de progresión y huésped-patógeno-host-material BAI en solo animales pequeños como ratones18,19,20,21. Sin embargo, esta técnica es relativamente compleja y aún en su infancia, y se deben abordar varios temas para el análisis cuantitativo de BAI18. Por ejemplo, una dosis de desafío alta es necesaria para visualizar la colonización bacteriana. Además, la luz dispersa y adsorción de bioluminiscencia/fluorescencia señales en tejidos de mamífero prueba animales también deben ser abordados18,19,21. Por lo tanto, modelos animales novedosos y rentables permitiendo la visualización intravital y análisis cuantitativo en el tiempo son valiosos sistemas complementarios para el estudio in vivo de BAI.

Pez cebra (embriones) se han utilizado como una herramienta versátil en vivo para disección huésped-patógeno y patogenia de la infección de varias especies bacterianas como micobacterias22, aeruginosa de los Pseudomonas23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25y estafilococos26,27. Embriones de pez cebra tienen muchas ventajas tales como transparencia óptica, un relativamente bajo coste de mantenimiento y de posesión de un sistema inmune muy similar a la de mamíferos28,29. Esto hace que los embriones de pez cebra un organismo modelo muy económico, vivir para intravital visualización y análisis de la progresión de la infección y host asociado respuestas28,29. Para permitir la visualización del comportamiento de la célula líneas de pez cebra transgénico, en vivo con diferentes tipos de células inmunes (por ejemplo,, los macrófagos y neutrófilos) e incluso con estructuras subcelulares fluorescencia de etiquetado han sido desarrollado28 ,29. Además, la tasa alta de reproducción del pez cebra ofrece la posibilidad de desarrollar sistemas de prueba de alto rendimiento con inyección robótica automatizada, cuantificación de fluorescencia automatizada y RNA secuencia análisis27, 30.

En el presente estudio, el objetivo fue desarrollar un modelo de embrión de pez cebra para infecciones asociadas a biomateriales usando técnicas de imágenes de fluorescencia. Para ello, hemos desarrollado un procedimiento para inyectar bacterias (S. aureus) en presencia de microesferas de biomaterial en el tejido muscular de los embriones de pez cebra. Utilizamos S. aureus RN4220 expresando mCherry proteína fluorescente (S. aureus- mCherry), que fue construida como se describe en otra parte de otra cepa de S. aureus 10,31. La línea de pez cebra transgénico (mpeg1: UAS/Kaede) expresando Kaede se utilizaron proteína verde fluorescente en los macrófagos32 y azul fluorescente poliestireno microesferas. En un estudio previo, hemos demostrado que la inyección intramuscular de microesferas en embriones de pez cebra para imitar la implantación del biomaterial es factible33. Para analizar cuantitativamente la progresión de BAI y la infiltración de la célula asociada en embriones solo con el tiempo, se utilizó el archivo de proyecto "Pez cebra-Immunotest" que funciona dentro de "ObjectJ" (un plug-in para ImageJ) para cuantificar la intensidad de fluorescencia de las bacterias que residen y macrófagos infiltración en las cercanías del sitio de la inyección de microesferas33. Además, se determinó el número de la Colonia formando unidades (UFC) de bacterias en presencia y ausencia de microesferas en los embriones para estudiar posibles efectos de los biomateriales en la infección. El presente estudio demuestra que con los métodos desarrollados aquí, el embrión de pez cebra es un prometedor novela vertebrado animal modelo para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.

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Protocol

En este protocolo, mantenimiento del pez cebra adulto es conforme a las normas locales de bienestar animal aprobado por el Comité de bienestar de los animales locales. Se realizaron experimentos con embriones según la Directiva 2010/63/UE.

1. preparación de ""las bacterias-sólo y suspensiones de microesferas de bacterias

Nota: Se utiliza la cepa de S. aureus RN4220 expresan la proteína fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry). La cepa de S. aureus RN4220 mutada en el gen regulador de virulencia agrA (gene accesorio regulador A)34y por lo tanto puede tener relativamente baja virulencia en el modelo de embrión de pez cebra. Pueden utilizarse otras cepas de S. aureus o especies bacterianas para BAI.

  1. Tomar 4 a 5 colonias de bacterias de Staphylococcus aureus RN4220 de soja tríptica placas agar suplidas con cloranfenicol 10 de μg/mL de y cultura de las bacterias en fase de crecimiento medio logarítmicos en 10 mL de caldo de soja tríptica suplementado con 10 μg/mL cloranfenicol a 37 ° C bajo agitación.
    1. En cultura, diluir 100 μl de la suspensión bacteriana en 900 μl de tampón de fosfato estéril salino (PBS) en una cubeta (ancho de 1 cm) para una medición de la densidad óptica (OD) a 620 nm (OD620). Las bacterias de la cultura hasta el OD620 alcanza 0,4 – 0,8.
      Nota: Un OD620 de 0.1 corresponde generalmente a 3.0 x 107 UFC/mL de S. aureus. OD620 de un inóculo de bacterias en fase de crecimiento logarítmico media está entre 0.4-0.8. Diferentes períodos de tiempo para el cultivo pueden ser necesaria para otras especies y cepas de bacterias.
  2. Centrifugue las bacterias a 3.500 x g por 10 min y resuspender las bacterias concentradas en 1 mL de PBS estéril. Posteriormente Lave las bacterias con estéril PBS 2 veces y finalmente resuspender las bacterias en 1.1 mL de solución al 4% (w/v) polivinilpirrolidona40 (PVP40) en PBS.
  3. Vórtice de esta suspensión bacteriana y diluir 100 μl de la suspensión en 900 μl de PBS estéril en una cubeta para la medición de OD620 . Ajustar la concentración de la suspensión bacteriana con solución de40 de PVP. Se trata de la suspensión "Sólo en bacterias".
  4. Biomateriales se pueden elegir libremente para mezclar con la suspensión bacteriana. En el presente estudio, se utilizan microesferas de poliestireno comercial (PS) (fluorescente azul, 10 μm). Para generar una suspensión de microesferas de bacterias, las microesferas durante 1 min a 1.000 x g, temperatura de la centrífuga, deseche el sobrenadante y resuspender las microesferas en suspensión "Sólo las bacterias" (en la solución de40 de PVP).
  5. Con el fin de inyectar dosis aproximadamente iguales de bacterias en presencia y en ausencia de microesferas, la concentración de la suspensión de microesferas de bacterias debe ser dos tercios de la concentración de la suspensión "Sólo las bacterias" (sin microesferas). Esto se logra mediante la dilución de la suspensión de microesferas de bacterias con 0,5 volumen40 de PVP. Mezclar las suspensiones con un vórtex. De la nota, esta relación (dos tercios) se ha evaluado para S. aureus. También es apropiado para S. epidermidis, pero se aconseja comprobar si esta relación también se aplica a otras especies bacterianas y otros tamaños (a 10 μm) o formas de biomateriales (que microesferas) que se inyecta.
  6. Compruebe la concentración de la suspensión "Sólo bacterias" y microesferas de bacterias por cultivo cuantitativo de diluciones seriadas 10 veces como abajo: transferir 100 μl de las suspensiones a un 96 placa de la pozo y diluidas en serie transfiriendo 10 alícuotas de μl de la suspensión en 90 μl de PBS estéril. Placa duplicados partes alícuotas de 10 μl de las suspensiones sin diluir y diluidas en las placas de agarosa, incubar las placas a 37 ° C durante la noche, contar las colonias y calcular el número de bacterias (unidades formadoras de colonias. UFC).

2. crianza, cosecha y mantenimiento de los embriones de pez cebra

  1. Siga el procedimiento general descrito anterior35,36 para cría, cosecha y mantenimiento de embriones de pez cebra, con las modificaciones que se describen a continuación. Cruz de una familia de pez cebra de aleta larga (TL) de Tupfel tipo salvaje o pez cebra de la línea transgénica seleccionada (aquí, Mpeg1: Kaede) en un tanque con una red añadido para inducir a las hembras para producir huevos después de que la luz se enciende, luego separar adultos de los huevos producidos.
  2. Recoger los embriones el día siguiente y descartar las no transparentes que no son viables. Mantener aproximadamente 60 embriones por placa de Petri (100 mm de diámetro) en el E3 media37 e incubar a 28 ° C. Eliminar embriones muertos y anormales y actualizar diariamente el medio de E3.

3. preparación de agujas de inyección

  1. Preparar las agujas de microcapillary de vidrio para la inyección con un instrumento de tirador de la micropipeta. Utilice la siguiente configuración: calor: 772, pull: 100, vel: 200, tiempo: 40, gas: 75.
  2. Romper la punta de la aguja con pinzas en la posición donde la aguja tiene un diámetro exterior de aproximadamente 20 μm (para 10 μm microesferas), utilizando un microscopio de luz con una barra de escala en el ocular. Evite las agujas con un tamaño de abertura muy grande, ya que pondrá en peligro la supervivencia de los embriones.
    Nota: La apertura puede ser escogida para ser más o menos grandes, dependiendo del tamaño y forma de biomateriales que se inyecta. En la literatura, las inyecciones con agujas con una abertura de aproximadamente 50 μm se han divulgado para causar una disminución significativa en la supervivencia de embriones38.

4. inyección de ""bacterias-sólo o suspensión de microesferas de bacterias en embriones de pez cebra

  1. Calentar la solución de agarosa (1 – 1,5% en peso en agua desmineralizada) usando un horno de microondas y verter en un plato de Petri de 100 mm. Coloque una plantilla de plástico encima de la solución de agarosa en la caja Petri para crear indentaciones en la agarosa para la colocación de embriones en posición adecuada, facilitar las inyecciones. Incubar a temperatura ambiente y retire el molde cuando la solución de agarosa ha solidificado.
  2. En la post-fertilización 3 d, coloque los embriones en caja Petri de 100 mm que contiene 0.02% (w/v) 3-aminobenzoico ácido (Metanosulfonato) para anestesiarlos. Después de 5 min, transferir los embriones a la placa de agarosa con E3 media que contiene 0,02% (p/v) Metanosulfonato y alinearlos en una orientación para la inyección. Para el Mpeg1: línea transgénica Kaede anestesiar primero embriones en E3 media Metanosulfonato de 0.02% (w/v) que contiene. Seleccionar embriones que expresan proteínas fluorescentes verdes usando un microscopio de fluorescencia estéreo.
  3. Carga de la aguja con aproximadamente 10 μl de la suspensión "Sólo bacterias" o microesferas de bacterias utilizando una pipeta de microloader. Coloque la aguja sobre un micromanipulador conectado al inyector de micro. Para el inyector usado aquí (véase tabla de materiales), uso la siguiente configuración para las inyecciones de 2 – 3 nL: presión: 300 – 350, presión: 0, tiempo: 2 ms.
    Nota: La configuración de la micro-inyector depende el inyector utilizado. Configuración del inyector deba ajustarse a las inyecciones de bacterias mezcladas con biomateriales con otras formas o tamaños.
    1. Utilizar agujas con la misma apertura para la inyección de la suspensión de ""las bacterias-sólo y la suspensión de microesferas de bacterias. Si la aguja está rota u obstruida, cambie siempre una aguja nueva para más inyecciones.
  4. Inserte la aguja en el tejido muscular de embriones bajo un microscopio de luz (figura 1), en un ángulo de 45 – 60 ° entre la aguja y el cuerpo de los embriones. Ajustar la posición de la aguja en el tejido moviéndolo suavemente hacia adelante y hacia atrás. Inyectar los embriones mediante un pedal conectado al inyector de micro.
  5. Después de la inyección de bacterias fluorescentes, anotar los embriones para infección exitosa bajo un microscopio de fluorescencia estéreo. Deseche la negativa de embriones anotadas (ningunas bacterias fluorescentes visibles o no visibles microesferas fluorescentes). Mantener embriones individualmente en E3 medio en placas de 48 pocillos. Actualizar diariamente el medio.

5. trituración de embriones puntuación microscópica y cultivo cuantitativo de bacterias

  1. Anotar todos los embriones microscópicamente para detectar la presencia de bacterias fluorescentes utilizando un microscopio de fluorescencia estéreo, comenzando inmediatamente después de las inyecciones y en cada día subsiguiente hasta que los embriones se seleccionan aleatoriamente para cultivo cuantitativo.
  2. Al azar seleccione unos embriones infectados vivo (5 a 6 en el presente estudio) poco después de la inyección y transferirlos individualmente para microtubos de 2 mL separadas con puntas estériles. Quiten el medio los embriones suavemente con PBS estéril una vez y añadir 100 μl de PBS estéril.
  3. Añadir granos de zirconia estéril de 2 – 3 (a 2 mm de diámetro) a cada vial y aplastar a los embriones con el homogenizador (véase Tabla de materiales) a 3.500 rpm durante 30 s. cultura el homogeneizado cuantitativamente como se describe en el paso 1.3.
    Nota: Otros homogeneizadores pueden necesitar ajustes diferentes.
  4. Al azar seleccione múltiples embriones en días posteriores después de la inyección de la cultura cuantitativa según paso 5.3.

6. fluorescencia microscopía de la progresión de la infección y la infiltración celular provocada en embriones de pez cebra

  1. Anestesiar los embriones como se describe en el paso 4.2. Pipetear 500 μl de una solución de PBS - 2% (peso) metil celulosa en una placa Petri conteniendo medio de E3 con 0,02% (p/v) Metanosulfonato. Coloque los embriones en la solución de metil celulosa y mantenerlas rectas y horizontales.
    Nota: Solución de celulosa de metilo se utiliza como un "pegamento", que debido a su viscosidad, puede inmovilizar temporalmente embriones en la mejor orientación para la proyección de imagen.
  2. Uso un microscopio de fluorescencia estéreo equipado con campo brillante, mCherry, proteína fluorescente verde (GFP) y UV filtros a los embriones individuales imagen idéntica configuración optimizado (e.g., intensidad, aumento y exposición tiempo) con 160 aumentos . Establecer el plano focal de forma que el daño tisular causado por la inyección es en el foco, utilizando el filtro de campo brillante. Ajuste la profundidad de Z-stack 10 tamaño μm y paso a 5 μm, que permite la grabación de 3 imágenes consecutivas.
  3. Imagen individual los embriones una vez al día de la inyección después de 5 h hasta después de la inyección 2 días. Excluir embriones muertos (ningún latido del corazón o embrión parcialmente degradados) para más imágenes y análisis. Mantener embriones individualmente en E3 medio en placas de 48 pocillos. Actualizar diariamente el medio.

7. análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia de progresión de la infección e infiltración celular provocado con objeto J archivo de proyecto "Pez cebra-Immunotest"

  1. Descargar "Pez cebra-Immunotest" y el manual detallado del enlace: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, como se describe en un anterior estudio33. En Resumen, abrir imágenes para el análisis con "Pez cebra-Immunotest", bajo el programa freeware imagen J. En cada imagen cargada, marcar manualmente el sitio de la inyección basado en el daño tisular observado de embriones.
    Nota: El sitio marcado se utiliza por "Pez cebra-Immunotest" como el punto central para detectar el pico de fluorescencia a una distancia de 50 μm. El pico de fluorescencia detectado se utiliza entonces como el centro de un área estandardizada (diámetro de 100 μm) para medición de fluorescencia.
  2. Haga clic en "cálculo" en el menú objeto J para ejecutar la medición fluorescente para múltiples canales, si procede, automáticamente todas las imágenes. Exportar los datos y analizar por métodos de la prueba estadística apropiada.

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Representative Results

El presente estudio evaluó la aplicabilidad de los embriones de pez cebra como modelo animal vertebrado novela para investigar infecciones asociadas a biomateriales. Técnica de la microinyección se ha utilizado comúnmente para inyectar diferentes especies bacterianas en embriones de pez cebra para causar infección22,26,27,30,36. Utilizando el procedimiento descrito en la figura 1, S. aureus solo o con microesferas de PS de 10 μm (PS10) fueron inyectadas en el tejido muscular de los embriones de pez cebra en el presente estudio. La inyección intramuscular de S. aureus causa dependiente de la dosis de infección en embriones (figura 2). Las dosis inyectadas eran cerca de las dosis de desafío dirigido (día 0 en la figura 2). Se observaron sólo pequeñas variaciones dentro de los grupos. Embriones inyectados con dosis de desafío alta demostradas la progresión de infección variable en 1 día y 2 días después de la inyección (figura 2, 6000 y 2000 UFC). La inyección de bacterias S. aureus fueron erradicadas o había proliferado y posteriormente establecido altos niveles de infección dentro de los embriones. Esto es similar a la progresión divulgada de la infección por S. aureus después de la inyección intravenosa en embriones de pez cebra26. Los embriones inyectados con dosis de desafío bajo de S. aureus despejaron las bacterias (figura 2, 600 y 200 UFC). Estos resultados indicaron que la dosis de desafío de S. aureus influye fuertemente en su progresión de la infección en embriones de pez cebra.

La inyección de bacterias y microesferas dio lugar a un número mayor de bacterias inyectadas que la inyección de bacterias solo (datos no mostrados). Al preparar el inóculo bacteriano para las inyecciones de ""bacterias-sólo en una concentración más alta (aproximadamente 1.5 veces mayor) que en la suspensión de microesferas de bacterias, fueron capaces de superar la diferencia en el número de UFC inyectado. Esta manera, es posible inyectar cantidades similares de bacterias de embriones en presencia y en ausencia de PS10 (día 0, figura 3). Los números de microesferas por inyección varían. Por ejemplo, en uno de nuestros experimentos, la mitad de las microesferas de 1 y 2 recibidos de embriones por inyección (embriones de 12 clientes de los 25 en el grupo de10 PS + S. aureus ), algunos recibieron 3 a 4 (8 de 25 embriones) y unas microesferas de 5 a 7 recibidas (5 de 25 em bryos). Sin embargo, estas variaciones no influyen los niveles de las respuestas celulares provocadas, según ha informado en un anterior estudio33.

A continuación, investigamos si la presencia de microesferas tiene un impacto en la progresión de la infección en embriones de pez cebra con dosis bajas de S. aureus. Para ello, inyecta aproximadamente 600 UFC de S. aureus- mCherry con o sin PS10. Utilizamos dos métodos para estudiar la progresión de la infección: cultivo cuantitativo (i) convencionales de los embriones infectados después de machacar y (ii) scoring de detección microscópica ("puntuación microscópica") de bacterias fluorescentes (S. aureus- mCherry). Se compararon los resultados de estos dos métodos. La puntuación se definió como "sí o no" visibilidad de bacterias fluorescentes en los embriones, independientemente de la intensidad de fluorescencia. Nuestros resultados demostraron que todos los embriones con más de 20 UFC de S. aureus- mCherry fueron positivos en microscópico puntuación (puntos rojos en la figura 3). Para 600 UFC de S. aureus por embrión, la presencia de PS10 parece no influir significativamente en la progresión de la infección. En todo momento puntos, tanto la frecuencia de infección embriones (indicados en la parte superior figura 3, dosis de desafío bajo) y el número de UFC después de machacar no fueron diferente para los embriones con o sin PS10 (figura 3, dosis baja de desafío). Esto sugiere que dosis más altas de desafío de S. aureus se requieren para estudiar los posibles efectos de los biomateriales en la progresión de la infección en embriones de pez cebra. Por lo tanto, inyecta aproximadamente 1.000 UFC de S. aureus en presencia y ausencia de PS10 embriones. El marcador microscópico no mostraron diferencias en la frecuencia de los embriones infectados con o sin PS10 en cualquier punto del tiempo (figura 3, dosis alta de desafío). La cultura cuantitativa, sin embargo, mostró un mayor número de UFC Obtenido de embriones en el grupo de10 PS que Obtenido de lo S. aureus -único grupo en 2 días posterior a la inyección (figura 3, alto + S. aureus dosis de desafío).

Para cuantificar la extensión de la infección en presencia y en ausencia de biomateriales en embriones de pez cebra por análisis de imagen, grabamos una serie de imágenes que muestran la progresión de la infección de S. aureus- mCherry (1.000 UFC por embrión) en la presencia y ausencia de PS10 en embriones vivos con el tiempo (Figura 4A). También registramos la infiltración provocada de Kaede verde los macrófagos expresan proteína fluorescentes en los embriones para cuantificar la respuesta inmune celular (Figura 4B). Proteína fluorescente Kaede puede sufrir conversión de color de verde a rojo bajo exposición a luz UV, dependiendo del tiempo de exposición y la intensidad de la luz39. Sin embargo, tal conversión de color no se observó bajo la condición experimental utilizada en el presente estudio. La intensidad de fluorescencia de las bacterias infección así como de los macrófagos infiltración dentro de un área estandardizada alrededor del sitio de inyección fue medida por nuestro archivo de proyecto ObjectJ "Pez cebra-Immunotest", en J. de la imagen" Pez cebra-Immunotest"define un área estandardizada de 100 μm (círculos amarillos en la figura 4) de diámetro alrededor de un punto indicado de la inyección. En los embriones, esta área incluye la mayoría de las bacterias fluorescentes que reside en la proximidad de las microesferas inyectadas, así como los infiltración de macrófagos. La presencia de un biomaterial mostró influencia tanto inicial susceptibilidad a infección e inmune respuestas celulares. En después de la inyección 5 h, infiltración de macrófagos en respuesta a S. aureus sólo fue significativamente superior en respuesta a S. aureus + PS10 (figura 5, infiltración de macrófagos, hpi 5). En 1 día después de la inyección embriones con PS10 mostraron niveles significativamente más altos de infección por S. aureus que embriones sin PS10 (figura 5, progresión de la infección, 1 dpi). Así, estos resultados cuantitativos demostraron que la combinación de grabación de imágenes de fluorescencia y el archivo de proyecto ObjectJ "Pez cebra-Immunotest" se puede utilizar para cuantificar la progresión de la infección y provoca respuesta inmune celular en presencia de un biomaterial en el modelo de embrión de pez cebra. El modelo permite evaluar pequeñas diferencias en las respuestas inmunes celular y niveles de infección bacteriana in vivo, y sólo requiere un microscopio de fluorescencia estéreo (con grabación de imágenes) y el acceso abierto "pez cebra-Immunotest" para la evaluación.

Figure 1
Figura 1: esquema procedimiento de la inyección de suspensión de microesferas de bacterias en el músculo de la cola de los embriones de pez cebra. Esta figura ha sido modificada desde Zhang et al.33 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: número de UFC de S. aureus Obtenido de embriones de pez cebra inyectados con inóculos, que van desde 6.000 a 200 UFC por embrión y evaluaron en la inyección de 0 a 2 días. Las líneas rojas representan el número promedio de UFC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Número de UFC y puntuación microscópica de mCherry expresando proteína de S. aureus (S. aureus- mCherry) en embriones de pez cebra, evaluados en diferentes puntos temporales. Dosis de reto bajo: 600 UFC por embrión; Dosis de desafío alto: 1.000 UFC por embrión; PS10: 10 μm PS microesferas; «+», embriones inyectados con S. aureus- mCherry junto con PS10; "-", los embriones inyectaron con S. aureus- mCherry, tan sin PS10. Los embriones se anotó microscópico de bacterias fluorescentes y seleccionados al azar para cultivo cuantitativo de bacterias después de machacar de embriones en el día de la inyección (día 0) y en el día 1 y día 2 después de la inyección. Los embriones microscópico marcados positivo y negativo para bacterias fluorescentes se muestran en puntos rojos y negros, respectivamente. El número de puntuación microscópicamente positivo divididos por el número total de embriones anotados (frecuencia de embriones infectados) en cada momento los embriones se indican en la parte superior del gráfico. Las diferencias en frecuencias de embriones infectados y el número de UFC entre el S. aureus + PS10 y S. aureus sólo grupos en cada momento se analizaron por el pescador ' exact test y test de Mann-Whitney, respectivamente. p ≤ 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes representativas de registro de la progresión de la infección de expresar mCherry S. aureus (A, rojo) en la presencia y ausencia de 10 μm PS microesferas (PS10, azul) y la infiltración provocada de Kaede proteína-expresar macrófagos (B, verde) en embriones de 5 h después de la inyección (hpi) para 2 días posterior a la inyección (dpi). Como controles se utilizaron embriones no tratadas (NT). Los círculos amarillos (100 μm de diámetro) indican el área estandardizada en el sitio de inyección para la cuantificación de la fluorescencia usando el archivo de proyecto de ObjectJ "Immunotest de pez cebra '. La fluorescencia cuantificada de bacterias y de los macrófagos es representada en la figura 5. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cuantificación de la fluorescencia de la progresión de la infección de S. aureus y la infiltración de macrófagos provocada en presencia y ausencia de 10 μm PS microesferas (PS10) en embriones de pez cebra de 5 horas posterior a la inyección (hpi) 2 días después de la inyección (PPP), mediante el proyecto ObjectJ del archivo "Pez cebra-Immunotest". Un área estandardizada en el sitio de inyección fue utilizado para la cuantificación de la fluorescencia (con un diámetro de 100 μm, indica como los círculos amarillos en la figura 4). Como controles se utilizaron embriones no tratadas (NT). Diferencias entre cada dos grupos en cada momento se analizaron punto por Mann-Whitney prueba, *p ≤ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Infecciones asociadas a biomateriales (BAI) es una complicación clínica grave. Una mejor comprensión de la patogenesia del BAI en vivo ofrecería nuevas ideas para mejorar la prevención y tratamiento de BAI. Sin embargo, experimental BAI animales modelos actuales como modelos murinos son costosos, que requieren mucho trabajo y requieren personal especializado entrenado en las técnicas quirúrgicas complejas. Por lo tanto, estos modelos no son adecuados para el análisis de alto rendimiento. Requisitos para modelos de embrión de pez cebra son menos complejos y en general los costos son más bajos que para modelos murinos, el presente estudio evaluó si embriones de pez cebra pueden ser utilizados como un modelo novedoso de animales vertebrado para investigar BAI en vivo, complementario a los modelos de mamíferos.

Para configurar el modelo BAI de embrión de pez cebra, hemos desarrollado un protocolo de la inyección de bacterias y microesferas basadas en un método para la inyección intramuscular de microesferas en embriones descritos antes de33. De esta manera, la mayoría de las bacterias está presente en las cercanías de las microesferas en embriones, mímico la interacción biomaterial de bacterias que ocurre durante o poco después de la implantación de biomateriales en los seres humanos/mamíferos.

Para poder comparar la progresión de la infección en presencia y en ausencia de microesferas en embriones de pez cebra, embriones deben ser desafiados con similar número inicial de bacterias con y sin microesferas. Sin embargo, según nuestra experiencia, coinyección de suspensión de microesferas de bacterias produce más bacterias ser inyectadas que la inyección de la suspensión "Sólo las bacterias". Para solucionar este problema, se debe adaptar la relación entre la concentración de bacterias en suspensiones de ""bacterias-sólo (sin microesferas) y en suspensiones de microesferas de bacterias. En el presente estudio, la concentración de S. aureus en la suspensión de ""las bacterias-sólo debe ser aproximadamente 1,5 veces mayor que la concentración en la suspensión de microesferas de bacterias. Si esta relación también aplica a otras especies bacterianas y otros biomateriales aún está por probarse. De nota, para inyectar cantidades similares de bacterias con y sin microesferas, la apertura de las agujas usadas para inyecciones de cualquier suspensión debe ser cerca idénticos como sea posible.

Varias propiedades de un biomaterial como forma y el tamaño juegan un papel importante en la determinación de la inyectabilidad y coinyección con bacterias. En el presente estudio, utilizamos 10 μm microesferas de poliestireno (PS10) como biomateriales de modelo. Según nuestra experiencia, microesferas de un tamaño de hasta 15 μm son inyectables durante 3 días viejos embriones siguiendo el protocolo desarrollados en el presente estudio33. Para las microesferas de tamaño relativamente grande (e.g., ≥ 10 μm), Desaconsejamos el uso de la no generación o forma irregular microesferas/micropartículas que tienden a provocar la obstrucción de la aguja. Si biomateriales en otras formas de Ronda y en diferentes tamaños son elegidos para ser utilizado, su inyectabilidad necesita ser probado. Para (co) inyección de microesferas y bacterias, se utilizó una solución de polivinilpirrolidona (PVP) de 4% para facilitar la dispersión. Esto puede ser útil para la inyección de biomateriales con y sin bacterias en embriones en general.

Como fue el caso de las inyecciones de microesferas sólo33,40, los números de microesferas inyectados junto con las bacterias en embriones variaban por inyección, sobre todo desde 1 hasta 4 microesferas por embrión. Sin embargo, puesto que tales variaciones no produjo diferencias en los niveles de la respuesta celular inmune provocada en embriones33, ellos también no esperaba que influyen en los efectos potenciales de microesferas en la progresión de la infección. Sin embargo, desear nuevos enfoques permitiendo que las inyecciones de la microesfera de una solo (solos o junto con las bacterias).

Se evaluó si puntuación microscópica de la presencia de bacterias fluorescentes puede utilizarse como un "sí o no" sistema de puntuación para analizar la progresión de la infección en embriones vivos. El criterio de una partitura microscópico positivo se definió como la presencia de bacterias fluorescentes visibles, independientemente de la intensidad de fluorescencia. Comparado con el cultivo cuantitativo de bacterias, nuestros resultados representativos sugirieron que puntuación microscópica puede distinguir embriones con 20 o más UFC de bacterias S. aureus de embriones con un menor número de UFC o ninguna infección. Así, puesto que solamente una baja cantidad de bacterias es necesaria para un resultado positivo, este método es casi tan sensible como el cultivo cuantitativo. Puesto que los embriones no necesita ser sacrificado y no microscopios de gama alta o sistemas para fluorescencia están obligados a realizar análisis con este método, consideramos microscopio anotando un método simple pero confiable para monitorear la progresión de la infección de bacterias en embriones vivos. Para el análisis cuantitativo del nivel de infección (más que el "sí o no" sistema de puntuación como se describe arriba) y respuesta inmune celular en embriones vivo sola, hemos aplicado el archivo de proyecto ObjectJ "Pez cebra-Immunotest" para cuantificar la intensidad de fluorescencia de las bacterias fluorescentes y fluorescentes macrófagos reconocen a tiempo. Se utilizó un área estandardizada (con un diámetro de 100 m) que rodea el sitio de la inyección para medir fluorescencia, ya que esta área ha demostrado que son la mayoría de las bacterias y los macrófagos infiltración. Se publicó un manual detallado de "Pez cebra-Immunotest" previamente33,40. De la nota, "Pez cebra-Immunotest" es un acceso abierto plug-in para el ImageJ, que puede ser adaptado por el usuario. Por ejemplo, el diámetro del área de análisis y otros parámetros de "Pez cebra-Immunotest" se puede cambiar libremente según la configuración del estudio (ver ejemplos en el enlace proporcionan en el paso 7 en el protocolo).

Para demostrar los posibles efectos de mejora de la infección de los biomateriales en embriones de pez cebra, la dosis de desafío de las bacterias debe evaluarse. En el presente estudio, hemos encontrado que una dosis de desafío de 1.000 UFC de S. aureus por embrión o superior es requerida. Niveles más altos de infección por S. aureus en embriones con PS10 que en los que no PS10 se encontraron en los primeros 2 días después de la inyección, lo que indica que la presencia de biomateriales facilita transitorio consecuencia de S. aureus en los embriones. Si la infección permanece en altos niveles en presencia de biomateriales en más puntos del tiempo debe estudiarse embriones mayor bajo aprobación ética según normativa aplicable. Desde el despacho de S. aureus en embriones de pez cebra depende principalmente fagocitosis y muerte por macrófagos y neutrófilos23,24, la consecuencia de las bacterias puede explicarse por una menor eficacia de la fagocitos para matar a las bacterias debido a la presencia de biomateriales. Esto en consonancia con la mejora de riesgo bien conocido de la infección por biomateriales en pacientes2,4,15, también se observa en los modelos animales más complejos como el ratón y otros modelos animales10 ,11,12,13. Además de infección por S. aureus , progresión de la infección de S. epidermidis u otros agentes patógenos en la presencia de biomateriales puede investigarse siguiendo el protocolo descrito en el presente estudio. Desde el punto de biomateriales, varias propiedades de los materiales (composición química, , hidrofobicidad, aspereza y cargas de superficie) pueden influir en las respuestas celulares o bacterias-material interacción41, 42. nuestro estudio anterior ha demostrado que la inyección de un biomaterial (en presencia de PVP) provocaron una fuerte infiltración de macrófagos comparados con la inyección de sólo PVP en embriones de pez cebra. Por otra parte, embriones de pez cebra reaccionaron diferentemente a microesferas de poli (-caprolactone) y poliestireno33. Por lo tanto, la inyección de microesferas de diferente naturaleza también puede tener efectos diferenciales en la mejora de la infección, que puede evaluarse fácilmente mediante el método descrito aquí.

Para un mayor desarrollo, este modelo BAI de embrión de pez cebra podrá ser modificado por un sistema de alto rendimiento ofrece automatizado robótico inyección27,43, análisis paramétrico complejo objeto y clasificación de sistemas (COPAS) y alto rendimiento Secuencia del RNA análisis27,44. Tales modelos BAI de pez cebra basada en embriones de alto rendimiento pueden usarse como todo animales sistemas para en vivo detección y pruebas de biomateriales Antiinfecciosos (novela) así como pruebas de la eficacia de tratamientos con antibióticos u otras estrategias anti-BAI. Además, la supervivencia intracelular es una de las estrategias principales de las bacterias a sobrevivir en la presencia de biomateriales9,10,11,12,13. La utilidad de los embriones de pez cebra para el estudio de infección intracelular se ha demostrado en varios estudios36,46. Por lo tanto, nuestro modelo de embrión puede utilizarse para estudiar la supervivencia intracelular de estafilococos u otros agentes patógenos intracelulares en presencia de biomateriales y estrategias para el tratamiento de tales infecciones intracelulares. Además, puede utilizarse técnicas de hibridación in situ45 en el modelo para estudiar la influencia de bacterias o biomateriales o su combinación en la expresión de genes particulares en el sitio de inyección, que puede ser útil para descubrir genes marcadores para BAI.

En Resumen, el presente estudio muestra el potencial de los embriones de pez cebra con los métodos desarrollados para estudiar infecciones asociadas a biomateriales en tiempo real en vivo. Este modelo de embrión de pez cebra por lo tanto puede utilizarse para investigar nuevos biomateriales resistentes a la infección y prometedora estrategias de prevención y tratamiento de BAI y para cerrar la brecha entre los estudios in vitro y modelos animales más grandes.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por el proyecto de IBIZA del programa biomédico Material (BMM) financieramente y cofinanciado por el Ministerio holandés de asuntos económicos. Los autores desean agradecer Prof. Dr. Graham Lieschke de Monash University, Australia para proporcionar la línea de pez cebra transgénico (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic soya agar BD Difco 236950 Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth BD Difco 211825
Polyvinylpyrrolidone40 Applichem A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) Life technology/ThemoFisher F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) Harvard Apparatus 30-0038
Micropipette puller instrument Sutter Instrument Inc Flaming p-97
Light microscope LM 20 Leica MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine) Sigma-Aldrich E10521-50G
Agarose MP Roche 11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80 Leica MDG3610450126
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand World Precision Instruments 00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector Eppendorf 5248ZO100329
Microtrube 2 mL pp Sarstedt 72.693.005
Zirconia beads Bio-connect 11079124ZX
MagNA lyser Roche 41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) Biomerieux 43671 Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich MO512-250G
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth) New Brunswick Scientific G10
Zebrafish incubator VWR Incu-line
Cuvettes BRAND 759015
Centrifuge Hettich-Zentrifugen ROTANTA 460R
Spectrometer Pharmacia biotech Ultrospec®2000
Forceps Sigma-Aldrich F6521-1EA
48 well-plates Greiner bio-one 677180
96 well-plates Greiner bio-one 655161
Petri dish Falcon 353003
Petri dish Biomerieux NL-132
ImageJ Not applicable Not applicable link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0 Prism Not applicable

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References

  1. Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
  2. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
  3. Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
  4. Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
  5. Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
  6. Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
  7. Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
  8. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
  9. Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
  10. Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
  11. Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
  12. Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
  13. Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
  14. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
  15. Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
  16. Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
  17. Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
  18. Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
  19. Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
  20. Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
  21. van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
  22. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
  23. Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
  24. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
  25. Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
  27. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  28. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
  29. Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
  30. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  31. Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
  32. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
  33. Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
  34. Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
  35. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  36. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
  37. Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
  38. Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
  39. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
  40. Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
  41. Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
  42. Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
  43. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
  44. Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
  45. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
  46. Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).

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Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados <em>Staphylococcus aureus</em> infección
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Zhang, X., de Boer, L., Stockhammer, O. W., Grijpma, D. W., Spaink, H. P., Zaat, S. A. J. A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (143), e58523, doi:10.3791/58523 (2019).

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