Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Zebrafisk Embryo Model for In Vivo visualisering og Intravital analyse af biomateriale-associerede Staphylococcus aureus infektion

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58523
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Summary

Den nuværende undersøgelse beskriver en zebrafisk embryo model for in vivo visualisering og intravital analyse af biomateriale-associerede infektion over tid baseret på Fluorescens mikroskopi. Denne model er en lovende system som supplement til pattedyr dyremodeller såsom musemodeller for at studere biomateriale-associerede infektioner in vivo.

Abstract

Biomateriale-associerede infektion (BAI) er en væsentlig årsag til svigt af biomaterialer/medicinsk udstyr. Staphylococcus aureus er en af de store patogener i BAI. Nuværende eksperimentelle BAI pattedyr dyre modeller såsom musemodeller er dyrt og tidskrævende, og derfor ikke velegnet til høje overførselshastighed analyse. Således er er romanen dyremodeller som komplementære systemer for at undersøge BAI in vivo ønsket. I nuværende undersøgelse, vi har til formål at udvikle en zebrafisk embryo model for in vivo visualisering og intravital analyse af bakteriel infektion i overværelse af biomaterialer baseret på Fluorescens mikroskopi. Derudover blev provokeret makrofag svar studeret. Til dette formål, vi anvendte fluorescerende proteiner-udtrykker S. aureus og transgene zebrafisk embryoner udtrykker fluorescerende proteiner i deres makrofager og udviklet en procedure for at injicere bakterier alene eller sammen med mikrokugler i musklen væv af embryoner. For at overvåge bakterieinfektion progression i levende embryoner over tid, udtænkt vi en enkel, men pålidelig metode til mikroskopiske scoring af fluorescerende bakterier. Resultater fra mikroskopiske scoring viste, at alle embryoner med mere end 20 kolonidannende enheder (CFU) af bakterier viste en positiv fluorescerende signal af bakterier. For at undersøge de potentielle virkninger af biomaterialer på infektion, besluttet vi CFU numre af S. aureus med og uden 10 µm polystyren mikrokugler (PS10) som model biomaterialer i embryoner. Desuden brugte vi ObjectJ-projektfil "Zebrafisk-Immunotest" opererer i ImageJ for at kvantificere fluorescens-intensiteten af S. aureus infektion med og uden PS10 over tid. Resultaterne fra begge metoder viste højere numre af S. aureus i smittede fostre med mikrokugler end i embryoner uden mikrokugler, som angiver en øget infektion modtagelighed i nærværelse af biomateriale. Således, den nuværende undersøgelse viser potentiale af zebrafisk embryo model til at studere BAI med de metoder, der er udviklet her.

Introduction

En bred vifte af medicinsk udstyr (benævnt "biomaterialer") bruges i stigende i moderne medicin til at genoprette eller erstatte menneskelige legeme dele1. Dog disponerer implantation af biomaterialer en patient til infektion, kaldet en biomateriale-associerede infektion (BAI), som er en væsentlig komplikation af implantater i kirurgi. Staphylococcus aureus og Staphylococcus epidermidis er to mest udbredte bakteriearter, der er ansvarlig for BAI2,3,4,5,6. Implanteret biomaterialer form en overflade, der er modtagelige for bakterielle Biofilmdannelse. Desuden kan lokale immunrespons gale af de implanterede biomaterialer, forårsager reduceret effektiviteten af bakteriel clearance. Indledende regnskabsafslutning inficerer bakterier udføres hovedsagelig af infiltrerer neutrofiler, som kraftigt har reduceret baktericide kapacitet i overværelse af en indsat eller implanteret biomateriale7. Derudover dræbe makrofager infiltrerer vævet, efter den indledende tilstrømning af neutrofiler vil phagocytosis de resterende bakterier men ikke kan effektivt dem intracellulært, på grund af sindssyge immun signalering, som er en konsekvens af den kombinerede tilstedeværelsen af den biomateriale og bakterier8. Således er kan tilstedeværelsen af biomaterialer lette intracellulære overlevelse af bakterier9,10,11,12,13 og biofilm dannelse på den indopererede biomaterialer4,14. Derfor kan BAI føre til fiasko og behovet for udskiftning af implanterede biomaterialer, forårsager øget sygelighed og dødelighed og langvarig indlæggelse med meromkostninger2,15.

Et stigende antal anti-BAI strategier er ved at blive udviklet2,16,17. In vivo evaluering af effekten af disse strategier i relevante dyremodeller er afgørende. Traditionelle eksperimentelle BAI dyremodeller (f.eks., musemodeller) er dog normalt dyrt, tidskrævende og derfor ikke velegnet til høje overførselshastighed afprøvning af flere strategier18. Seneste udvikling af bio-optiske billeddannelse teknikker baseret på en bioluminescerende/fluorescerende mærkning af værtsceller og bakterier kan tillade til kontinuerlig overvågning af BAI progression og vært-patogen/host-materiale interaktioner i enkelt lille dyr f.eks mus18,19,20,21. Dog, denne teknik er relativt komplekse og stadig i sin vorden, og flere problemer skal løses til kvantitativ analyse af BAI18. For eksempel, er en høj udfordring dosis forpligtet til at visualisere bakteriel kolonisering. Derudover lys spredning og adsorptionen af bioluminescens/fluorescens signaler i væv af pattedyr test dyr skal også være rettet18,19,21. Derfor, roman, omkostningseffektive dyremodeller giver mulighed for intravital visualisering og kvantitativ analyse over tid er værdifuld supplerende systemer for at studere BAI in vivo.

Zebrafisk (embryoner) har været brugt som en alsidig in vivo redskab til dissekere vært-patogen interaktioner og infektion patogenesen af flere bakteriearter mykobakterier22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25og stafylokokker26,27. Zebrafisk embryoner har mange fordele som optisk gennemsigtighed, en relativt lav vedligeholdelsesomkostninger og besiddelse af en immun ordning meget lig den i pattedyr28,29. Dette gør zebrafisk embryoner en meget økonomisk, levende model organisme for intravital visualisering og analyse af infektion progression og tilknyttede vært svar28,29. At tillade visualisering af celle behavior in vivo, transgene zebrafisk linjer med forskellige typer af immunceller (f.eks., makrofager og neutrofiler) og endda med fluorescently mærket subcellulært strukturer har været udviklet28 ,29. Desuden giver høj reproduktion sats af zebrafisk mulighed for at udvikle høj overførselshastighed testsystemer byder automatiseret robot injektion, automatiseret fluorescens kvantificering og RNA sekvens analyse27, 30.

I den foreliggende undersøgelse, vi har til formål at udvikle en zebrafisk embryo model for biomateriale-associerede infektion ved hjælp af fluorescens Billeddannende teknikker. Med henblik herpå udviklet vi en procedure for at injicere bakterier (S. aureus) i nærværelse af biomateriale mikrokugler ind i muskelvævet zebrafisk embryoner. Vi brugte S. aureus RN4220 udtrykker mCherry fluorescerende proteiner (S. aureus- mCherry), som blev bygget som beskrevet andetsteds for en anden S. aureus stamme10,31. Linjen transgene zebrafisk (mpeg1: UAS/Kaede) udtrykker Kaede grøn fluorescerende proteiner i den makrofager32 og blå fluorescerende polystyren mikrokugler blev brugt. I en tidligere undersøgelse, har vi vist, at intramuskulær injektion af mikrokugler i zebrafisk embryoner til at efterligne biomateriale implantation er muligt33. For at analysere kvantitativt progression af BAI og tilknyttede celle infiltration i enkelt embryoner over tid, brugte vi projektfilen "Zebrafisk-Immunotest", der drives inden for "ObjectJ" (et plug-in for ImageJ) at kvantificere fluorescens-intensiteten af bakterier har bopæl og makrofager infiltrerer omkring injektionsstedet mikrokugler33. Derudover vi bestemmes antallet af kolonidannende enheder (CFU) af bakterier i tilstedeværelse og fravær af mikrokugler i embryoner til at studere potentielle effekter af biomaterialer på infektion. Vores nuværende undersøgelse viser, at med de metoder, der udvikles her, zebrafisk embryoet er en lovende, Roman hvirveldyr dyremodeller for at studere biomateriale-associerede infektioner in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denne protokol er vedligeholdelse af voksen zebrafisk i overensstemmelse med de lokale dyrevelfærd forordninger som godkendt af den lokale dyrevelfærd. Eksperimenter med embryoer blev udført efter 2010/63/EU-direktiv.

1. forberedelse af "Bakterier-only" og bakterier-mikrokugler suspensioner

Bemærk: S. aureus RN4220 stamme at udtrykke mCherry fluorescerende proteiner (S. aureus- mCherry) bruges. S. aureus RN4220 stamme er muteret i virulens regulator gen agrA (tilbehør gen regulator A)34, og derfor har relativt lav virulens i zebrafisk embryo model. Andre S. aureus stammer eller andre bakteriearter for BAI kan bruges.

  1. Tage 4-5 kolonier af S. aureus RN4220 bakterier fra tryptic soja agar kultur plader suppleret med 10 µg/mL chloramphenicol og kultur bakterier til midten af logaritmisk vækstfase i 10 mL af tryptic soja bouillon suppleret med 10 µg/mL chloramphenicol ved 37 ° C under omrystning.
    1. Under kultur, fortyndes 100 µL af den bakterielle suspension i 900 µL i sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i en kuvette (bredde 1 cm) for en optisk (OD) densitetsmåling på 620 nm (OD620). Kultur for bakterier, indtil OD620 når 0,4-0,8.
      Bemærk: En OD620 af 0,1 generelt svarer til 3.0 x 107 CFU/mL S. aureus. OD620 af et inokulum af bakterier i midten af logaritmisk vækstfase er mellem 0,4-0,8. Forskellige tidsperioder for dyrkning kan være behov for andre arter og stammer af bakterier.
  2. Centrifugeres bakterier på 3.500 x g i 10 min. og genopslæmmes pelleted bakterier i 1 mL steril PBS. Efterfølgende vask bakterier med steril PBS 2 gange, og endelig genopslæmmes bakterier i 1,1 mL af 4% (w/v) polyvinylpyrrolidon40 (PVP40) i PBS.
  3. Vortex denne bakteriel suspension og fortyndet 100 µL af suspension i 900 µL sterilt PBS i en kuvette for OD620 måling. Justere koncentrationen af bakteriel suspension med PVP40 løsning. Dette er den "Bakterier-only" suspension.
  4. Biomaterialer kan vælges frit at blande med bakteriel suspension. I den foreliggende undersøgelse anvendes kommercielt polystyren (PS) mikrokugler (blå fluorescerende, 10 µm). For at generere en bakterier-mikrokugler suspension, centrifugeres mikrokugler for 1 min på 1.000 x g, stuetemperatur, supernatanten og genopslæmmes i mikrokugler "Bakterier-only" suspension (i PVP40 løsning).
  5. For at injicere tilnaermelsesvis lige store doser af bakterier til stede og i mangel af mikrokugler, skal koncentrationen af bakterier-mikrokugler suspension være to tredjedele af koncentrationen af den "Bakterier-only" suspension (uden Mikrokugler). Dette opnås ved at fortynde bakterier-mikrokugler suspension med 0,5 volumen af PVP40 løsning. Bland suspensioner af vortexing. Bemærk, har dette forhold (to tredjedele) vurderet for S. aureus. Det er også passende for S. epidermidis, men det tilrådes at kontrollere, om dette forhold også gælder for andre bakteriearter og andre størrelser (end 10 µm) eller figurer af biomaterialer (end mikrokugler) skal injiceres.
  6. Kontrollere koncentrationen af "Bakterier-only" og bakterier-mikrokugler suspensionen af kvantitative kultur af 10-fold serielle fortyndinger som nedenfor: overføre 100 µL af suspensioner til en 96 godt-plade og seriefremstillede fortyndet ved at overføre 10 µL delprøver af den suspension til 90 µL sterilt PBS. Plade dublerede 10 µL delprøver af ufortyndet og fortyndet suspensioner på Agarosen plader, inkuberes plader ved 37 ° C natten over, kolonierne og beregne antallet af bakterier (kolonidannende enheder. CFU).

2. avls, høst, og vedligeholdelse af zebrafisk embryoner

  1. Følg de almindelige procedurer beskrevne tidligere35,36 for avlssvin, høst, vedligeholdelse af zebrafisk embryoner, med ændringer beskrives nedenfor. Krydse en familie af vildtype Tupfel lang fin (TL) zebrafisk eller zebrafisk for den valgte linje for transgene (her, Mpeg1: Kaede) i en tank med en netto tilføjet til at fremkalde de voksne hunner til at producere æg, når lyset tændes derefter adskille voksne fra de producerede æg.
  2. Indsamle embryoner næste dag og kassér de uigennemsigtige dem, som ikke er levedygtig. Holde ca 60 embryoner pr. petriskål (100 mm i diameter) i E3 medium37 og inkuberes ved 28 ° C. Fjerne døde og abnorme embryoner, og Opdater E3 medium dagligt.

3. forberedelse af injektion nåle

  1. Forbered glas microcapillary kanyler til injektion ved hjælp af en mikropipette puller instrument. Brug følgende indstillinger: varme: 772, pull: 100, vel: 200, tid: 40, gas: 75.
  2. Bryde nål-spidsen med pincet på den position, hvor nålen har en ydre diameter på cirka 20 µm (til 10 µm mikrokugler), ved hjælp af et lysmikroskop med en skala bar i okulære. Undgå nåle med en meget stor åbning størrelse, da de vil gå på kompromis overlevelse af embryoner.
    Bemærk: Åbningen kan blive valgt til at være mindre eller større, afhængigt af størrelsen og formen af biomaterialer skal injiceres. I litteraturen, er injektioner bruger nåle med en åbning på ca. 50 µm blevet rapporteret at forårsage et betydeligt fald i embryo overlevelse38.

4. indsprøjtning af "Bakterier-kun" eller bakterier-mikrokugler Suspension i zebrafisk embryoner

  1. Varme Agarosen løsning (1-1,5% (wt) i demi-vand) ved hjælp af en mikrobølgeovn ovn og hæld i en 100-mm petriskål. Sted en plast støber skabelon oven på Agarosen løsning i petriskålen at oprette fordybninger i Agarosen for markedsføring embryoner i rette positioner, lette injektioner. Inkuber ved stuetemperatur og fjerne formen når opløsningen Agarosen er størknet.
  2. 3 d efter befrugtningen sted embryoner i en 100 mm petriskål indeholdende 0,02% (w/v) 3-aminobenzoic syre (Tricaine) til at anaesthetize dem. Efter 5 min, overførsel af embryoner til Agarosen pladen overlejres med E3 medium indeholdende 0,02% (w/v) Tricaine og tilpasse dem i en orientering til injektion. For Mpeg1: Kaede transgene linje først anaesthetize embryoner i E3 medium indeholdende 0,02% (w/v) tricaine. Vælg derefter embryoner udtrykker grøn fluorescerende proteiner ved hjælp af en stereo fluorescens mikroskop.
  3. Indlæse nålen med ca. 10 µL af "Bakterier-kun" eller bakterier-mikrokugler suspensionen ved hjælp af en microloader pipette tip. Montere nål ind på en micromanipulator tilsluttet mikro-injektor. For injektoren bruges her (se tabel af materialer), bruger følgende indstillinger for injektioner af 2 – 3 nL: pres: 300 – 350, modtryk: 0, tid: 2 ms.
    Bemærk: Indstillinger for mikro-injektor afhænger injektoren anvendes. Injektor indstillinger muligvis justeres for injektioner af bakterier blandet med biomaterialer med andre figurer eller størrelser.
    1. Brug nåle med den samme åbning til injektion af de "Bakterier-only" suspension og bakterier-mikrokugler suspension. Hvis nålen er brudt eller tilstoppet, altid skifte til en ny kanyle til yderligere injektioner.
  4. Indsætte nålen ind i muskelvævet embryoner under et lysmikroskop (figur 1), i en vinkel af 45 – 60 ° mellem nålen og kroppen af embryoner. Justere placeringen af nålen i vævet ved forsigtigt at flytte den frem og tilbage. Injicere embryoner ved hjælp af en fodpedal tilsluttet mikro-injektor.
  5. Efter injektion af fluorescerende bakterier, score embryoner for vellykket infektion under en stereo fluorescens mikroskop. Kassér embryoner scorede negativ (ingen synlige fluorescerende bakterier eller ingen synlige fluorescerende mikrokugler). Vedligeholde embryoner individuelt i E3 mediet i 48-godt plader. Opdater medium dagligt.

5. knusning af embryoner, mikroskopiske Scoring og kvantitative kultur af bakterier

  1. Score alle embryoner mikroskopisk for tilstedeværelsen af fluorescerende bakterier ved hjælp af en stereo fluorescens mikroskop, starter straks efter injektioner, og hver efterfølgende dag indtil embryonerne er tilfældigt udvalgt til kvantitative kultur.
  2. Tilfældigt vælge et par live inficerede embryoner (5 til 6 i den nuværende undersøgelse) kort efter injektion og overføre dem individuelt til separate 2 mL microtubes ved hjælp af steril tips. Fjern mediet, vaske embryoner forsigtigt med steril PBS engang og tilsæt 100 µL sterilt PBS.
  3. Tilføje 2-3 sterile zirconia perler (2 mm i diameter) til hvert hætteglas og knuse embryoner ved hjælp af homogeniseringsapparat (Se Tabel af materialer) på 3.500 rpm for 30 s. kultur homogenatet kvantitativt som beskrevet i trin 1.3.
    Bemærk: Andre homogenizers kan kræve forskellige indstillinger.
  4. Tilfældigt vælge flere embryoner på efterfølgende dage efter injektion for kvantitative kultur efter trin 5.3.

6. Fluorescens mikroskopi af infektion Progression og provokeret celle Infiltration i zebrafisk embryoner

  1. Anaesthetize af embryoner, som beskrevet i trin 4.2. Der afpipetteres 500 µL af en PBS - 2% (wt) methyl cellulose løsning i en petriskål, som indeholder E3 medium med 0,02% (w/v) Tricaine. Placer embryoner i methyl cellulose løsning og holde dem lige og vandret.
    Bemærk: Methyl cellulose løsning bruges som en "lim", som på grund af sine viskositet, midlertidigt kan immobilisere embryoner i bedste orientering til billedbehandling.
  2. Brug en stereo fluorescens mikroskop udstyret med lyse felt, mCherry, grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis) og UV-filtre til billede individuelt embryoner under identiske optimerede indstillinger (f.eks., intensitet, gevinst og eksponering tid) på 160 x forstørrelse . Indstille brændplanet at vævsskader forårsaget af injektion er i fokus, bruger filteret lysfelt. Indstille Z-stakken dybde på 10 µm og trin størrelse på 5 µm, som giver mulighed for optagelse af 3 på hinanden følgende billeder.
  3. Billede individuelt embryoner én gang dagligt fra 5 h efter injektion indtil 2 dage efter injektionen. Udelukke døde embryoner (ingen hjerteslag eller embryo delvis nedbrudt) for yderligere imaging og analyse. Vedligeholde embryoner individuelt i E3 mediet i 48-godt plader. Opdater medium dagligt.

7. kvantitativ analyse af fluorescens intensiteten af infektion Progression og provokeret celle Infiltration ved hjælp af objektet Jørgensen projektfil "Zebrafisk-Immunotest"

  1. Download "Zebrafisk-Immunotest" og den detaljerede håndbog fra linket: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, som beskrevet i en tidligere undersøgelse33. Kort sagt, åbne billeder til analyse med "Zebrafisk-Immunotest", der opererer under programmet freeware billede J. I hver indlæst billede, markere manuelt injektionsstedet baseret på den observerede vævsskader af embryoner.
    Bemærk: De markerede websted bruges af "Zebrafisk-Immunotest" som midtpunkt til at opdage fluorescens peak inden for en afstand af 50 µm. Detekterede fluorescens peak bruges derefter som centrum for en standardiseret område (diameter 100 µm) til fluorescens målingen.
  2. Klik på "beregning" i menuen objekt Jørgensen til at køre den fluorescerende måling for flere kanaler, hvis relevant, automatisk til alle billeder. Eksportere data og analyser af passende statistiske metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den nuværende undersøgelse vurderes anvendeligheden af zebrafisk embryoner som en roman hvirveldyr dyremodeller for at undersøge biomateriale-associerede infektion. Mikroinjektion teknik har været almindeligt brugt at tilføre zebrafisk embryoner til at forårsage infektion22,26,27,30,36forskellige bakteriearter. Ved hjælp af den procedure, der er afbildet i figur 1, blev S. aureus alene eller sammen med 10 µm PS mikrokugler (PS10) sprøjtet ind i muskelvævet zebrafisk embryoner i den foreliggende undersøgelse. Intramuskulær injektion af S. aureus forårsaget dosisafhængig infektion i embryoner (figur 2). Doser injiceres var rettet udfordring doser (dag 0 i figur 2). Kun mindre variationer i grupper blev observeret. Embryoner injiceres med høj udfordring doser viste variabel infektion progression på 1 dag og 2 dage efter injektion (figur 2, 6000 og 2000 CFU). Den sprøjtes S. aureus bakterier enten blev udryddet eller havde tilvækst og efterfølgende etableret høje niveauer af infektion i embryoner. Dette er lignende til den rapporterede progression af S. aureus infektion efter intravenøs injektion i zebrafisk embryoner26. Embryoner injiceres med lav udfordring doser af S. aureus ryddet bakterier (figur 2, 600 og 200 CFU). Disse resultater viste, at udfordring dosis af S. aureus kraftigt påvirker deres infektion progression i zebrafisk embryoner.

Co injektion af bakterier og mikrokugler resulterede i højere antal bakterier injiceres end injektion af bakterier kun (data ikke vist). Ved at forberede den bakterielle inokulum for de "Bakterier-only" injektioner på en højere koncentration (ca 1,5 gange højere) end bakterier-mikrokugler suspension, vi var i stand til at overvinde forskellen i antal CFU injiceres. Denne måde, det er muligt at injicere lignende antal bakterier i embryoner i tilstedeværelsen og i mangel af PS10 (dag 0, figur 3). Antallet af mikrokugler pr. injektion varieret. Som et eksempel, i en af vores eksperimenter, halvdelen af embryoner modtaget 1 til 2 mikrokugler pr. injektion (12 ud af 25 embryoner i S. aureus + PS10 gruppe), nogle har modtaget 3 til 4 (8 ud af 25 embryoner), og et par modtaget 5 til 7 mikrokugler (5 ud af 25 em bryos). Sådanne variationer ikke påvirke niveauet af provokeret cellulære svarene, som rapporteret i en tidligere undersøgelse33.

Næste, vi undersøgte, om tilstedeværelsen af mikrokugler har en indvirkning på infektion progression i zebrafisk embryoner udfordret med lave doser af S. aureus. Med henblik herpå injiceres vi ca 600 CFU af S. aureus- mCherry med eller uden PS10. Vi brugte to metoder til at studere infektion progression: a konventionelle kvantitative kultur af de inficerede embryoner efter knusning, og (ii) scoring af mikroskopisk påvisning ("mikroskopiske scoring") af fluorescerende bakterier (S. aureus- mCherry). Vi sammenlignet resultaterne fra disse to metoder. Scoren blev defineret som "ja eller nej" synlighed af fluorescerende bakterier i embryoner, uanset fluorescens-intensiteten. Vores resultater viste, at alle embryoner med mere end 20 CFU af S. aureus- mCherry var positive i mikroskopiske scoring (røde prikker i figur 3). For 600 CFU af S. aureus per embryon syntes tilstedeværelsen af PS10 ikke at betydeligt påvirke infektion progression. På hele tiden point, både hyppigheden af inficeret embryoner (angivet på toppen af figur 3, lav udfordring dosis) og antallet CFU efter knusning ikke var anderledes for embryoner med eller uden PS10 (figur 3, lav udfordring dosis). Dette foreslog, at højere udfordring doser af S. aureus er påkrævet for at studere de potentielle virkninger af biomaterialer på infektion progression i zebrafisk embryoner. Dermed, vi tilført ca 1.000 CFU af S. aureus i tilstedeværelse og fravær af PS10 embryoner. Den mikroskopiske scoring ikke vise forskelle i hyppigheden af de inficerede embryoner med og uden PS10 på ethvert tidspunkt (figur 3, høj udfordring dosis). Den kvantitative kultur, dog viste højere CFU numre hentet fra embryoner i S. aureus + PS10 gruppe end dem, der er hentet fra S. aureus -eneste-gruppen på 2 dage efter injektion (figur 3, høj udfordring dosis).

For at opgøre omfanget af infektion i tilstedeværelsen og i mangel af biomaterialer i zebrafisk embryoner af billedanalyse, vi optaget en række billeder viser infektion progression af S. aureus- mCherry (1.000 CFU pr. embryo) i tilstedeværelse og fravær af PS10 i levende embryoner over tid (figur 4A). Vi har også indspillet provokeret infiltration af Kaede grøn fluorescerende proteiner-udtrykker makrofager i embryoner til at kvantificere immun celle respons (figur 4B). Kaede fluorescerende proteiner kan underkastes farvekonvertering fra grøn til rød under eksponering for UV-lys, afhængigt af eksponeringstid og lysintensitet39. Dog blev sådan farvekonvertering ikke observeret under den eksperimenterende betingelse anvendes i den foreliggende undersøgelse. Fluorescens-intensiteten af de inficerer bakterier samt fra de infiltrating makrofager inden for en standardiseret området omkring injektionsstedet blev målt ved vores ObjectJ projektfilen "Zebrafisk-Immunotest", der opererer inden for billede J." Zebrafisk-Immunotest"definerer et standardiseret område med en diameter på 100 µm (gule cirkler i figur 4) omkring en angivet punkt af injektion. I embryoner omfattede dette område størstedelen af fluorescerende bakterier bosat i nærheden af den injicerede mikrokugler, samt de infiltrating makrofager. Tilstedeværelsen af en biomateriale blev vist sig at påvirke både indledende modtagelighed for infektion og immun celle svar. På 5 h efter injektion var makrofag infiltration i svar til S. aureus kun betydeligt højere end i svar til S. aureus + PS10 (figur 5, makrofag infiltration, 5 hpi). På 1 dag efter indsprøjtning embryoner med PS10 viste signifikant højere niveauer af S. aureus infektion end embryoner uden PS10 (figur 5, infektion progression, 1 dpi). Således, disse kvantitative resultater viste, at kombinationen af fluorescens billede optagelse og ObjectJ-projektfil "Zebrafisk-Immunotest" kan bruges til at kvantificere infektion progression og provokeret immun celle respons i en biomateriale i zebrafisk embryo model. Modellen giver mulighed for vurdering af små forskelle i immun celle svar og niveauer af bakteriel infektion in vivo, og det kræver kun en stereo fluorescens mikroskop (med billede optagelse) og åben adgang "zebrafisk-Immunotest" for evaluering.

Figure 1
Figur 1: skematisk procedure af co injektion af bakterier-mikrokugler suspension i en hale muskel i zebrafisk embryoner. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al.33 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: antal CFU af S. aureus hentet fra zebrafisk embryoner injiceres med inocula, lige fra 6.000 til 200 CFU pr. embryo og vurderet på 0-2 dage efter injektionen. De røde linjer repræsenterer den mediane antal CFU. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Antal CFU og mikroskopiske scoring af mCherry protein-udtrykker S. aureus (S. aureus- mCherry) i zebrafisk embryoner, vurderet på forskellige tidspunkter. Lav udfordring dosis: 600 CFU pr. embryoner; Høj udfordring dosis: 1.000 CFU pr. embryoner; PS10: 10 µm PS mikrokugler; "+", embryoner injiceres med S. aureus- mCherry sammen med PS10; "-", embryoner injiceres med S. aureus- mCherry kun, så uden PS10. Embryoner blev mikroskopisk scorede for fluorescerende bakterier og tilfældigt udvalgt til kvantitative kultur af bakterier efter knusning af embryoner på dag af injektion (dag 0) og på dag 1 og dag 2 efter injektion. Embryoner mikroskopisk scorede positive og negative for fluorescerende bakterier er vist i røde og sorte prikker, henholdsvis. Antallet af mikroskopisk positive-scoring embryoner divideret med det samlede antal embryoner scorede (hyppigheden af inficerede embryoner) ved hvert tidspunkt er angivet øverst på grafen. Forskelle i hyppigheden af inficerede embryoner og antal CFU mellem S. aureus + PS10 og S. aureus kun grupper på hvert tidspunkt blev analyseret af Fisher' nøjagtige test og Mann-Whitney test, henholdsvis. p ≤ 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative billeder optagelse infektion progression af mCherry-udtrykker S. aureus (A, red) i tilstedeværelse og fravær af 10 µm PS mikrokugler (PS10, blå) og provokeret infiltration af Kaede protein-udtrykker makrofager (B, grøn) i embryoner, fra 5 h efter injektion (hpi) til 2 dage efter injektion (dpi). Ikke-behandlet embryoner (NT) blev brugt som kontrol. De gule cirkler (100 µm i diameter) angiver den standardiserede område på injektionsstedet til fluorescens kvantificering ved hjælp af filen ObjectJ projekt "zebrafisk-Immunotest'. De kvantificerede fluorescens af bakterier og af makrofager er afbildet i figur 5. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Fluorescens kvantificering af S. aureus infektion progression og provokeret makrofag infiltration i tilstedeværelse og fravær af 10 µm PS mikrokugler (PS10) i zebrafisk embryoner fra 5 timer efter injektion (hpi) til 2 dage Post injektion (dpi), ved hjælp af ObjectJ projektet fil "Zebrafisk-Immunotest". En standardiseret område på injektionsstedet blev brugt til fluorescens kvantificering (med en diameter på 100 µm, angivet som de gule cirkler i figur 4). Ikke-behandlet embryoner (NT) blev brugt som kontrol. Forskelle mellem hver to grupper på hver gang punkt blev analyseret af Mann-Whitney test, *p ≤ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biomateriale-associerede infektion (BAI) er en alvorlig klinisk komplikation. Forståelsen af patogenesen af BAI in vivo ville give ny indsigt for at forbedre forebyggelse og behandling af BAI. Dog aktuelle eksperimentelle BAI dyremodeller såsom murine modeller er dyre, arbejdskrævende og kræver specialiseret personale uddannet i komplekse kirurgiske teknikker. Disse modeller er derfor ikke egnet til høj overførselshastighed analyse. Da kravene for zebrafisk embryo modeller er mindre komplekse og omkostninger generelt er lavere end for murine modeller, den nuværende undersøgelse vurderet om zebrafisk embryoner kan bruges som en roman hvirveldyr dyremodeller for at undersøge BAI in vivo, supplerer de pattedyr modeller.

For at konfigurere zebrafisk embryo BAI model, udviklede vi en protokol af co injektion af bakterier og mikrokugler baseret på en metode til intramuskulær injektion af mikrokugler i embryoner beskrevet før33. På denne måde er de fleste af bakterierne til stede omkring mikrokugler i embryoner, efterligne de bakterier-biomateriale interaktion, der finder sted under eller kort tid efter implantation af biomaterialer i mennesker/pattedyr.

For at kunne sammenligne infektion progression i tilstedeværelsen og i mangel af mikrokugler i zebrafisk embryoner skal embryoner blive udfordret med lignende indledende antal bakterier med og uden mikrokugler. Men ifølge vores erfaring, co injektion af bakterier-mikrokugler suspension resulterer i flere bakterier bliver indsprøjtet end injektion af "Bakterier-only" suspension. For at løse dette problem, bør være skræddersyet ratio mellem koncentrationen af bakterier i "Bakterier-only" suspensioner (uden mikrokugler) og bakterier-mikrokugler suspensioner. I den foreliggende undersøgelse, koncentrationen af S. aureus i "Bakterier-only" suspension skulle være ca 1,5 gange højere end koncentrationen i bakterier-mikrokugler suspension. Om dette forhold også gælder for andre bakteriearter og andre biomaterialer stadig at blive afprøvet. Bemærk, at injicere lignende antal bakterier, med og uden mikrokugler, bør åbningen af nåle bruges til injektioner af enten suspension være så tæt på ens som muligt.

Flere egenskaber af en biomateriale som form og størrelse spiller en vigtig rolle i fastlæggelsen af dets injektionsydelse og co injektion med bakterier. I nuværende undersøgelse, vi brugte 10 µm polystyren mikrokugler (PS10) som model biomaterialer. Ifølge vores erfaring er Mikrokugler af en størrelse på op til 15 µm injicerbare på 3 dage gamle embryoner efter protokollen udviklet i den nuværende undersøgelse33. For Mikrokugler af en forholdsvis stor størrelse (f.eks., ≥ 10 µm), vi fraråde brugen af ikke-monodispersed eller uregelmæssigt formet mikrokugler/mikropartikler, som har tendens til at forårsage tilstopning af nålen. Hvis biomaterialer i andre former end runde og i forskellige størrelser er valgt at bruges, skal deres injektionsydelse afprøves. Til (Sam-) injektion af mikrokugler og bakterier brugte vi en 4% polyvinylpyrrolidon (PVP) løsning til at lette spredning. Dette kan være nyttigt for injektion af biomaterialer med og uden bakterier i embryoner i almindelighed.

Som det var tilfældet for injektioner af mikrokugler kun33,40, varierede antallet af mikrokugler injiceres sammen med bakterier i embryoner pr. injektion, for det meste lige fra 1 til 4 mikrokugler per embryon. Men da sådanne variationer ikke resulterede i forskelle i niveauer af provokeret immun celle respons i embryoner33, de var også forventes ikke at påvirke de potentielle virkninger af mikrokugler på infektion progression. Dog ville ønske nye strategier giver injektioner af en enkelt microsphere (alene eller sammen med bakterier).

Vi vurderet om mikroskopiske scoring af tilstedeværelsen af fluorescerende bakterier kan bruges som en "ja eller nej" pointsystem til at analysere infektion progression i levende embryoner. Kriteriet om en positiv mikroskopiske score var defineret som tilstedeværelsen af synlige fluorescerende bakterier, uanset fluorescens-intensiteten. I forhold til kvantitative kultur for bakterier, foreslog vores repræsentative resultater at mikroskopiske scoring kan skelne embryoner med 20 eller flere CFU af S. aureus bakterier fra embryoner med et lavere antal CFU eller ingen infektion. Således, da kun lavt antal bakterier er nødvendige for en positiv score, denne metode er næsten så følsomme områder som kvantitative kultur. Da embryonerne skal ikke ofres og ingen avancerede mikroskoper eller sorterings systemer til fluorescens er forpligtet til at udføre analyser ved hjælp af denne metode, overveje vi mikroskopiske scoring en enkel, men pålidelig metode til at overvåge infektion progression af bakterier i levende embryoner. Til kvantitativ analyse af niveauet for infektion (snarere end "ja eller nej" pointsystemet som beskrevet ovenfor) og immun celle respons i enkelt levende embryoner anvendte vi ObjectJ-projektfil "Zebrafisk-Immunotest" til at kvantificere fluorescens intensiteten af fluorescerende bakterier og fluorescerende makrofager registreres over tid. Vi brugte en standardiseret område (med en diameter på 100 m) omkring injektionsstedet til at måle fluorescens, da dette område blev vist at indeholde et flertal af bakterierne og infiltrating makrofager. En detaljeret manual for "Zebrafisk-Immunotest" blev offentliggjort tidligere33,40. Af note er "Zebrafisk-Immunotest" en åben adgang plug-in for ImageJ, der kan tilpasses af brugeren. For eksempel, kan diameteren af området i analyse og andre parametre i "Zebrafisk-Immunotest" ændres frit efter opsætningen undersøgelse (se eksempler i linket angivet i trin 7 i protokollen).

For at vise de mulige infektion-styrke effekter af biomaterialer i zebrafisk embryoner, skal udfordring dosis af bakterier vurderes. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at en udfordring dosis af 1.000 CFU af S. aureus pr. embryo eller højere er påkrævet. Højere niveauer af S. aureus infektion i embryoner med PS10 end i dem uden PS10 blev fundet på de første 2 dage efter injektionen, der angiver, at tilstedeværelsen af biomaterialer forbigående letter udvækst af S. aureus i embryonerne. Om infektion forbliver på et højt niveau i tilstedeværelse af biomaterialer på senere tidspunkter bør undersøges bruge ældre embryoner under etisk godkendelse efter gældende regler. Da clearance af S. aureus i zebrafisk embryoner er primært afhængig af fagocytose og drab af makrofager og neutrofiler23,24, udkommet af bakterier kan forklares ved en reduceret effektiviteten af de fagocytter at dræbe bakterier på grund af tilstedeværelsen af biomaterialer. Dette er i overensstemmelse med den velkendte smitterisiko forbedring af biomaterialer i patienter2,4,15, også almindeligt observeret i mere komplekse dyremodeller såsom mus og andre dyremodeller10 ,11,12,13. Ud over S. aureus infektion, kan smitte progression af S. epidermidis eller andre patogener i overværelse af biomaterialer undersøges efter den protokol, der er beskrevet i den nuværende undersøgelse. Med udgangspunkt i biomaterialer kan flere materialeegenskaber (f.eks., kemiske sammensætning, hydrophobicity, ruhed og overfladeladninger) påvirke cellulære svar og/eller bakterier-materiale interaktion41, 42. vores tidligere undersøgelse har vist, at injektion af en biomateriale (i nærværelse af PVP) fremkaldte en stærkere makrofag infiltration i forhold til injektion af kun PVP i zebrafisk embryoner. Desuden zebrafisk embryoner reagerede forskelligt til Mikrokugler af poly (-caprolactone) og polystyren33. Derfor, injektion af Mikrokugler af forskellig karakter kan også have differentieret effekter på forbedring af infektion, som forholdsvis nemt kan vurderes ved metoden beskrevet her.

For yderligere udvikling, kan denne zebrafisk embryo BAI model ændres til en høj overførselshastighed system byder automatiseret robot injektion27,43, komplekse objekt parametrisk analyse og sortering (COPAS) systemer og høj produktivitet RNA sekvens analyse27,44. Sådanne zebrafisk embryo-baserede høj overførselshastighed BAI modeller kan anvendes som hele animalsk systemer for i vivo screening og testning af (Roman) antiinfektiøs biomaterialer samt afprøvning af effekten af behandling med antibiotika eller andre anti-BAI strategier. Intracellulære overlevelse er desuden en større strategi for bakterier at overleve ved tilstedeværelse af biomaterialer9,10,11,12,13. Nytten af zebrafisk embryoner for at studere intracellulære infektion har været vist i flere undersøgelser36,46. Således, vores embryo model kan bruges til at studere den intracellulære overlevelse af stafylokokker eller andre intracellulære patogener biomaterialer og strategier til at behandle sådanne intracellulære infektioner. Derudover kan in situ hybridisering teknikker45 bruges i modellen til at studere påvirkning af bakterier eller biomaterialer eller deres kombination på udtryk for bestemte gener på injektionsstedet, som kan være nyttige til at opdage markørgener for BAI.

Sammenfattende viser den nuværende undersøgelse potentialet i zebrafisk embryoner med de metoder, der er udviklet her for at studere biomateriale-associerede infektion i real time in vivo. Denne zebrafisk embryo model kan derfor bruges til at undersøge roman infektion-resistente biomaterialer og lovende forebyggelse og behandling strategier af BAI og at lukke kløften mellem in vitro undersøgelser og større dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev økonomisk støttet af biomedicinske materiale (BMM) programmet IBIZA projekt og medfi nansieret af den hollandske økonomiministerium. Forfatterne vil gerne takke Prof. Dr. Graham Lieschke fra Monash Universitet i Australien for at give zebrafisk transgene linje (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic soya agar BD Difco 236950 Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth BD Difco 211825
Polyvinylpyrrolidone40 Applichem A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) Life technology/ThemoFisher F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) Harvard Apparatus 30-0038
Micropipette puller instrument Sutter Instrument Inc Flaming p-97
Light microscope LM 20 Leica MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine) Sigma-Aldrich E10521-50G
Agarose MP Roche 11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80 Leica MDG3610450126
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand World Precision Instruments 00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector Eppendorf 5248ZO100329
Microtrube 2 mL pp Sarstedt 72.693.005
Zirconia beads Bio-connect 11079124ZX
MagNA lyser Roche 41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) Biomerieux 43671 Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich MO512-250G
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth) New Brunswick Scientific G10
Zebrafish incubator VWR Incu-line
Cuvettes BRAND 759015
Centrifuge Hettich-Zentrifugen ROTANTA 460R
Spectrometer Pharmacia biotech Ultrospec®2000
Forceps Sigma-Aldrich F6521-1EA
48 well-plates Greiner bio-one 677180
96 well-plates Greiner bio-one 655161
Petri dish Falcon 353003
Petri dish Biomerieux NL-132
ImageJ Not applicable Not applicable link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0 Prism Not applicable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
  2. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
  3. Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
  4. Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
  5. Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
  6. Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
  7. Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
  8. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
  9. Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
  10. Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
  11. Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
  12. Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
  13. Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
  14. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
  15. Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
  16. Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
  17. Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
  18. Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
  19. Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
  20. Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
  21. van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
  22. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
  23. Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
  24. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
  25. Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
  27. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  28. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
  29. Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
  30. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  31. Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
  32. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
  33. Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
  34. Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
  35. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  36. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
  37. Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
  38. Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
  39. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
  40. Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
  41. Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
  42. Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
  43. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
  44. Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
  45. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
  46. Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 143 zebrafisk embryoner biomateriale-associerede infektion Staphylococcus aureus polymere mikrokugler i vivo visualisering intravital analyse fluorescens kvantificering
Zebrafisk Embryo Model for In Vivo visualisering og Intravital analyse af biomateriale-associerede <em>Staphylococcus aureus</em> infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., de Boer, L., Stockhammer, … More

Zhang, X., de Boer, L., Stockhammer, O. W., Grijpma, D. W., Spaink, H. P., Zaat, S. A. J. A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (143), e58523, doi:10.3791/58523 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter