La présente étude décrit un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection associée aux biomatériaux au fil du temps basée sur la microscopie de fluorescence. Ce modèle est un système prometteur en complément des modèles animaux mammifères tels que les modèles de souris pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.
Infection associée aux biomatériaux (BAI) est des principales causes de l’échec de biomatériaux/appareils médicaux. Staphylococcus aureus est l’un des principaux pathogènes en BAI. Cours expérimentales animales mammifères de BAI modèles tels que les modèles murins sont coûteuses et chronophages et donc pas adapté à l’analyse à haut débit. Ainsi, les nouveaux modèles animaux comme des systèmes complémentaires pour enquêter sur les BAI in vivo sont souhaitées. Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection bactérienne en présence de biomatériaux basés sur la microscopie de fluorescence. En outre, la réponse provoquée macrophage a été étudiée. À cette fin, nous avons utilisé fluorescent protéine exprimant S. aureus et embryons de poisson-zèbre transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les macrophages et mis au point une procédure pour injecter des bactéries, seuls ou avec des microsphères dans le muscle tissus d’embryons. Pour suivre l’évolution de l’infection bactérienne chez les embryons vivants au fil du temps, nous avons conçu une méthode simple mais fiable de la notation microscopique de bactéries fluorescentes. Les résultats de marquer microscopiques ont montré que tous les embryons avec plus de 20 unités formant colonie (UFC) de bactéries a donné un signal positif fluorescent de bactéries. Afin d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur infection, nous avons déterminé le nombre d’UFC de S. aureus avec et sans des microsphères de polystyrène 10 µm (PS10) comme les biomatériaux de modèle chez les embryons. En outre, nous avons utilisé le fichier de projet ObjectJ « Poisson-zèbre-Immunotest » opérant dans ImageJ pour quantifier l’intensité de la fluorescence de l’infection à Staphylococcus aureus avec et sans PS10 au fil du temps. Les résultats de ces deux méthodes ont montré un nombre plus élevé de S. aureus dans des embryons infectés avec microsphères que chez les embryons sans microsphères, indiquant une susceptibilité accrue d’infection en présence de ce biomatériau. Ainsi, cette étude montre le potentiel du modèle embryon de poisson zèbre pour étudier BAI avec les méthodes développées ici.
Une variété de dispositifs médicaux (dénommé « biomatériaux ») sont plus utilisés dans la médecine moderne à restaurer ou remplacer des parties de corps humain1. Toutefois, l’implantation des biomatériaux prédispose un patient à l’infection, appelée une infection associée aux biomatériaux (BAI), qui est une complication majeure des implants en chirurgie. Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis sont deux espèces de bactéries plus répandus responsables de BAI2,3,4,5,6. Implanté à forme de biomatériaux une surface sensible à la formation de biofilm bactérien. En outre, réponse immunitaire locale peut être dérangée par les biomatériaux implantés, causant une efficacité réduite de clairance bactérienne. Le dégagement initial d’infectant des bactéries est effectué principalement par infiltration de neutrophiles, qui ont fortement réduit la capacité bactéricide en présence d’inséré ou un biomatériau7. En outre, macrophages s’infiltrer dans les tissus après que l’afflux initial de neutrophiles vont phagocyter les bactéries restantes, mais ne peuvent pas efficacement les tueront intracellulaire, en raison de dérangé immunitaire de signalisation qui est une conséquence de la présence combinée de le biomatériau et bactéries8. Ainsi, la présence des biomatériaux peut faciliter la survie intracellulaire des bactéries9,10,11,12,13 et biofilm formation sur l’implant biomatériaux,4,14. Par conséquent, BAI peut conduire à l’échec et nécessaire pour le remplacement des biomatériaux implantables, causant une augmentation de la morbidité et de mortalité et d’hospitalisation prolongée avec des coûts supplémentaires2,15.
Un nombre croissant de stratégies anti-BAI est actuellement développés2,16,17. Évaluation in vivo de l’efficacité de ces stratégies dans des modèles animaux pertinents est essentielle. Cependant, les traditionnels modèles animaux expérimentaux de la BAI (p. ex., les modèles de souris, ) sont généralement coûteux, chronophages et donc ne convient pas pour le haut débit test de multiples stratégies18. Développement récent des techniques d’imagerie bio-optique basé sur bioluminescent/fluorescent étiquetage des bactéries et des cellules de l’hôte peut permettre la surveillance continue des interactions de progression et hôte-pathogène-matériel/hôte BAI en simples petits animaux comme les souris18,19,20,21. Cependant, cette technique est relativement complexe et encore à ses balbutiements, et plusieurs questions doivent être traitées pour l’analyse quantitative de BAI18. Par exemple, une dose de provocation élevée est nécessaire pour visualiser la colonisation bactérienne. En outre, la lumière diffusion et adsorption des signaux de bioluminescence/fluorescence dans les tissus des essais chez les mammifères, les animaux doivent être également adressée à18,19,21. Par conséquent, des modèles animaux innovatrice et rentables permettant une visualisation intravitale et analyse quantitative au fil du temps sont des systèmes complémentaires utiles pour l’étude in vivo de BAI.
Poisson-zèbre (embryons) ont servi comme un outil polyvalent in vivo pour disséquer les interactions hôte-pathogène et la pathogenèse de l’infection de plusieurs espèces de bactéries telles que les mycobactéries22, Pseudomonas aeruginosa,23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25et staphylocoques26,27. Des embryons de poisson-zèbre présentent de nombreux avantages tels que la transparence optique, un coût d’entretien relativement faible et la possession d’un système immunitaire très semblable à celui des mammifères28,29. Cela rend les embryons de poisson-zèbre, un organisme modèle très économique, vivant pour intravitale visualisation et l’analyse de la progression de l’infection et hôtes réponses28,29. Pour permettre la visualisation du comportement de la cellule zebrafish in vivo, transgénique lignes avec différents types de cellules immunitaires (par exemple, les, macrophages et les neutrophiles) et même avec des structures subcellulaires fluorescent marqués ont été mis au point28 ,29. En outre, le taux de reproduction élevé du poisson-zèbre offre la possibilité de développer des systèmes de test haut débit avec injection robotique automatisée, quantification de fluorescence automatisé et RNA sequence analysis27, 30.
Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour infection associée aux biomatériaux à l’aide de techniques d’imagerie de fluorescence. À cette fin, nous avons développé une procédure pour injecter des bactéries (Staphylococcus aureus) en présence de microsphères de biomatériau dans le tissu musculaire des embryons de poisson-zèbre. Nous avons utilisé des S. aureus RN4220 exprimant mCherry protéine fluorescente (s. aureus– mCherry), qui a été construite comme ailleurs pour un autre S. aureus souche10,31. La ligne zebrafish transgénique (mpeg1 : SAMU/Kaede) exprimant Kaede protéine fluorescente verte dans les macrophages32 et bleu fluorescent des microsphères de polystyrène ont été utilisés. Dans une étude précédente, nous avons montré qu’une injection intramusculaire de microsphères dans des embryons de poisson-zèbre pour imiter l’implantation biomatériau est faisable33. Quantitativement, analyser la progression de BAI et l’infiltration de cellules associées chez les embryons unique au fil du temps, nous avons utilisé le fichier de projet de « Poisson-zèbre-Immunotest » qui est utilisé dans un « ObjectJ » (un plug-in pour ImageJ) pour quantifier l’intensité de la fluorescence de les bactéries résidant et macrophages infiltrant à proximité du site d’injection de microsphères33. En outre, nous avons déterminé les numéros formant des colonies (UFC) d’unités de bactéries en présence et en absence des microsphères dans les embryons d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur l’infection. Notre étude montre qu’avec les méthodes développées ici, l’embryon de poisson zèbre est un modèle animal vertébré prometteur, roman pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.
Infection associée aux biomatériaux (BAI) est une complication grave de clinique. Une meilleure compréhension de la pathogenèse de BAI in vivo pourrait apporter un nouvel éclairage pour améliorer la prévention et le traitement de BAI. Cependant, actuel BAI des modèles animaux expérimentaux tels que les modèles murins sont coûteuses et fastidieuses et nécessitent un personnel spécialisé formés aux techniques chirurgicales complexes. Par conséquent, ces modèles ne conviennent pas pour analyse à haut débi…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financièrement soutenue par le projet d’IBIZA du programme matériel biomédical (BMM) et cofinancée par le ministère néerlandais des affaires économiques. Les auteurs souhaite remercier Prof. Dr. Graham Lieschke de l’Université Monash en Australie pour fournir la lignée transgénique de poisson-zèbre (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
Cuvettes | BRAND | 759015 | |
Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
Petri-dish | Falcon | 353003 | |
Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |