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Bioengineering

Un modèle d’embryon de poisson zèbre pour In Vivo visualisation et analyse Intravitale du biomatériau associée à Staphylococcus aureus Infection

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58523
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Summary

La présente étude décrit un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection associée aux biomatériaux au fil du temps basée sur la microscopie de fluorescence. Ce modèle est un système prometteur en complément des modèles animaux mammifères tels que les modèles de souris pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.

Abstract

Infection associée aux biomatériaux (BAI) est des principales causes de l’échec de biomatériaux/appareils médicaux. Staphylococcus aureus est l’un des principaux pathogènes en BAI. Cours expérimentales animales mammifères de BAI modèles tels que les modèles murins sont coûteuses et chronophages et donc pas adapté à l’analyse à haut débit. Ainsi, les nouveaux modèles animaux comme des systèmes complémentaires pour enquêter sur les BAI in vivo sont souhaitées. Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection bactérienne en présence de biomatériaux basés sur la microscopie de fluorescence. En outre, la réponse provoquée macrophage a été étudiée. À cette fin, nous avons utilisé fluorescent protéine exprimant S. aureus et embryons de poisson-zèbre transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les macrophages et mis au point une procédure pour injecter des bactéries, seuls ou avec des microsphères dans le muscle tissus d’embryons. Pour suivre l’évolution de l’infection bactérienne chez les embryons vivants au fil du temps, nous avons conçu une méthode simple mais fiable de la notation microscopique de bactéries fluorescentes. Les résultats de marquer microscopiques ont montré que tous les embryons avec plus de 20 unités formant colonie (UFC) de bactéries a donné un signal positif fluorescent de bactéries. Afin d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur infection, nous avons déterminé le nombre d’UFC de S. aureus avec et sans des microsphères de polystyrène 10 µm (PS10) comme les biomatériaux de modèle chez les embryons. En outre, nous avons utilisé le fichier de projet ObjectJ « Poisson-zèbre-Immunotest » opérant dans ImageJ pour quantifier l’intensité de la fluorescence de l’infection à Staphylococcus aureus avec et sans PS10 au fil du temps. Les résultats de ces deux méthodes ont montré un nombre plus élevé de S. aureus dans des embryons infectés avec microsphères que chez les embryons sans microsphères, indiquant une susceptibilité accrue d’infection en présence de ce biomatériau. Ainsi, cette étude montre le potentiel du modèle embryon de poisson zèbre pour étudier BAI avec les méthodes développées ici.

Introduction

Une variété de dispositifs médicaux (dénommé « biomatériaux ») sont plus utilisés dans la médecine moderne à restaurer ou remplacer des parties de corps humain1. Toutefois, l’implantation des biomatériaux prédispose un patient à l’infection, appelée une infection associée aux biomatériaux (BAI), qui est une complication majeure des implants en chirurgie. Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis sont deux espèces de bactéries plus répandus responsables de BAI2,3,4,5,6. Implanté à forme de biomatériaux une surface sensible à la formation de biofilm bactérien. En outre, réponse immunitaire locale peut être dérangée par les biomatériaux implantés, causant une efficacité réduite de clairance bactérienne. Le dégagement initial d’infectant des bactéries est effectué principalement par infiltration de neutrophiles, qui ont fortement réduit la capacité bactéricide en présence d’inséré ou un biomatériau7. En outre, macrophages s’infiltrer dans les tissus après que l’afflux initial de neutrophiles vont phagocyter les bactéries restantes, mais ne peuvent pas efficacement les tueront intracellulaire, en raison de dérangé immunitaire de signalisation qui est une conséquence de la présence combinée de le biomatériau et bactéries8. Ainsi, la présence des biomatériaux peut faciliter la survie intracellulaire des bactéries9,10,11,12,13 et biofilm formation sur l’implant biomatériaux,4,14. Par conséquent, BAI peut conduire à l’échec et nécessaire pour le remplacement des biomatériaux implantables, causant une augmentation de la morbidité et de mortalité et d’hospitalisation prolongée avec des coûts supplémentaires2,15.

Un nombre croissant de stratégies anti-BAI est actuellement développés2,16,17. Évaluation in vivo de l’efficacité de ces stratégies dans des modèles animaux pertinents est essentielle. Cependant, les traditionnels modèles animaux expérimentaux de la BAI (p. ex., les modèles de souris, ) sont généralement coûteux, chronophages et donc ne convient pas pour le haut débit test de multiples stratégies18. Développement récent des techniques d’imagerie bio-optique basé sur bioluminescent/fluorescent étiquetage des bactéries et des cellules de l’hôte peut permettre la surveillance continue des interactions de progression et hôte-pathogène-matériel/hôte BAI en simples petits animaux comme les souris18,19,20,21. Cependant, cette technique est relativement complexe et encore à ses balbutiements, et plusieurs questions doivent être traitées pour l’analyse quantitative de BAI18. Par exemple, une dose de provocation élevée est nécessaire pour visualiser la colonisation bactérienne. En outre, la lumière diffusion et adsorption des signaux de bioluminescence/fluorescence dans les tissus des essais chez les mammifères, les animaux doivent être également adressée à18,19,21. Par conséquent, des modèles animaux innovatrice et rentables permettant une visualisation intravitale et analyse quantitative au fil du temps sont des systèmes complémentaires utiles pour l’étude in vivo de BAI.

Poisson-zèbre (embryons) ont servi comme un outil polyvalent in vivo pour disséquer les interactions hôte-pathogène et la pathogenèse de l’infection de plusieurs espèces de bactéries telles que les mycobactéries22, Pseudomonas aeruginosa,23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25et staphylocoques26,27. Des embryons de poisson-zèbre présentent de nombreux avantages tels que la transparence optique, un coût d’entretien relativement faible et la possession d’un système immunitaire très semblable à celui des mammifères28,29. Cela rend les embryons de poisson-zèbre, un organisme modèle très économique, vivant pour intravitale visualisation et l’analyse de la progression de l’infection et hôtes réponses28,29. Pour permettre la visualisation du comportement de la cellule zebrafish in vivo, transgénique lignes avec différents types de cellules immunitaires (par exemple, les, macrophages et les neutrophiles) et même avec des structures subcellulaires fluorescent marqués ont été mis au point28 ,29. En outre, le taux de reproduction élevé du poisson-zèbre offre la possibilité de développer des systèmes de test haut débit avec injection robotique automatisée, quantification de fluorescence automatisé et RNA sequence analysis27, 30.

Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour infection associée aux biomatériaux à l’aide de techniques d’imagerie de fluorescence. À cette fin, nous avons développé une procédure pour injecter des bactéries (Staphylococcus aureus) en présence de microsphères de biomatériau dans le tissu musculaire des embryons de poisson-zèbre. Nous avons utilisé des S. aureus RN4220 exprimant mCherry protéine fluorescente (s. aureus- mCherry), qui a été construite comme ailleurs pour un autre S. aureus souche10,31. La ligne zebrafish transgénique (mpeg1 : SAMU/Kaede) exprimant Kaede protéine fluorescente verte dans les macrophages32 et bleu fluorescent des microsphères de polystyrène ont été utilisés. Dans une étude précédente, nous avons montré qu’une injection intramusculaire de microsphères dans des embryons de poisson-zèbre pour imiter l’implantation biomatériau est faisable33. Quantitativement, analyser la progression de BAI et l’infiltration de cellules associées chez les embryons unique au fil du temps, nous avons utilisé le fichier de projet de « Poisson-zèbre-Immunotest » qui est utilisé dans un « ObjectJ » (un plug-in pour ImageJ) pour quantifier l’intensité de la fluorescence de les bactéries résidant et macrophages infiltrant à proximité du site d’injection de microsphères33. En outre, nous avons déterminé les numéros formant des colonies (UFC) d’unités de bactéries en présence et en absence des microsphères dans les embryons d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur l’infection. Notre étude montre qu’avec les méthodes développées ici, l’embryon de poisson zèbre est un modèle animal vertébré prometteur, roman pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.

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Protocol

Dans ce protocole, maintenance de poissons zèbres adultes est conforme au règlement de bien-être animal local tel qu’approuvé par le comité local de bien-être animal. Expériences avec des embryons ont été effectuées conformément à la Directive 2010/63/UE.

1. préparation des « Bactéries seulement » et des Suspensions de bactéries-microsphères

Remarque : La souche de S. aureus RN4220 exprimant la protéine fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry) est utilisée. La souche RN4220 de S. aureus est mutée dans la virulence gène régulateur agrA (détendeur de gène accessoire A)34et par conséquent peut-être relativement faible virulence dans le modèle d’embryon de poisson zèbre. Autres souches de S. aureus ou d’autres espèces bactériennes pour BAI peut être utilisé.

  1. Prendre 4 à 5 colonies de S. aureus RN4220 bactéries de culture gélose trypticase soja additionné de 10 chloramphénicol µg/mL et la culture de la bactérie à la phase de croissance moyenne logarithmique dans 10 mL de bouillon trypticase soja additionné de 10 µg/mL chloramphénicol à 37 ° C sous agitation.
    1. Au cours de la culture, diluer 100 µL de la suspension bactérienne dans 900 µL d’une solution saline de stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans une cuvette (largeur de 1 cm) pour une mesure de la densité optique (Do) à 620 nm (do620). La culture des bactéries jusqu'à ce que le do620 atteint 0,4 – 0,8.
      Remarque : Un do620 de 0,1 correspond généralement à 3,0 x 107 UFC/mL S. aureus. Le do620 d’un inoculum de bactéries en phase de croissance logarithmique moyenne se situe entre 0,4 à 0,8. Différentes périodes de culture peuvent être nécessaire pour d’autres espèces et souches de bactéries.
  2. Centrifuger à 3 500 x g pendant 10 min, les bactéries et remettre en suspension les bactéries boulettes dans 1 mL de PBS stérile. Par la suite laver les bactéries avec des temps de 2 PBS stériles et enfin remettre en suspension les bactéries dans 1,1 mL de solution de40 (PVP-40) de polyvinylpyrrolidone de 4 % (p/v) dans du PBS.
  3. Vortex cette suspension bactérienne et diluer 100 µL de la suspension dans 900 µL de PBS stérile dans une cuvette pour la mesure de620 OD. Ajuster la concentration de la suspension bactérienne avec solution40 PVP. Il s’agit de la suspension « Bactéries seulement ».
  4. Biomatériaux peut être librement choisi de mélanger avec une suspension bactérienne. Dans la présente étude, des microsphères commercial polystyrène (PS) (bleu fluorescent, 10 µm) sont utilisés. Pour générer une suspension de bactéries-microsphères, centrifuger les microsphères pdt 1 min à 1 000 x g, température ambiante, jeter le surnageant et remettre en suspension les microsphères dans la suspension « Bactéries seulement » (en solution PVP de40 ).
  5. Afin d’injecter des doses approximativement égales de bactéries en présence et en l’absence des microsphères, la concentration de bactéries-microsphères suspension doit être de deux tiers de la concentration de la suspension « Bactéries seulement » (sans microsphères). Ceci est réalisé en diluant la suspension de bactéries-microsphères avec 0,5 volume de solution40 PVP. Mélanger les suspensions au vortex. Remarque, ce ratio (deux tiers) a été évalué pour S. aureus. Il est également approprié pour S. epidermidis, mais il est conseillé de vérifier si ce ratio s’applique également aux autres espèces bactériennes et autres formes de biomatériaux (que microsphères) ou de tailles (à 10 µm) à doser.
  6. Vérifier la concentration de la suspension « Bactéries seulement » et les bactéries-microsphères en culture quantitative de dilutions en série 10 fois comme ci-dessous : transférer 100 µL des suspensions pour un 96 puits-plaque et en série diluées par le transfert de 10 µL d’extraits de la suspension en 90 µL de PBS stérile. Plaque double 10 µL d’extraits des suspensions non diluées et diluées sur les plaques de gel d’agarose, incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit, compter les colonies et calculer le nombre de bactéries (unités formant des colonies. CFU).

2. pendant la reproduction, la récolte et l’entretien des embryons de poisson-zèbre

  1. Suivez les procédures générales décrites plus tôt35,36 pour reproduction, exploitation et entretien des embryons de poisson-zèbre, avec les modifications décrites ci-dessous. Traverser une famille de type sauvage Tupfel longue nageoire (TL) poisson zèbre ou poisson-zèbre de la lignée transgénique sélectionnée (ici, Mpeg1 : Kaede) dans un bassin avec un filet ajouté pour induire les femelles adultes de produire des œufs après que le voyant s’allume, puis se séparent des œufs produits adultes.
  2. Recueillir les embryons le lendemain et jeter celles non transparentes qui ne sont pas viables. Gardez environ 60 embryons par boîte de pétri (diamètre 100 mm) à l’E3 moyen37 et incuber à 28 ° C. Retirer les embryons morts et anormales et actualiser le milieu E3 tous les jours.

3. préparation des aiguilles à Injection

  1. Préparer les verre microcapillaire aiguilles pour injection en utilisant un instrument d’extracteur de micropipette. Utilisez les paramètres suivants : chaleur : 772, tirer : 100, vel : temps 200, : 40, gaz : 75.
  2. Briser la pointe de l’aiguille avec une pince à la position où l’aiguille a un diamètre extérieur d’environ 20 µm (pour 10 µm microsphères), à l’aide d’un microscope optique avec une barre d’échelle dans l’oculaire. Évitez les aiguilles avec une ouverture très grande taille, car ils vont compromettre la survie des embryons.
    Remarque : L’ouverture peut être choisie pour être le plus petit ou plus, selon la taille et la forme des biomatériaux à doser. Dans la littérature, des injections avec des aiguilles avec une ouverture d’environ 50 µm ont été signalées à provoquer une diminution significative de la survie embryonnaire38.

4. l’injection de « Bactéries seulement » ou bactéries-microsphères Suspension dans des embryons de poisson-zèbre

  1. Chauffer la solution de gel d’agarose (1 à 1,5 % (wt) en demi-eau) à l’aide d’un four à micro-ondes et la verser dans un plat de pétri de 100 mm. Placer un modèle de moule en plastique sur le dessus de la solution d’agarose dans la boîte de pétri pour créer des empreintes dans le gel d’agarose pour le placement des embryons en bonne position, faciliter les injections. Incuber à température ambiante et enlever le moule lorsque la solution de gel d’agarose est solidifiée.
  2. À fécondation après 3 d, placer les embryons dans un 100 mm boîte de pétri contenant 0,02 % (p/v) d’acide 3-aminobenzoïque (Tricaïne) pour anesthésier les. Après 5 min, transférer les embryons à la plaque de gel d’agarose superposée avec E3 milieu contenant 0,02 % (p/v) Tricaïne et alignez-les dans une orientation d’injection. Pour le Mpeg1 : Kaede lignée transgénique tout d’abord anesthésier dans E3 moyen tricaïne de 0,02 % (p/v) contenant des embryons. Sélectionnez ensuite les embryons exprimant des protéines fluorescentes vertes à l’aide d’un microscope à fluorescence stéréo.
  3. Charger l’aiguille avec environ 10 µL de la suspension « Bactéries seulement » ou des bactéries-microsphères à l’aide d’une pointe de pipette de microloader. Monter l’aiguille sur un micromanipulateur relié à la micro-injecteur. Pour l’injecteur utilisé ici (voir Table des matières), utiliser les paramètres suivants pour les injections de 2 – 3 nL : pression : 300 – 350, contre-pression : 0, temps : 2 ms.
    Remarque : Les réglages pour le micro-injecteur dépendent de l’injecteur utilisé. Paramètres de l’injecteur peuvent devoir être ajustée pour les injections de bactéries mélangés avec des biomatériaux avec d’autres formes ou tailles.
    1. Utiliser des aiguilles avec la même ouverture pour l’injection de la suspension « Bactéries seulement » et la suspension de bactéries-microsphères. Si l’aiguille est cassé ou bouché, toujours changer pour une nouvelle aiguille pour injections de plus loin.
  4. Introduire l’aiguille dans le tissu musculaire des embryons sous un microscope optique (Figure 1), à un angle de 45 à 60 ° entre l’aiguille et le corps des embryons. Régler la position de l’aiguille dans le tissu en le déplaçant doucement en arrière. Injecter les embryons à l’aide d’une pédale reliée à la micro-injecteur.
  5. Après l’injection de bactéries fluorescentes, marquer les embryons pour infection réussie sous un microscope à fluorescence stéréo. Jeter l’embryons a marqué négatif (aucune bactérie fluorescent visible ou pas microsphères fluorescentes visibles). Maintenir les embryons individuellement dans un milieu E3 en plaques de 48 puits. Actualiser le support de tous les jours.

5. broyage des embryons microscopiques marquant et Culture Quantitative des bactéries

  1. Marquer tous les embryons au microscope la présence de bactéries fluorescentes à l’aide d’un microscope à fluorescence stéréo, commençant immédiatement après les injections et sur chaque jour suivant jusqu'à ce que les embryons sont choisis au hasard pour la culture quantitative.
  2. Au hasard choisir quelques embryons vivants d’infectées (5 à 6 dans la présente étude) peu de temps après l’injection et de les transférer individuellement pour microtubes séparés de 2 mL à l’aide d’embouts stériles. Retirez le support, laver les embryons doucement avec du PBS stérile une fois et ajouter 100 µL de PBS stérile.
  3. Ajouter 2 ou 3 perles de zircone stérile (2 mm de diamètre) à chaque flacon et écraser les embryons à l’aide de l’homogénéisateur (voir Table des matières) à 3 500 tr/min pendant 30 s. Culture l’homogénat quantitativement comme indiqué au point 1.3.
    Remarque : Autres homogénéisateurs peuvent nécessiter des paramètres différents.
  4. Choisir au hasard des embryons multiples sur les jours suivants après l’injection pour la culture quantitative selon l’étape 5.3.

6. Fluorecence de la Progression de l’Infection et une Infiltration cellulaire provoquée chez les embryons de poisson-zèbre

  1. Anesthésier les embryons comme indiqué au point 4.2. Pipeter 500 µL de solution PBS - 2 % (wt) méthyl cellulose dans une boîte de pétri contenant le support E3 avec 0,02 % (p/v) Tricaïne. Placez les embryons dans la solution de méthyl cellulose et conservez-les droites et horizontales.
    Remarque : Solution de méthyl cellulose est utilisée comme une « colle », qui, en raison de sa viscosité, peut immobiliser temporairement les embryons dans la meilleure orientation pour l’imagerie.
  2. Utiliser un microscope à fluorescence stéréo équipés de champ lumineux, mCherry, protéine fluorescente verte (GFP) et UV filtres aux embryons individuels image sous paramètres optimisés identiques (p. ex. temps intensité, gain et l’exposition de, ) à un grossissement x 160 . Définir le plan focal tels que les lésions tissulaires dues à l’injection sont mise au point, en utilisant le filtre champ lumineux. Réglez la profondeur Z-pile à 10 µm et pas en taille à 5 µm, ce qui permet pour un enregistrement de 3 images consécutives.
  3. Embryons individuels de image une fois par jour par injection après 5 h jusqu'à 2 jours après injection. Exclure des embryons morts (aucune pulsation ou embryon partiellement dégradé) pour davantage d’imagerie et d’analyse. Maintenir les embryons individuellement dans un milieu E3 en plaques de 48 puits. Actualiser le support de tous les jours.

7. analyse Quantitative de l’intensité de la Fluorescence de la Progression de l’Infection et une Infiltration cellulaire provoquée à l’aide de fichier de projet objet J « Poisson-zèbre-Immunotest »

  1. Télécharger « Poisson-zèbre-Immunotest » et le manuel détaillé du lien : < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, tel que décrit dans une précédente étude33. En bref, ouvrir des images pour l’analyse « Poisson-zèbre-Immunotest », fonctionnant sous le logiciel freeware Image J. Dans chaque image chargée, marquer manuellement le point d’injection basée sur les dégâts observés tissus d’embryons.
    Remarque : Le site marqué est utilisé par « Poisson-zèbre-Immunotest » comme point central pour détecter le pic de fluorescence à une distance de 50 µm. Le pic de la fluorescence détectée sert ensuite comme le centre d’une zone standard (diamètre de 100 µm) pour la mesure de la fluorescence.
  2. Cliquez sur « calcul » dans le menu objet J d’exécuter la mesure fluorescente pour plusieurs canaux, le cas échéant, automatiquement pour toutes les images. Exporter les données et les analyser par des méthodes de test statistique approprié.

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Representative Results

La présente étude a évalué l’applicabilité des embryons de poisson-zèbre comme un nouveau modèle animal vertébré pour enquêter sur les infections associées aux biomatériaux. Technique de microinjection a été couramment utilisé pour injecter différentes espèces bactériennes dans des embryons de poisson-zèbre pour causer une infection22,26,27,30,36. En utilisant la procédure décrite à la Figure 1, S. aureus seul ou avec des microsphères de PS 10 µm (PS10) ont été injectés dans les tissus musculaires des embryons de poisson-zèbre dans la présente étude. Injection intramusculaire de S. aureus causé infection liée à la dose chez les embryons (Figure 2). Les doses injectées étaient proches des destinée des doses (jour 0 dans la Figure 2). On a observé seulement des variations mineures au sein des groupes. Embryons injectés avec des doses élevées ont montré la progression de l’infection variable à 1 jour et 2 jours après l’injection (Figure 2, UFC 6000 et 2000). L’injection de bactéries Staphylococcus aureus soit ont été éliminés ou avaient proliféré et par la suite établi des niveaux élevés d’infection dans les embryons. Ceci est similaire à la progression déclarée d’infection à Staphylococcus aureus après une injection intraveineuse à des embryons de poisson-zèbre26. Embryons injectés avec des doses faibles de S. aureus effacé les bactéries (Figure 2, 600 et 200 CFU). Ces résultats indiquent que la dose déclenchante de S. aureus influe fortement sur leur progression de l’infection chez les embryons de poisson-zèbre.

Coinjection de bactéries et de microsphères a abouti à un nombre plus élevé de bactéries injectés que l’injection de bactéries seulement (données non présentées). Par la préparation de l’inoculum bactérien pour les injections de « Bactéries seulement » à une concentration plus élevée (environ 1,5 fois plus élevée) que la suspension de bactéries-microsphères, nous étions en mesure de surmonter la différence en nombre d’UFC injectée. De cette façon, il est possible d’injecter une quantité semblable de bactéries dans des embryons en présence et en l’absence du PS10 (jour 0, Figure 3). Les numéros des microsphères par injection a varié. À titre d’exemple, dans l’une de nos expériences, la moitié des reçue de microsphères 1 à 2 embryons par injection (12 des 25 embryons dans le S. aureus + groupe10 PS), certains ont reçu 3 ou 4 (8 sur 25 embryons) et des microsphères de 5 à 7 a reçu quelques (5 sur 25 em bryos). Toutefois, ces variations n’influencent pas les niveaux des réponses cellulaires provoquées, comme indiqué dans une précédente étude33.

Ensuite, nous avons examiné si la présence des microsphères a un impact sur la progression de l’infection chez les embryons de poisson-zèbre a contesté avec de faibles doses de S. aureus. À cette fin, nous avons injecté environ 600 UFC de S. aureus- mCherry avec ou sans PS10. Nous avons utilisé deux méthodes pour étudier la progression de l’infection : (i) les formes conventionnelles de culture quantitative des embryons infectés après l’écrasement et (ii) notation de détection microscopique ("notation microscopiques ») des bactéries fluorescentes (S. aureus- mCherry). Nous avons comparé les résultats de ces deux méthodes. Le score a été défini comme « oui ou non » visibilité des bactéries fluorescentes dans les embryons, quel que soit l’intensité de la fluorescence. Nos résultats ont montré que tous les embryons avec plus de 20 UFC de S. aureus- mCherry étaient positifs pour les microscopiques points (points rouges sur la Figure 3). Pour 600 UFC S. aureus par embryon, la présence du PS10 ne semblait ne pas une influence significative sur la progression de l’infection. À tous les temps infectés de points, les deux la fréquence des embryons (indiqués sur la Figure 3, dose de provocation bas) et le nombre d’UFC après broyage n’était pas différent pour les embryons avec ou sans PS10 (Figure 3, dose déclenchante faible). Cela suggère que des doses plus élevées de S. aureus sont nécessaires pour étudier les effets potentiels des biomatériaux sur la progression de l’infection chez les embryons de poisson-zèbre. Par conséquent, nous avons injecté environ 1 000 UFC de S. aureus en présence et en absence de PS10 dans des embryons. La notation microscopiques ne montre pas de différences dans la fréquence des embryons infectés avec et sans PS10 à n’importe quel point du temps (Figure 3, dose déclenchante élevé). La culture quantitative, cependant, ont montré un nombre plus élevé d’UFC provient des embryons dans le S. aureus + groupe10 PS que ceux provient le S. aureus -seul le groupe après l’injection 2 jours (Figure 3, haute dose de défi).

Afin de quantifier l’ampleur de l’infection en présence et en l’absence des biomatériaux dans des embryons de poisson-zèbre par analyse d’image, nous avons enregistré une série d’images montrant la progression de l’infection de S. aureus- mCherry (1 000 UFC / embryon) en présence et absence de10 embryons vivants au fil du temps (Figure 4 a). Aussi, nous avons enregistré l’infiltration provoquée de Kaede vert fluorescent protéine exprimant macrophages chez les embryons de quantifier la réponse immunitaire cellulaire (Figure 4 b). Protéine fluorescente Kaede peut-être subir une conversion des couleurs du vert au rouge sous exposition aux UV, selon la durée d’exposition et de l’intensité lumineuse39. Toutefois, cette conversion de couleur n’a pas été observée dans les conditions expérimentales utilisées dans la présente étude. L’intensité de la fluorescence des bactéries infectant ainsi dès les macrophages infiltrantes dans une zone normalisé autour du site d’injection a été mesurée par notre fichier de projet ObjectJ « Poisson-zèbre-Immunotest », opérant au sein de l’Image J. » Poisson-zèbre-Immunotest » définit une aire normalisée avec un diamètre de 100 µm (cercles jaunes dans la Figure 4) autour d’un point indiqué d’injection. Chez les embryons, ce domaine comprenait la majorité des bactéries fluorescentes qui résident à proximité des microsphères injectées, ainsi que les macrophages infiltrantes. La présence d’un biomatériau a été montrée pour influencer les deux initiales susceptibilité aux maladies infectieuses et immunitaires des lymphocytes. Après l’injection 5 h, infiltration de macrophages en réponse à S. aureus seulement était significativement plus élevée en réponse à S. aureus + PS10 (Figure 5, infiltration de macrophages, 5 hpi). 1 jour après l’injection des embryons avec PS10 ont montré des niveaux significativement plus élevées de l’infection à Staphylococcus aureus que les embryons sans PS10 (Figure 5, la progression de l’infection, 1 PPP). Ainsi, ces résultats quantitatifs ont démontré que la combinaison du enregistrement d’images de fluorescence et le fichier de projet ObjectJ « Poisson-zèbre-Immunotest » peut être utilisée pour quantifier la progression de l’infection et provoque la réaction des cellules immunitaires en présence d’un biomatériau dans le modèle d’embryon de poisson zèbre. Le modèle permet d’évaluer de petites différences dans les réponses des cellules immunitaires et les niveaux d’infection bactérienne in vivo, et il nécessite seulement un microscope à fluorescence stéréo (avec enregistrement d’images) et l’accès libre « poisson-zèbre-Immunotest » pour l’évaluation.

Figure 1
Figure 1 : schéma procédure de coinjection de bactéries-microsphères suspension dans le muscle de la queue des embryons de poissons zèbres. Ce chiffre a été modifié par Zhang Al.33 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : nombre d’UFC de S. aureus provient des embryons de poisson-zèbre injectés avec des inoculums, allant de 6 000 à 200 UFC / embryon et évaluée à 0 à 2 jours post injection. Les lignes rouges représentent le nombre médian d’UFC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Nombre d’UFC et notation microscopiques de mCherry protéine exprimant Staphylococcus aureus (S. aureus- mCherry) dans des embryons de poisson-zèbre, évaluées à différents moments. Dose de provocation bas : 600 UFC / embryon ; Dose de défi élevé : 1 000 UFC / embryon ; PS10: 10 µm PS microsphères ; « + », embryons injectés avec S. aureus- mCherry avec PS10; «- », embryons injectés avec S. aureus- mCherry seulement, donc sans PS10. Embryons étaient au microscope a marqué pour les bactéries fluorescentes et choisis au hasard pour la culture quantitative de bactéries après broyage des embryons au jour de l’injection (jour 0) et 1 jour et 2 jours après l’injection. Les embryons au microscope a marqué positif et le négatif pour les bactéries fluorescentes apparaissent en des points rouges et noirs, respectivement. Les numéros de cotation au microscope positif divisés par le nombre total d’embryons a marqué (fréquence d’embryons infectés) à chaque instant des embryons sont indiqués en haut du graphique. Différences dans les fréquences d’embryons infectés et en nombre d’UFC le S. aureus + PS10 et S. aureus seuls groupes à chaque point dans le temps ont été analysés par le pêcheur « exact test et le test de Mann-Whitney, respectivement. p ≤ 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Les images représentatives enregistrer la progression de l’infection d’exprimant le mCherry S. aureus (un, rouge) en présence et absence de 10 µm PS microsphères (PS10, bleu) et l’infiltration provoquée de Kaede protéine exprimant macrophages (B, vert) dans les embryons à partir de 5 h après l’injection (hpi) à 2 jours après l’injection (dpi). Les embryons non traitées (NT) ont été utilisés comme témoins. Les cercles jaunes (100 µm de diamètre) indiquent la surface normalisée au site d’injection pour la quantification de fluorescence en utilisant le fichier de projet ObjectJ « poisson-zèbre-Immunotest'. La fluorescence quantifiée des bactéries et des macrophages est représentée à la Figure 5. Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Quantification de Fluorescence de la progression de l’infection de S. aureus et l’infiltration de macrophages provoquée en présence et en absence de 10 µm PS microsphères (PS10) dans des embryons de poisson-zèbre de 5 heures après l’injection (hpi) à 2 jours après l’injection (dpi), avec le projet ObjectJ du fichier « Poisson-zèbre-Immunotest ». Un domaine normalisé au point d’injection a été utilisé pour la quantification de la fluorescence (d’un diamètre de 100 µm, indiqué comme les cercles jaunes dans la Figure 4). Les embryons non traitées (NT) ont été utilisés comme témoins. Différences entre chaque deux groupes chaque fois point ont été analysés par la Mann-Whitney tester, *p ≤ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Infection associée aux biomatériaux (BAI) est une complication grave de clinique. Une meilleure compréhension de la pathogenèse de BAI in vivo pourrait apporter un nouvel éclairage pour améliorer la prévention et le traitement de BAI. Cependant, actuel BAI des modèles animaux expérimentaux tels que les modèles murins sont coûteuses et fastidieuses et nécessitent un personnel spécialisé formés aux techniques chirurgicales complexes. Par conséquent, ces modèles ne conviennent pas pour analyse à haut débit. Étant donné que les exigences pour les modèles embryon de poisson zèbre sont moins complexes et les coûts sont en général inférieurs à ceux des modèles murins, la présente étude a évalué si les embryons de poisson-zèbre est utilisable comme un nouveau modèle animal vertébré pour enquêter sur les BAI in vivo, complémentaire à les modèles chez les mammifères.

Pour configurer le modèle BAI d’embryon de poisson zèbre, nous avons développé un protocole de coinjection de bactéries et de microsphères basés sur une méthode pour une injection intramusculaire de microsphères aux embryons décrits avant33. De cette façon, la plupart des bactéries sont présente dans les environs les microsphères dans les embryons, imitant l’interaction bactérie-biomatériau qui se déroule pendant ou peu après l’implantation des biomatériaux chez les êtres humains/mammifères.

Pour être en mesure de comparer la progression de l’infection en présence et en l’absence des microsphères dans des embryons de poisson-zèbre, devraient faire l’objet des embryons avec un nombre initial similaire de bactéries avec et sans des microsphères. Toutefois, selon notre expérience, coinjection de bactéries-microsphères suspension entraîne plus de bactéries que l’injection de suspension « Bactéries seulement » en train d’injecter. Pour résoudre ce problème, le rapport entre la concentration de bactéries dans les suspensions « Bactéries seulement » (sans les microsphères) et dans les bactéries-microsphères suspensions devrait être adapté. Dans la présente étude, la concentration de S. aureus dans la suspension « Bactéries seulement » devait être environ 1,5 fois supérieure à la concentration dans la suspension de bactéries-microsphères. Si ce ratio s’applique également aux autres espèces de bactéries et autres biomatériaux reste à tester. De la note, d’injecter une quantité semblable de bactéries avec et sans des microsphères, l’ouverture des aiguilles utilisées pour les injections de chaque suspension devrait être aussi près identiques que possible.

Plusieurs propriétés d’un biomatériau tels que la forme et la taille jouent un rôle important en déterminant son injectabilité et coinjection avec des bactéries. Dans la présente étude, nous avons utilisé 10 µm des microsphères de polystyrène (PS10) comme les biomatériaux de modèle. Selon notre expérience, les microsphères d’une taille de jusqu'à 15 µm sont injectables pendant 3 jours vieux embryons suivant le protocole mis au point dans la présente étude33. Des microsphères d’une taille relativement importante (p. ex., ≥ 10 µm), nous vous déconseillons l’utilisation de non-monodisperses ou irrégulière des microsphères/microparticules qui ont tendance à causer de colmatage de l’aiguille. Si les biomatériaux en autres formes plus rondes et en différentes tailles est choisis pour être utilisés, leur injectabilité doit être testée. (Co-) injection de microsphères et bactéries, nous avons utilisé une solution de polyvinylpyrrolidone (PVP) de 4 % pour faciliter la dispersion. Cela peut être utile pour l’injection des biomatériaux avec et sans bactéries dans des embryons en général.

Comme ce fut le cas pour les injections de microsphères seulement33,40, les numéros des microsphères injectés avec des bactéries dans des embryons varient par injection, pour la plupart allant de 1 à 4 microsphères par embryon. Toutefois, étant donné les différences de niveau de la réponse des cellules immunitaires provoquée chez les embryons33n’a pas entraîné de telles variations, aussi ne devaient influencer les effets potentiels des microsphères sur la progression de l’infection. Néanmoins, les nouvelles approches permettant des injections d’une microsphère seul (seul ou avec bactéries) auraient désirer.

Nous avons évalué si marquant microscopiques de la présence de bactéries fluorescentes peut être utilisé comme un « oui ou non » système de notation pour analyser la progression de l’infection chez les embryons vivants. Le critère d’une vingtaine de microscopique positif a été défini comme la présence de bactéries fluorescentes visibles, quelle que soit l’intensité de la fluorescence. Par rapport à la culture quantitative de bactéries, nos résultats représentatifs a suggéré que marquant microscopique peut distinguer des embryons avec UFC 20 ou plus de bactéries Staphylococcus aureus d’embryons avec un nombre plus faible de l’UFC ou aucune infection. Ainsi, seuls de faibles effectifs de bactéries étant requis pour une note positive, cette méthode est presque aussi sensible que la culture quantitative. Étant donné que les embryons n’ont pas besoin d’être sacrifié, et aucune des microscopes haut de gamme ou des systèmes de tri pour la fluorescence ne sont tenus d’effectuer des analyses à l’aide de cette méthode, nous considérons microscopiques marquant une méthode simple mais fiable pour surveiller la progression de l’infection de bactéries dans les embryons vivants. Pour une analyse quantitative du niveau d’infection (plutôt que le « oui ou non » système de notation comme décrit ci-dessus) et réponse de cellules immunitaires chez des embryons vivants seul, nous avons appliqué le fichier de projet ObjectJ « Poisson-zèbre-Immunotest » pour quantifier l’intensité de la fluorescence de les bactéries fluorescentes et les macrophages fluorescents enregistrement au fil du temps. Nous avons utilisé un domaine normalisé (d’un diamètre de 100 m) qui entourent le site d’injection pour mesurer la fluorescence, étant donné que ce domaine a été montré pour inclure une majorité de la bactérie et les macrophages infiltrantes. Un manuel détaillé de « Poisson-zèbre-Immunotest » a été publié précédemment33,40. À noter, « Poisson-zèbre-Immunotest » est un libre accès plug-in pour ImageJ, qui peut être adaptée par l’utilisateur. Par exemple, le diamètre de la zone d’analyse et d’autres paramètres de « Poisson-zèbre-Immunotest » sont librement modifiables selon le paramétrage de l’étude (voir exemples dans le lien figurant dans l’étape 7 dans le protocole).

Afin de montrer les effets possibles d’infection d’amélioration des biomatériaux dans des embryons de poisson-zèbre, la dose déclenchante de bactéries doit être évaluée. Dans la présente étude, nous avons constaté qu’une dose de provocation de 1 000 UFC de S. aureus par embryon ou supérieur est requise. Niveaux plus élevés d’infection à Staphylococcus aureus dans des embryons avec PS10 que chez ceux sans PS10 furent trouvés sur les 2 premiers jours après l’injection, ce qui indique que la présence des biomatériaux transitoirement facilite l’excroissance de S. aureus chez les embryons. Si infection demeure à des niveaux élevés en présence de biomatériaux aux périodes ultérieures devrait être étudié en utilisant des embryons âgés sous approbation éthique conformément aux réglementations applicables. Étant donné que le jeu de S. aureus dans des embryons de poisson-zèbre est dépendant principalement de la phagocytose et l’assassinat par les macrophages et les neutrophiles23,24, l’excroissance des bactéries peut-être s’expliquer par une efficacité réduite de la phagocytes pour tuer les bactéries en raison de la présence des biomatériaux. Cela est conforme à l’amélioration de la bien connue-risque d’infection de biomatériaux dans les patients2,4,15, aussi couramment observée dans des modèles animaux plus complexes tels que les souris et autres modèles animaux10 ,11,12,13. En plus de l’infection à Staphylococcus aureus , la progression de l’infection de S. epidermidis ou autres agents pathogènes en présence de biomatériaux peut être étudiée en suivant le protocole décrit dans la présente étude. Du point de biomatériaux, plusieurs propriétés du matériau (par exemple, composition chimique, hydrophobie, rugosité et charges de surface) peuvent influencer les réponses cellulaires et/ou l’interaction bactérie-matériel41, 42. notre étude antérieure a montré que l’injection d’un biomatériau (en présence de PVP) a provoqué une infiltration de macrophages plus forte par rapport à l’injection de seulement PVP dans des embryons de poisson-zèbre. En outre, des embryons de poisson-zèbre ont réagi différemment à des microsphères de poly (-caprolactone) et polystyrène33. Par conséquent, injection de microsphères de nature différente peut aussi ont des effets différents sur l’amélioration de l’infection, qui peut être relativement facilement évaluée selon la méthode décrite ici.

Pour le développement ultérieur, ce modèle BAI d’embryon de poisson zèbre peut être modifié pour un système à haut débit mettant en vedette automatisé injection robotique27,43, analyse paramétrique objet complexe et tri des systèmes (COPAS) et un débit élevé RNA sequence analysis27,44. Ces modèles BAI zebrafish axée sur l’embryon haut débit peuvent servir de systèmes animaux pour in vivo de dépistage et tests des biomatériaux anti-infectieux (roman) ainsi que tester l’efficacité des traitements antibiotiques ou d’autres stratégies anti-BAI. En outre, survie intracellulaire est une stratégie importante de bactéries pour survivre en présence de biomatériaux9,10,11,12,13. L’utilité des embryons de poisson-zèbre pour l’étude de l’infection intracellulaire a été démontrée dans plusieurs études36,46. Ainsi, notre modèle de l’embryon peut servir à étudier la survie intracellulaire de staphylocoques ou autres pathogènes intracellulaires en présence des biomatériaux et des stratégies pour traiter ces infections intracellulaires. En outre, l’hybridation in situ des techniques45 peut être utilisé dans le modèle pour étudier l’influence de bactéries ou de biomatériaux ou de leur combinaison sur l’expression des gènes particuliers au site d’injection, qui peut être utile pour découvrir les gènes marqueurs pour BAI.

En résumé, cette étude montre le potentiel des embryons de poisson-zèbre avec les méthodes développées ici pour étudier l’infection associée aux biomatériaux en temps réel in vivo. Ce modèle d’embryon de poisson zèbre peut donc servir à étudier les nouveaux biomatériaux résistant à l’infection et de prévention prometteuse et de stratégies de traitement de BAI et à combler le fossé entre les études in vitro et des modèles animaux plus gros.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financièrement soutenue par le projet d’IBIZA du programme matériel biomédical (BMM) et cofinancée par le ministère néerlandais des affaires économiques. Les auteurs souhaite remercier Prof. Dr. Graham Lieschke de l’Université Monash en Australie pour fournir la lignée transgénique de poisson-zèbre (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic soya agar BD Difco 236950 Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth BD Difco 211825
Polyvinylpyrrolidone40 Applichem A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) Life technology/ThemoFisher F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) Harvard Apparatus 30-0038
Micropipette puller instrument Sutter Instrument Inc Flaming p-97
Light microscope LM 20 Leica MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine) Sigma-Aldrich E10521-50G
Agarose MP Roche 11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80 Leica MDG3610450126
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand World Precision Instruments 00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector Eppendorf 5248ZO100329
Microtrube 2 mL pp Sarstedt 72.693.005
Zirconia beads Bio-connect 11079124ZX
MagNA lyser Roche 41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) Biomerieux 43671 Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich MO512-250G
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth) New Brunswick Scientific G10
Zebrafish incubator VWR Incu-line
Cuvettes BRAND 759015
Centrifuge Hettich-Zentrifugen ROTANTA 460R
Spectrometer Pharmacia biotech Ultrospec®2000
Forceps Sigma-Aldrich F6521-1EA
48 well-plates Greiner bio-one 677180
96 well-plates Greiner bio-one 655161
Petri dish Falcon 353003
Petri dish Biomerieux NL-132
ImageJ Not applicable Not applicable link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0 Prism Not applicable

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Un modèle d’embryon de poisson zèbre pour In Vivo visualisation et analyse Intravitale du biomatériau associée à <em>Staphylococcus aureus</em> Infection
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