Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التعريفي للابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض وتقييمها بالمنظار ميني في الفئران حية

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/58871
Automatic Translation
1,3, 2, 1,3, 1,3, 1,3
1Department of Internal Medicine 1, University Erlangen-Nürnberg, University Hospital Erlangen, 2Institute of Pathology, Department of Nephropathology, University Hospital Erlangen, 3Deutsches Zentrum Immuntherapie (DZI), University Hospital Erlangen

Summary

نقدم هنا، هو بروتوكول وصف زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم متمكنة ويسمح المتكررة التقييمات ميني المنظار في القولون القاصي في الموقع للوجود والخصائص، وشدة التهاب colonic داخل الحي الفئران التي تعاني من الابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض.

Abstract

الاختلاس – مقابل – المضيف الأمراض الحادة (GvHD) تمثل مضاعفات أشد أن المرضى الذين يتلقون سابقا متمكنة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (الو-HCT) زرع الوجه، وكثيراً ما يرتبط مع التوصل إلى نتائج سريرية فقراء. بعض الوقت، على سبيل المثال، عادة ما تستجيب للعلاجات المناعية القمعية أنشئت GvHD مظاهر الجلد و، ومن ثم عدم اتخاذ مسار فادح، والوجود وكثافة جفهد المعوية، خصوصا من منتصف إلى انخفاض أجزاء من القناة الهضمية، تؤثر بقوة على النتائج وعموما البقاء على قيد الحياة للمرضى الذين يعانون من الخيارات الحادة GvHD. العلاجية تقتصر أساسا على وكلاء المناعي القمعية الكلاسيكية الغلة معتدلة فقط آثار التخفيف من حدة المرض. ومن ثم معرفة مفصلة حول تتالي المقيم في الأنسجة المناعية، والتغيرات في الحجمية المعوية، والاستجابة stromal السابقة، عليها، وبعد ظهور جفهد المعوية هناك حاجة ماسة لفهم الأحداث والآليات التي تقوم عليها، المرضية ووضع الخيارات العلاجية المبتكرة. نماذج مورين من GvHD غالباً ما يلجأ إلى تحديد وتقييم وظيفيا الجزيئات ومسارات قيادة مزعومة GvHD المعوية. ومع ذلك، يعني على وجه الخصوص رصد وتقييم التهاب الأمعاء على مر الزمن تنعدم أساسا منذ عشرات المتبعة لتقييم والصف GvHD الحادة بشكل روتيني تتألف من مختلف المعايير التي تعكس GvHD النظامية بدلاً من ذلك مظاهرة. التقييم التفصيلي ل GvHD المعوية قد قيدت للدراسات باستخدام الفئران euthanized، وبالتالي أساسا باستثناء طولية (أي الحركية) تحليلات لحجرة colonic تحت شرط تجريبي معين (مثلاً، جسم بوساطة الحصار الذي تفرضه سيتوكين proinflammatory) في الفئران حية (أي، في فيفو). التقييم في الموقع ميني المنظار القولون القاصي الو-كليات التقنية العليا-يعامل الفئران الموصوفة هنا يسمح أ) تقييما مفصلاً عيانية لجوانب مختلفة من التهاب الأمعاء وب) الخيار لجمع عينات الأنسجة لتحليلات المصب في نقاط زمنية مختلفة على مدى فترة الملاحظة. إجمالاً، يوفر نهج ميني المنظار تقدما كبيرا في رصد موسع السريري وتقييم جفهد المعوية.

Introduction

المكونة للدم الأورام الخبيثة الناشئة مباشرة عن حجرة الخلايا الجذعية المكونة للدم وغير المنضبط، تتقدم بسرعة، واضطرابات جهاز المناعة بوساطة شديدة غالباً مؤشرات أداء كليات الو1،2. ولكن على الرغم من أن المحاسبة لحدوث استجابة الابتزاز مقابل الورم تشخيصية مفيدة، لمفاوية المانحين كثيرا ما حفز وتعزيز هجوم المناعي بوساطة غير المرغوب فيها من مكونات الأنسجة السليمة داخل المتلقي الو-كليات ، عملية التي تسمى الاختلاس – مقابل – المضيف المرض3. مظاهرة في القناة الهضمية، جفهد المعوية ما يسمى، تمثل المضاعفات الأكثر اللعين من الحادة GvHD، الأشكال الخطيرة التي ترتبط بصورة روتينية مع ارتفاع معدل وفيات1،،من24.

عموما، موريني ونماذج لالو-HCT ظهرت كأدوات لا تقدر بثمن لتحديد ودراسة الآليات المناعية بوساطة الكامنة وراء أمراض ال جفهد5. بيد الحركية من، على سبيل المثال، الآثار المفيدة للتدخلات العلاجية رواية على مر الزمن في الفئران الحية بشكل روتيني يعتمد التقييم على تحديد GvHD السريرية عشرات6. بينما هذه النقاط مناسبة لكي تعكس، على سبيل المثال، عموما عبء المرض (أي، GvHD النظامية)، السريرية عشرات عدم حساسية موثوق بها تعكس المظاهر الخاصة بالجهاز (مثل، في القناة الهضمية). ومن ثم، الاستنتاجات، على سبيل المثال فيما يتعلق بآثار واقية من القناة الهضمية لتدخل علاجي معين، التي تستند إلى هذه التهديف النظم عادة ما تقع قصيرة.

وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير من خلال اختراع رواية كامل الجسم التصوير طرائق في تركيبة مع الاستخدام أما الماوس الوراثية طرحه أو الفلورسنت نماذج7،8، منهجيات لمباشرة، وعلى وجه التحديد تقييم الأمعاء تنعدم مظاهر جفهد في الفئران الحية. ومن ثم فالأساس المنطقي وراء بروتوكول التقييم بالمنظار للنمط الظاهري GvHD المعوية الموصوفة في المقطع التالي للتغلب على هذه العقبة. وعلاوة على ذلك، أن الدافع أيضا خفض إعداد الفئران التجريبية منذ ذلك الحين، وحتى الآن، إجراء تقييم مفصل للخصائص الخلوية والجزيئية المورفولوجية (مثل، بالتشريح المرضى أو البيولوجيا الجزيئية) من GvHD المعوية في نهاية المطاف استلزم مظاهر التضحية بالماوس التجريبية.

قد سبق أن أبلغ مؤسستنا على منهجية التقييم بالمنظار ميني لمظاهر colonic أثناء التهاب القولون سينجينيك نماذج9. في البروتوكول المعروضة هنا، لدينا المكرر وتكييفها كولونوسكوبيك التهديف مصفوفة ليحركها اللوريسبونسي التهاب القولون في الفئران حية مع GvHD المعوية عند زرع اللوريكتيفي لمفاوية كليات التقنية العليا والجهات المانحة في فئة MHC تماما متطابقة الإعداد . وقد حددنا أربعة المعلمات المناسبة تعكس آفات colonic المعوية المتصلة GvHD. وعلاوة على ذلك، أنشأنا نظاما يتيح درجات صقل لأي واحد محدد، أسفر عن نقاط جديدة بسهولة إطلاع القارئ شدة GvHD المعوية الموجودة في ماوس معينة في نقطة زمنية معينة. وأكدت تحاليل نسيجية أن درجة المنظار عتبة معينة هو موثوق التنبؤ بدرجة معتدلة إلى عالية التهاب الأنسجة. ومن ثم، يظهر التقييم بالمنظار ميني لتمثيل بديل عامل للأنسجة معيار الذهب الذي يتطلب التضحية بالفئران التجريبية بشكل روتيني. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول يمكن تطبيقها في أي نقطة زمنية معينة، ويمكن استخدامها مرارا وتكرارا خلال ال10،المرض11. وعلاوة على ذلك، على النقيض من استخدام نهج تعتمد على الإضاءة الحيوية، أية تدابير العمل المكثف وتستغرق وقتاً طويلاً مثل إينتيركروسينج وراثيا تعديل الفئران مطلوبة و، ومن ثم يمكن تطبيق المنهجية على أي خط الماوس الفائدة.

أخذت معا، نظراً لمنظور السريرية تضر مرضى الو-HCT GvHD المعوية الحادة، التقدم العلمي السريع ومزيد من التبصر في الآليات الجزيئية الكامنة وراء أمراض المناعة هناك حاجة ماسة. وبالمثل، تتطلب الاعتبارات الأخلاقية الهامة، وأن كسب المعرفة ينبغي أن يتحقق مع استخدام أقل عدد ممكن من الفئران التجريبية. ومن ثم على حد سواء الاعتراف بالمطالبات في أوساط البحث استكشاف GvHD المعوية يمكن أن يخدمها تنفيذ المسلسل التقييمات ميني المنظار في القولون في سلسلة العمل التجريبي لرصد والصف GvHD المعوية في الماوس التجريبية الحية النماذج، كوصف والمصادق عليها في البروتوكول المعروضة هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الأساليب التجريبية الموصوفة هنا أقرتها حكومة ميتيلفرانكين، بافاريا، ألمانيا.

1-GvHD التعريفي

  1. اليوم 0: تشعيع الجسم الكلي للفئران المستفيدة
    1. استخدام الإناث CD45.2+ H2kd+ بالب/ج الفئران التي على الأقل 10 أسابيع من العمر كمتلقين.
    2. زن وسجل وزن الفئران المستفيدة قبل التعريفي GvHD.
      ملاحظة: ضمان أن المتلقي قد وزن جسم الحد أدنى من 20 غراما. وزن الجسم يبدأ سيكون بمثابة قيمة مرجعية لحساب الوزن من الماوس الفردية GvHD التعريفي والتقدم على مدى.
    3. ضع الفئران يصل إلى خمسة في الحاوية إيرادياتور الأشعة السينية.
    4. تشعيع الفئران تشعيع الجسم الكلي مع جرعة واحدة 8 غراي من الأشعة السينية. استخدام Cs137 كمصدر إشعاع.
  2. يوم 1: إعادة تشكيل الفئران المشععة مع تي-خلية-نضوب نخاع العظام
    ملاحظة:زرع خلايا نخاع العظام متمكنة، الواردة والمفصلة في الباب 1، 2، ينبغي أن تجري خلال 24 ساعة بعد التشعيع. تنفيذ الإجراءات المذكورة أدناه في ثقافة الأنسجة معقمة هود واستخدام الكواشف التي تمت تصفيتها. استخدام متمكنة CD45.1/Ly5.1 B6. سخل-Ptprca Pepcb/الفئران بويكرل كمانحين لخلية T-المنضب نخاع العظام.
    1. Euthanize CD45.1/Ly5.1 B6. سخل الفئران التي ستتبرع بخلايا نخاع العظام متمكنة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، ح 12-24 بعد تشعيع بالب/ج الفئران المستفيدة. ولهذا الغرض، تخدير CD45.1/Ly5.1 B6. سخل الفئران باستنشاق إيسوفلوراني 5%. تواصل مع التعرض إيسوفلوراني أكثر من 1 دقيقة بعد إلقاء القبض في التنفس وتأكيد القتل الرحيم بخلع عنق الرحم.
    2. تطهير الفراء والجلد الماوس تماما مع الإيثانول 70%.
    3. وضع الماوس على بيئة نظيفة تعمل غمد حيث يكون الماوس في موقف معرضة، مع هيندكوارتيرس، تواجه المجرب. رفع الفراء في كعب أخيل مع تلميح الملقط سيمكين بطول 13 سم ونصائح منحنى مسنن. جداً الجلد بين الملقط والكعب مع تصلب 8.5 سم مقص جيد مع نصائح مستقيمة.
    4. تمديد الشق cranially (أي من كعب على الساق والفخذ إلى منطقة الورك السفلي). إزالة الجلد وآلفرو من أطرافهم هند بمساعدة الملقط.
    5. تنفيذ نفس الإجراء على أطرافهم هند الأخرى.
    6. إزالة أطرافه هند بالقطع عن طريق مفاصل الورك المتاخمة.
    7. قص بعيداً الكفوف الخلفي. قطع طريق الركبة. تخزين في الفخذ وساق من كل أطرافهم هند معا في طبق بتري 92 ملم مليئة بالفوسفات مخزنة المحلول الملحي (PBS) على الجليد.
    8. تنظيف عظام الفخذ والساق بعناية عن طريق إزالة أنسجة العضلات قدر ممكن من كل من الفخذ والساق. نقل عظام الفخذ والساق إلى أنبوب 50 مل مليئة بالمتوسط RPMI 1640 العقيمة ومكان على الجليد الرطب حتى عظام الساق والفخذ كافة التي تم جمعها في الخطوة 1.2.7 يتم تنظيفها من أنسجة العضلات.
    9. لعزل نخاع العظام، ونقل عظم الفخذ أو الساق واحدة في وقت واحد (التي تم تنظيفها كما هو موضح في الخطوة 1.2.8) من أنبوب 50 مل إلى طبق بتري (التي يبلغ قطرها ملم 92) مليئة بالمتوسط RPMI 1640. قطع نهايات عظم الفخذ أو الساق مع مشرط للحصول على الوصول إلى تجويف العظام التي تحتوي على نخاع العظم.
    10. إعداد أنبوب جمع 50 مل مع 5 مل متوسط RPMI 1640. أدخل إبرة ز 26 يعلق على 1 مل حقنه مليئة 1 مل متوسط RPMI 1640 في تجويف العظام وتدفق نخاع العظم خارج التجويف في أنبوب جمع عن طريق دفع المكبس.
    11. كرر الخطوة 1.2.10 حتى يظهر العظم خفيفة ولامعة (أي تجويف العظام يخلو من وضوح المحمر نخاع العظام). تجاهل العظام فارغة.
    12. كرر الخطوات 1.2.9-1.2.11، باستخدام جميع عظام الفخذ والساق من الخطوة 1.2.8، وجمع جميع القطع المستردة نخاع العظام في أنبوب جمع 50 مل نفس من الخطوة 1.2.10. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد الرطب حتى تم تجهيز جميع العظام من الخطوة 1.2.8 تبعاً لذلك.
    13. إنشاء تعليق خلية واحدة بهدوء بيبيتينج القطع نخاع العظام متدفق، متفتت صعودا وهبوطاً. تصفية تعليق خلية واحدة نخاع العظام من خلال شاشة مش 40 ميكرومتر خلية مصفاة توضع في أنبوب جمع 50 مل جديدة.
    14. الطرد المركزي جمع 50 مل الأنبوب الذي يحتوي على تعليق خلية واحدة نخاع العظام في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    15. ريسوسبيند بيليه في 5 مل من المخزن المؤقت ACK ليسينج (يدتا مم 1 غ2؛ 10 مم كهكو3؛ 144 مم NH4Cl؛ الرقم الهيدروجيني 7.2) لتحلل خلايا الدم الحمراء. احتضان تعليق خلية لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد ذلك فورا إضافة 10 مل من محلول برنامج تلفزيوني إلى تعليق خلية.
    16. الطرد المركزي من التعليق في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 2 مل من محلول PBS.
    17. عد الخلايا نخاع العظام، باستخدام هيموسيتوميتير. الاحتفاظ قاسمة 6 × 106 خلايا لتحليل التدفق الخلوي لفحص نقاء الخلايا بعد تنقية الخلية (راجع الخطوة 1.2.20).
    18. لاستنزاف خلايا تي من تعليق خلية واحدة نخاع العظام، استخدام أدوات تنقية خلية متوفرة تجارياً. مغناطيسيا استنفاد الخلايا CD90.2+ (أي الخلايا اللمفية) من خلايا نخاع العظام المجموع، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    19. عد الخلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام التي تم عزلها كما هو موضح في الخطوة 1.2.18، باستخدام هيموسيتوميتير. الاحتفاظ قاسمة 1 × 106 خلايا للتدفق الخلوي التحليل التي يتعين القيام بها في وقت لاحق كما هو موضح في الخطوة 1.2.20.
      ملاحظة: خلية في المتوسط العائد المستمدة من إحدى الجهات المانحة الماوس عادة من 2 × 107 3.4 × 107 تي-خلية-نضوب نخاع العظم خلايا.
    20. تأكيد استنفاد تي خلية ناجحة بالتدفق الخلوي. وصمة عار 1 × 106 خلايا، الحفاظ عليه من خطوات 1.2.17 (خلايا نخاع العظام قبل فصل الخلية المغناطيسية) و 1.2.19 (خلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام بعد فصل الخلية المغناطيسية)، مع الأضداد التالية: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), (α-CD4 GK1.5)، و α-CD8α (53-6.7). استخدم الخلايا المتبقية من الخطوة 1.2.17 كعنصر تحكم أونستينيد وتلطيخ واحد عناصر التحكم، لإعداد cytometer التدفق.
      1. نقل 1 × 106 خلايا من كل عينة إلى بئر صفيحة 96-جيدا مع V-قاع لأداء سيتوميتريك تدفق تلطيخ الداخلي.
      2. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا ضمن لوحة 96-جيدا (الخطوة 1.2.20.1) في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% تصفية المصل البقري).
      3. الطرد المركزي الخلايا ضمن لوحة 96-جيدا في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
      4. إضافة مبلغ مناسب للأجسام المضادة للاختيار (مقارنة مع خطوة 1.2.20) للعينات لتلطيخ واحد في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
      5. إعداد خليط من جميع الأجسام المضادة (ميكس الرئيسي) التي تحتوي على كميات مناسبة كافية لكل على حدة وصمة عار مختبرين خلية نخاع العظم الحفاظ عليها من قبل (راجع الخطوة 1.2.17) وبعد (راجع الخطوة 1.2.19) المغناطيسي تي خلية استنزاف. إضافة 100 ميليلتر من مزيج الرئيسي إلى مختبرين على حد سواء.
      6. إضافة فقط 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية للعينة أونستينيد.
      7. احتضان الخلايا ضمن لوحة 96-جيدا لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
      8. إضافة 100 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي الخلايا ضمن لوحة 96-جيدا في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
      9. الطرد المركزي الخلايا في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
      10. نقل العينات إلى أنبوب أسفل المائدة مستديرة 5 مل البوليستيرين وتحليلها مع أداة سيتوميتير تدفق التي قادرة على الكشف عن الجزيئات الفلورسنت التي كانت تستخدم لتسمية الأجسام المضادة المستخدمة لتوصيف عينات الخلايا (راجع الخطوة 1.2.20).
      11. مقارنة تكوين خلية من قبل وبعد انفصال الخلية المغناطيسية.
        ملاحظة: درجة نقاء حوالي 95% CD45.1+CD3– (تي-خلية-المنضب أي نخاع العظام) الخلايا داخل البوابة يعيش عادة ما يتحقق.
    21. أغسل تعليق خلية T-خلية-نضوب نخاع العظام 2 x مع برنامج تلفزيوني الحل (450 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية)، وأخيراً، ريسوسبيند الخلايا في حل برنامج تلفزيوني، ضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل. تبقى الخلايا على الجليد الرطب حتى الحقن.
    22. حقن الخلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام في الفئران المستفيدة، التي كانت المشع في اليوم السابق (انظر القسم 1-1).
      1. ضع الماوس تجريبية في دائرة مانعة للتسرب، والحث على التخدير بالاستنشاق لتصل إلى 4% إيسوفلوراني، حتى الفأر فاقد الوعي. تأكيد التسكين وفقدان الوعي عن طريق اختبار فقدان المعاكسة رايتينج وسحب الخسائر اللاحقة الدواسة العاكسة.
      2. ضخ 5 × 106 خلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام (أي 100 ميليلتر من 5 × 107 خلايا/مل) الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني الحل باستخدام حقنه 1 مل مزودة بإبرة ز 30 عن طريق الوريد في الفضاء خلف المقلة التي تحتوي على الجيوب الوريدية.
  3. يوم 2: نقل الخلايا T
    ملاحظة: تنفيذ الإجراءات الموصوفة أدناه في غطاء زراعة الأنسجة معقمة واستخدام الكواشف التي تمت تصفيتها. استخدام CD45.2 C57Bl/6 (البرية من نوع؛ الفئران WT) كالجهات المانحة للخلايا اللوريكتيفي تي. يسمح استخدام نظم العلامة كونجينيك ديستينجويشابيليتي بين المتلقي (CD45.2+ H2kd+ بالب/ج الفئران) والجهات المانحة أنواع الخلايا المكونة للدم (خلايا نخاع العظام: CD45.1+ H2kb+ B6. سخل الفئران؛ متمكنة من خلايا تي: CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6 الفئران).
    1. Euthanize الفئران C57Bl/6 وفقا تطبيق المبادئ التوجيهية للمؤسسات والسلطات. ولذلك، تخدير الفئران بالاستنشاق بتركيز من 5% إيسوفلوراني. تواصل التعرض isoflurane حتى 1 دقيقة بعد إلقاء القبض في التنفس وتأكيد القتل الرحيم بخلع عنق الرحم. تطهير الفراء والجلد الماوس تماما مع الإيثانول 70%.
    2. ضع مصفاة مع شاشة مش 40 ميكرومتر في أنبوب جمع 50 مل. إزالة الطحال ووضعه على المصفاة.
    3. مع المكبس المحاقن، كومينوتي الطحال في المصفاة. أغسل بمصفاة والغطاس المحاقن مع برنامج تلفزيوني لجمع جميع سبلينوسيتيس.
    4. الطرد المركزي الخلايا داخل أنبوب جمع 50 مل في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    5. ريسوسبيند في سبلينوسيتيس في 3 مل من المخزن المؤقت ليسينج ACK خلايا الدم الحمراء. احتضان تعليق خلية 3 دقيقة بعد ذلك، أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي الخلايا في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند سبلينوسيتيس في برنامج تلفزيوني.
    6. عد الخلايا الطحال، باستخدام هيموسيتوميتير. تحويل قاسمة 6 × 106 خلايا تحليل التدفق الخلوي، لتقييم حجم تنقية في خطوة 1.3.9.
    7. ل CD3 إجمالي+ تي خلية العزلة من مجموع سبلينوسيتيس، استخدام أدوات تنقية خلية متوفرة تجارياً. عزل الخلايا T الطحال، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    8. عد CD3 الطحال+ تي الخلايا المعزولة كما هو موضح في الخطوة 1.3.7، استخدام هيموسيتوميتير. الاحتفاظ قاسمة للخلايا6 ر 1 x 10 لتحليل التدفق الخلوي.
      ملاحظة: عائد على متوسط تي الطحال الخلايا الواحدة الماوس المانحة معزول بواسطة الخلية المغناطيسي الفاصل تتراوح بين 1.3 × 107 إلى 2 × 107 الخلايا.
    9. تأكيد نجاح عزل تي خلية بالتدفق الخلوي. للاطلاع على وصف تفصيلي للبروتوكول المصبوغة، تمنح واتبع الخطوات 1.2.20.1-1.2.20.10.
      1. وصمة عار سبلينوسيتيس6 1 x 10 خطوات 1.3.6 (قبل فصل الخلية المغناطيسية) و 1.3.8 (بعد فصل الخلية المغناطيسية) مع الأضداد التالية: α-CD45.2 (104) α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) و α-CD8α (53-6.7).
      2. استخدم الخلايا المتبقية من الخطوة 1.3.6 كعنصر تحكم أونستينيد وتلطيخ واحد مع الأجسام المضادة الخاصة بكل منها، لإعداد cytometer التدفق.
      3. مقارنة تكوين خلية قبل وبعد فصل الخلية المغناطيسية.
        ملاحظة: درجة نقاء إيه ناين فايف % من CD45.2+CD3+ تي الخلايا داخل بوابة اللمفاويات الحية ينبغي أن ينجز.
    10. أغسل تي الخلايا x 2 مع برنامج تلفزيوني (450 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية)، وأخيراً، ريسوسبيند الخلايا في حل برنامج تلفزيوني، ضبط تركيز الخلية إلى 7 × 106 خلايا/مل. تبقى الخلايا على الجليد حتى الحقن.
    11. حقن اللوريكتيفي، الطحال خلايا تي (راجع الخطوة 1.3.10) إلى المشع بالب/ج الفئران الذين تلقوا سابقا خلايا T-خلية-نضوب نخاع العظم CD45.1+ (راجع الخطوة 1.2.22).
      1. حمل التخدير عن طريق وضع الماوس تجريبية في دائرة مانعة للتسرب التي يتعرض لها لتصل إلى 4% إيسوفلوراني حتى أنه يفقد وعيه. تأكيد التسكين وفقدان الوعي عن طريق اختبار فقدان المعاكسة رايتينج وسحب الخسائر اللاحقة الدواسة العاكسة.
      2. حقن 0.7 × 106 اللوريكتيفي CD3+ تي الخلايا باستخدام حقنه 1 مل مزودة بإبرة ز 30   (أي، 100 ميليلتر من 7 × 106 خلايا/مل) يتضمن الحل برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 1.3.10)، عن طريق الوريد إلى خلف المقلة مساحة للفئران، للحث على GvHD. سمي هذه الفئران كمجموعة تجريبية.
      3. حقن مجموعة مختلفة من الفئران مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وحدها، عن طريق الوريد في الفضاء خلف المقلة، وسمي هذه المجموعة كمجموعة مراقبة، وفي وقت لاحق دعا "لا-تي-خلية-زرع الفئران (لا)".

2-تقييم المنهجية جفهد

ملاحظة: تنفيذ هذا الإجراء في أجواء شبه عقيمة في غرفة تجريبية مرخصة ومجهزة للتعامل مع الفئران الحية داخل مرفق الحيوان.

  1. اتبع مسار السريرية جفهد في الفئران الفردية؛ على وجه التحديد، تقييم ونقاط الفئران التجريبية 3 x أسبوع لوجود أعراض سريرية من GvHD، استناداً إلى نظام لتسجيل النقاط المبينة أدناه ومقتبس من نظام التهديف أنشأته سابقا كوك et al.6.
    1. وزن الماوس كل على حدة وتسجيل الوزن وحساب خسارة وزن الجسم ثيسبيسيفيك إشارة إلى وزن الجسم أن يتحدد قبل بدء التجربة (المقابلة إلى 100 في المائة) في اليوم 0 (الخطوة 1.1.2). نقاط الوزن أقل من 10% من وزن يبدأ مع الصف 0 وفقدان وزن بين 10% و 25% مع الصف 1، وفقدان وزن أكثر من 25% مع الصف 3.
    2. نقاط مستوى النشاط لكل الماوس، الفئران تميز بمستوى نشاط عادي (نقاط = 0) من الفئران بمستوى نشاط انخفاض معتدل (درجة = 1) والفئران مع السلوك ثابتة ما لم تكن حفز خارجياً (نقاط = 2).
    3. نقاط نسيج الفراء، وبذلك تميز الفراء الطبيعي ولامعة و kempt (نقاط = 0) من الفراء تكدرت معتدل (درجة = 1) ووجود البقع أصلع (نقاط = 2).
    4. نقاط نسيج الجلد، تميز الجلد الطبيعي (النتيجة = 0) من بقع متفرقة من تحجيم الجلد (على سبيل المثال، في الذيل والكفوف) (درجة = 1) والقياس الواضح ومناطق التهاب الجلد (نقاط = 2).
    5. تحليل اتساق البراز يفرز الكسور. نقاط البراز مع عادي (أي، الاتساق الثابت) مع الصف 0 والبراز مع البراز تشوه ولينة مع الصف 1 والبراز دون أي الاتساق، ومن ثم، مع إسهال شديد مع الصف 2.
    6. تلخيص كافة المعلمات سجل منفصل لنقاط سريرية قصوى من 12 للماوس.
  2. النظر وتقييم المعايير للتوقف عن هذه التجربة بسبب مستوى خطورة المرض الحالي الماوس الفردية، وفقا لتطبيق المبادئ التوجيهية المؤسسية وأذن بروتوكول الحيوان.

3-تقييم GvHD المعوية

  1. التهديف من الآفات ذات الصلة جفهد عن طريق التنظير المصغر لمنطقة المستقيم القاصي
    ملاحظة:تنفيذ ذلك في المحيطة سيميستيريلي في غرفة تجريبية مرخصة ومجهزة للتعامل مع الفئران الحية داخل مرفق الحيوان. استخدام محطة عمل مصغرة المنظار الذي تمت الموافقة على استخدام الحيوانات الصغيرة.
    1. تحضير جهاز المنظار التي تغطي التلسكوب مع (قطره 1.9 مم) ويبلغ طوله 10 سم مع غمد فحص بالمنظار. تنظيف وتعقيم المنظار مع الإيثانول والماء.
    2. التبديل على جهاز الكمبيوتر، ومصدر الضوء زينون قابل للتعديل، ووحدة الكاميرا، وتعيين التركيز بطريقة أن كائنات قريبة من العدسة تعطي صورة واضحة.
    3. قم بتوصيل مضخة الهواء غمد بالمنظار. تصور تيار الهواء، وتراجع تلميح المنظار في زجاج الكأس مليء بالماء. تنظيم مجرى الهواء عن طريق ضبط الصمام بين مضخة الهواء وغمد بالمنظار. تتكيف مع تيار هواء ثابتة، بطيئة، تنعكس ببضع تصاعدي مستمر الفقاعات.
    4. ضع ماوس في دائرة مانعة للتسرب. حمل التخدير بالاستنشاق لتصل إلى 4% إيسوفلوراني حتى الفأر فاقد الوعي. تأكيد التسكين ودولة غائبة من ردود الفعل عن طريق اختبار فقدان المعاكسة رايتينج وسحب الخسائر اللاحقة الدواسة العاكسة.
    5. استخدام جهاز تخدير بيطرية مناسبة وفقا لبروتوكول الحيوانية المستخدمة. نقل الماوس من الدائرة إلى مساحة عمل تنظير القولون. موقف الماوس أنيسثيتيزيد، مع انفها في نوسيكوني (التي يتم توصيلها إلى الصك التخدير)، على تنظيف العمل هنا، غمد حيث أن الفأر في موقف معرضة، التي تواجه المجرب مع ما هيندكوارتيرس.
    6. للحفاظ على التخدير أثناء إجراء تنظير القولون، خفض تركيز إيسوفلوراني بحوالي 2%. مراقبة التنفس واستجابة للتحفيز أثناء تنظير القولون الماوس وضبط تركيز إيسوفلوراني في المبخر إذا لزم الأمر. تغطية العينين للماوس مع مرهم لمنعهم من الحصول على الجاف.
    7. مراقبة فعالية التخدير معسر بين أصابع القدم الماوس. في الحالة تغيب مفاعليه، تابع إلى الخطوة 3.1.8.
    8. رفع الذيل تماما فوق جذر الذيل مع جهة وإدراج بعناية المنظار، المتمركزة في اليد الأخرى، عن طريق الشرج في المستقيم.
    9. وفي حين يضخم تيار الهواء التجويف القولون والمستقيم، تتحرك ببطء وبعناية المنظار إلى الأمام في اتجاه aboral.
    10. ضع المنظار في منتصف التجويف colonic والحفاظ على هذا الموقف من أجل التقليل إلى أدنى حد من الاتصال مع الجدار colonic وتجنب إجراء خدوش، أعمق الإصابات المتصلة بالجدار (مثلاً، مما أدى إلى نزيف)، أو حتى على الحائط تثقيب (راجع الخطوة 3.1.17) . التحكم بهذه الخطوة بمشاهدة دفق الفيديو (أي، بموجب التصور المستمر من حجرة colonic) بشكل دائم.
    11. إذا كان البراز انقباض الرأي، إزالتها المنظار وإجراء حقنه شرجية بالتنظيف مستقيمي مع تصل إلى 2 مل من المحلول الملحي، باستخدام ماصة باستور ناعمة. استخدم كسائل قليلاً قدر الإمكان، لمنع تمييع البراز وغيرها من الآثار الثانوية التي تؤثر سلبا على خصائص السطح المخاطي، وفي نهاية المطاف، سجل نتائج غير مقصودة.
    12. محاولة لوضع بانتظام المنظار في محددة (أي، متميزة) موقع التشريحية داخل القولون القاصي على توحيد التسجيل من التهاب colonic وتحسين إمكانية مقارنة النتائج بين الفئران وعبر التجارب وسجل.
      ملاحظة: عادة، يمكن الوصول بالمنظار جامدة، أقصى عمق 4 سم عبر الطريق المستقيم. بين 2 و 4 سم أبورالي، القولون بانتظام يتحول فليشر أنه لا يمكن تمرير مع colonoscope جامدة. استخدام منطقة القولون ديستالي المتاخمة فليشر كالتسجيل الافتراضي الموضعية.
    13. بدء تسجيل دفق الفيديو والبدء بالتسجيل من التهاب.
    14. تقييم التهاب القولون GvHD المتصلة بتسجيله المعلمات وأوضح وهو مبين في الجدول 1 و الشكل 3.
      1. تحريك المنظار في التهديف البقعة بلطف وقليلاً مرة أخرى--وإلى الأمام لتقييم معلمات مختلفة.
      2. تقييم المعلمة "الشفافية"، فضلا عن "اتساق البراز"، بتحديد المواقع المنظار في مسافة أوسع بالنسبة إلى الجدار colonic.
      3. تقييم معلمات "التفاصيل" و "الأوعية الدموية" بتحديد المواقع المنظار بالقرب من الجدار colonic. للقيام بهذه المهمة، بعناية تطبيق التوتر محسوبة جيدا للجدار colonic مع تلميح المنظار.
    15. عند انتهاء عملية التسجيل، إيقاف التسجيل.
      ملاحظة: بعد ذلك، يمكن استخدامها في مجموعة مقطع فيديو مسجل أو المستخدمة لتوليد الصور التمثيلية (أي الصور) للمعايير المقررة ميني اندوسكوبيكالي المساهمة الشاملة لالتهاب colonic.
    16. بعناية إزالة المنظار.
    17. وقف المعرض isoflurane بنقل الماوس إلى قفص منفصل الذي يتعرض إلى الهواء المحيط. الحارة الماوس مع مصباح الضوء الأحمر ومراقبة الماوس حتى يستعيد من المخدر ويستعيد وعيه الكامل.
      ملاحظة: نظراً لتضخم القولون الهواء أثناء التنظير، ستظهر منطقة البطن من الماوس ينفخ حتى بعد ذلك مباشرة. بينما هذا أمر طبيعي وذات طبيعة عابرة، علامات طويلة من التضخم الهائل وتدريجية حتى البطن وفشل استرداد الماوس قد يشير إلى غير مقصودة انثقاب القولون (في هذه الحالة، احتياجات الماوس أن euthanized فورا).
    18. بعد اكتمال شفائهم، ضع الماوس مرة أخرى إلى قفصة كل منهما.
    19. النهج الاختياري: من الممكن أيضا يأخذ خزعات الأنسجة تسترشد رأي. اتخاذ الخطوات التالية.
      ملاحظة: سيتم إجراء تنظير القولون بنفس الطريقة كما هو موضح في الخطوات 3.1.1-3.1.18، مع إدخال التعديلات التالية.
      1. في الخطوة 3.1.1، استخدم فحص بالمنظار غمد مع قناة عامل مدمج، بدلاً من غمد فحص بسيط دون قنوات العمل، لتغطي التلسكوب. إدخال ملقط خزعة في القناة العامل حتى طرفها مرئياً فقط أمام المنظار في شاشة الفيديو لأن هذا إلى حد كبير ما يمنع الإصابات غير المقصودة للامعاء.
      2. المضي قدما في خطوات 3.1.2-3.1.11. إدراج المنظار في القولون والدفع إلى الأمام بعناية إلى مكان الحادث للفائدة.
      3. تستخدم المساعدة من المجرب الثاني للمهمة لأخذ خزعات الأنسجة colonic. اسأل المجرب الثانية للتنقل غيض الملقط خزعة إلى منطقة colonic الاختيار عن طريق دفع الملقط داخل القناة العامل ببطء إلى الأمام حتى يمكن فتح فكي الملقط. استمرار مشاهدة دفق الفيديو أثناء هذا الإجراء للحد من مخاطر إصابة الجدار colonic.
      4. استرداد عينة أنسجة colonic جدار بعناية الافتتاح والاختتام فكي الملقط خزعة.
        ملاحظة: القيام بذلك بحذر لمنع ثقب الجدار colonic. في حالة نادرة من ثقب colonic، فورا التضحية الماوس المتأثرة عن طريق تطبيق المقاييس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وتحت الإدارة المستمر للمسكنات.
      5. التراجع وإزالة الملقط مغلقة خارج القناة العامل. إزالة العينة من بين فكي الملقط خزعة بالغمس وتهز الملقط فتحت بعناية في حل PBS العقيمة. وبعد ذلك، اختر شروط التخزين السليم لعينات الأنسجة، وفقا لتحليلات المصب المخططة. بعد تطهير مع الإيثانول 70%، إمكانية إعادة استخدامها الملقط اتخاذ مزيد من الخزعات.
      6. وبعد أخذ الخزعات، إزالتها المنظار وإنهاء تنظير القولون كما هو موضح في الخطوات 3.1.16-3.1.18.
  2. تحليل نسيجية
    1. بين يومي 26 و 30 بعد التشعيع بالأشعة السينية، euthanize HCT الو الفئران المستفيدة وفقا لتطبيق المبادئ التوجيهية للمؤسسات والسلطات. ولهذا الغرض، تخدير الفئران باستنشاق إيسوفلوراني 5%. تواصل مع التعرض إيسوفلوراني لمدة 1 دقيقة بعد إلقاء القبض في التنفس وتأكيد القتل الرحيم بخلع عنق الرحم. دقة تطهير الفراء والجلد للماوس مع الإيثانول 70%.
    2. فتح تجويف البطن وإزالة القولون. أنه نقل إلى طبق بتري (التي يبلغ قطرها ملم 92) مع برنامج تلفزيوني.
    3. ملء نصيحة الصيدلي 5 مل مع برنامج تلفزيوني. بمساعدة الملقط سيمكين بطول 13 سم ونصائح منحنى مسنن، كشف الجزء الأعلى من القولون (حوالي 5 ملم) على غيض غيض موزع. عناية إصلاح القولون باستخدام الملقط في تلميح موزع ومسح القولون مع برنامج تلفزيوني بالضغط أسفل المكبس طرف موزع لإزالة البراز من الأمعاء.
    4. قطع شريحة colonic يقع حوالي 5 مم من فتحه الشرج، مع المساعدة من مشرط.
    5. إصلاح العينة مستأصل القناة الهضمية في فورمالدهايد 4.5% بين عشية وضحاها. قبل تضمينه في البارافين، وضع الأنسجة في وضع رأسي.
    6. قص 3 ميكرومتر عبر أجزاء من أنسجة القولون جزءا لا يتجزأ من البارافين ووصمة عار لهم والهيماتوكسيلين ويوزين (أنه)، تستخدم بروتوكولات قياسية المصبوغة.
    7. إعداد الملطخة بأنه المقاطع العرضية لعينات الأنسجة القولون.
    8. مقتبس من المصفوفة التهديف عنها كابلان et al.12, هيستوباثولوجيكالي نقاط نشاط التهاب سيميكوانتيتاتيفيلي، مع عشرات من 0-3: لا التهاب (النتيجة = 0)، التهاب معتدل (درجة = 1)، معتدلة التهاب (نقاط = 2)، والتهاب حاد (نقاط = 3).
      ملاحظة: ومن الناحية المثالية، توظف لهذه المهمة إلى خبرة الطبيب الشرعي الذي هو من ذوي الخبرة في تقييم مورين جفهد المعوية وأعمى لطبيعة التجريبية ومجموعات التحكم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أنشئ البروتوكول الحالي، وصف التقييم بالمنظار ميني الآفات المرتبطة GvHD المعوية القولون القاصي، والتحقق من صحتها في الفئران تعرض سابقا للاستقراء المنهجي من طراز GvHD الحادة الشديدة. في هذه الدراسة، ونحن استخدام فئة MHC أنا متطابقة تماما النظام النموذجي في أي بالب/ج الفئران كانت قاتلة المشع، تلي زرع تي-خلية-نضوب نخاع العظام متمكنة وإدارة اللوريكتيفي الذي يحفز GvHD CD3 C57BL/6+ الخلايا اللمفية تي. تم تنقية خلايا T-خلية-نضوب نخاع العظم والطحال الخلايا T لتحريض GvHD بالفصل المغناطيسي. النقاء من هؤلاء السكان الخلية يحدده التدفق الخلوي، ويتم عرض نتائج عملية تنقية الممثل في الشكل 1، عرض استنفاد الخلايا T من خلايا نخاع العظام مجموع كافية وإثراء متسقة CD3 المستمدة من الطحال الخلايا+ تي قبل نقلهم إلى سبق الفئران المشععة. أثناء السريرية المعروضة في الشكل 2 يوضح تكاثر قوية تقلد النمط الظاهري GvHD الجهازية السريرية عند الو-كليات التقنية العليا بحضور (WT، باللون الأسود) مقابل غياب لمفاوية المانحة تي اللوريكتيفي (عدم، رمادي). سجل النظام ذكرت سابقا قبل كوك et al. يمثل نواة مجموع فيه ست معلمات تقييم وتصنيف: الجسم الوزن، والموقف، والنشاط، ونسيج الجلد والفراء، والبراز الاتساق6. مراقبة الفئران ذوي الخبرة واحد فقط، المبكر التي تحدث الذروة الحرز السريري، بين يومي 5 و 10، التي وبالمثل لوحظ في الفئران تي-خلية-تلقي وهو، لذلك، إلى حد كبير بسبب الاستجابة الالتهابية النظامية المرتبطة بالإشعاع. بغض النظر، عشرات السريرية الفئران تي-خلية-تلقي الجهات المانحة بدأت في الارتفاع في وقت سابق، وأظهرت أعلى ذروة مجموع، فقط عابر انخفض بعد أن بلغ ذروته في البداية، وثم، أساسا زيادة مرة أخرى، باستمرار، على مدى الفترة المتبقية من التجربة. عموما، أن هذه النتائج الاتفاق مع تفسير أن الفئران T الخلية-المستقبلة لإظهار أقوى وأكثر تقدمية علامات GvHD النظامية مقارنة بالفئران لا.

الفئران الو-HCT تي لمفاوية-المستقبلة للجهات المانحة أظهرت علامات مختلفة من حدة مظاهر GvHD المتصلة بالجهاز والجهازية، عموما مما أدى إلى ارتفاع مجموع الدرجات، بينما تفتقر الفئران التحكم المحبة معتدلة إلى شديدة، لا سيما في نقاط زمنية لاحقة. ومع ذلك، علامات GvHD المعوية ممثلة تمثيلاً ناقصاً في GvHD النظامية سجل النظام، حيث أن المعلمة الوحيدة المقررة المتصلة بالقناة الهضمية اتساق البراز. كما هو مبين في الجدول 1، ميني اندوسكوبيكالي قابلاً تم تعريف المعايير، تهدف على وجه التحديد للوصف الدقيق، سجل، والدرجات من الآفات المعوية المرتبطة GvHD، بالتكيف مع المعايير التي ذكرت سابقا للتقييم من التهاب القولون سينجينيك إلى سياق التهاب القولون يحركها اللوريسبونسي9. يعرض الشكل 3 أمثلة نموذجية لكل معيار الفردية، التي توضح نوع ومدى الآفات المرتبطة جفهد المعوية، وبالتالي تصور مصفوفة الدرجات المطبقة أثناء التقييم ميني المنظار في القولون القاصي من الفئران المعرضة GvHD عند زرع الأعضاء فئة MHC تماما متطابقة لمفاوية المانحين.

الشكل 4 ويبين أن الأمعاء GvHD مجموع النتائج النتيجة التي تستند إلى المعايير المحددة في الجدول 1 وعرضها في الشكل 2 بسهولة تمكين المجرب تميز المانحة المستقبلة للخلايا اللمفاوية الفئران مع وجود علامات الالتهاب المعوي التهاب من الفئران التحكم التي أساسا خالية من GvHD. للتحقق من صحة نظام الدرجات استناداً إلى ميني اندوسكوبيكالي، أجريت دراسات نسيجية باستخدام نظام درجات ذكر سابقا مجهرية12. وتؤكد البيانات في الشكل 4ب أن القولون الفئران تأثرا بالتهاب المتصلة GvHD، كما يدل على ذلك عشرات مجموع كولونوسكوبيك عالية، وعرض علامات نسيجية قوية وبالمثل للالتهاب، ونظرا نسيجية مجموع نقاط إيه تو تشريح الجثة. وفي المقابل، عرض أنسجة القولون من الفئران التحكم لا (0 نقاط)، أو في معظمها، معتدل (درجة 1) علامات نسيجية لالتهاب، تمشيا مع الغياب الفعلي لعلامات ميني اندوسكوبيكالي القابلة للاكتشاف من التهاب القولون. وعلاوة على ذلك، كما هو مبين في الشكل 4ج، د، دراسات الترابط بين ميني اندوسكوبيكالي هيستوباثولوجيكالي تقييم ونشاط التهاب القولون والجهازية GvHD أجريت عشرات. الأهم من ذلك، أثبتت هذه الدراسات أن مجموع العزم ميني اندوسكوبيكالي عشرات دي ثري التنبؤ موثوق نظراً لغياب منتصف إلى أعلى الصف (أي، إيه تو) المعوية المرتبطة GvHD التهاب colonic عشرات تم الحصول عليها من الدرجات نسيجية. وأخيراً يظهر شدة GvHD المعوية المقررة اندوسكوبيكالي علاقة بالنشاط GvHD النظامية.

Figure 1
الشكل 1 : تدفق سيتوميتريك تقييم نوعية خلايا النخاع مغناطيسيا المنقي تي-خلية-المنضب ومتمكنة CD3 الطحال+ تي الخلايا. (أ) استنفاد خلايا نخاع العظم CD90.2+ يتحقق بالفصل المغناطيسي، باستخدام مجموعة أدوات تنقية متاحة تجارياً. النقاء خلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام تحددها التدفق الخلوي، تلطيخ الخلايا قبل وبعد استنفاد الخلايا T مع CD45.1 المضادة ومكافحة-CD3. يتم إظهار النتائج من تجربة تمثيلية واحدة. مغناطيسيا تنقية الخلايا (ب) T الطحال، توظف مجموعة مواد تنقية متاحة تجارياً. النقاء يحدده التدفق الخلوي، مقارنة الترددات CD45.2 و CD3 كوستينينج العينات المستمدة من قبل وبعد عزل خلية تي. يتم إظهار النتائج من تجربة تمثيلية واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : دورة السريرية من GvHD، تستخدم فئة MHC أنا متطابقة تماما النموذجي- للحث على الحادة GvHD، كانت الفئران بالب/ج كامل الجسم المشع في اليوم 0. وتلقت الفئران الخلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام 24 ساعة في وقت لاحق (d1). في اليوم الثاني، تم حقن الفئران ب CD3 الطحال متمكنة+ تي الخلايا (البرية من نوع [وزن]؛ n = 9). كعنصر تحكم، تلقي بعض الفئران تي-خلية-نضوب نخاع العظام وحدها (لا؛ n = 9). وقيمت الفئران على وجه التحديد ثلاث مرات في أسبوع لوجود وشدة الأعراض السريرية من GvHD. وتمثل البيانات المعروضة وقيم المتوسط الحسابي ± SEM من عشرات السريرية التي تم الحصول عليها من الفئران الفردية مجموعة المعاملة المشار إليها من تجربتين الممثل. تم تحليل البيانات من ANOVA ثنائي الاتجاه، تليها posttest في بونفيروني مقارنات متعددة. واعتبر ف < 0.0001 كبيرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الممثل صور توضح أمثلة الدرجات الأساسية للمصفوفة التهديف القولون المعوية المتصلة GvHD التعديلات المقررة بتقييم ميني المنظار من النقطتين الفئران حية، والو-كليات التقنية العليا-تعامل- لاستكمال وتوضيح وصف تفصيلي للدرجات التهديف المستخدمة ونظام في الجدول 1، الصور المصغرة المنظار الممثل مستويات تقييم الخطورة (الدرجات) للمعلمات كل على حدة في القولون من تخديره، يتم عرض الفئران الحية تمر HCT الو بين 26 و 30 قبل كما هو موضح في الشكل 1 أيام هنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : ميني-المنظار التهديف والدرجات من التهاب الأمعاء المتصلة GvHD القولون، التنبؤ بشكل موثوق وجود التهاب القولون العليا المقررة بتسجيله نسيجية. (أ) بين يومي 26 و 29 بعد تنصيب جفهد كما هو موضح في الشكل 1، وتم تقييم مظاهر GvHD المعوية بالتنظير المصغر في الفئران، وتخديره من العيش. وسجل التعديلات colonic متدرج وفقا لنظام تسجيل النقاط والدرجات المبينة في الجدول 1 و الشكل 2. صور المنظار الممثل لعنصر التحكم (لا خلية T؛ ولا) والبرية من نوع (WT) والفئران تي-خلية-تلقي النتيجة ميني--اندوسكوبيكالي المقررة (أعلى) ترد. (ب) الفئران ضحى ح 12 بعد التقييم بالمنظار ميني، ومعالجة الجزء القاصي من القولون وتقييم هيستوباثولوجيكالي. تم تصنيف نشاط الهيماتوكسيلين ويوزين الملون-والمقاطع العرضية للقولون القاصي التحريضية. الممثل الهيماتوكسيلين وويوزين-الملطخة عبر أقسام القولون البعيدة من لا الفئران الو-كليات التقنية العليا-تعامل تلقي تي خلية ووزن تي الخلية والأنسجة المطابق تظهر عشرات. تم تحليل البيانات في لوحات A و B من الطالب تي--اختبار، وهي كما هو موضح يعني ± sem. * * *ف < 0.0001 اعتبرت هامة. WT: n = 15؛ لا: n = 15. وتمثل البيانات البيانات المجمعة من أربع تجارب فردية. (ج) الاعتماد المتبادل لتنظير القولون التهديف وسجل النسيجي. يتم عرض البيانات كما يرسم مربع. يعرض كل اسطوانة الوسيط (خط أسود داخل كل مربع) ونطاق البيانات (الحد الأدنى إلى الحد الأقصى) و quartiles (مناطق لكل مربع). WT: n = 15؛ لا: n = 15. وتمثل البيانات البيانات المجمعة من أربع تجارب فردية. (د) العلاقة بين تنظير القولون التهديف وسجل السريرية. يتم تضمين التحكم والبرية من نوع T الخلية-المستقبلة للفئران في تحليل الارتباط. ويمثل خط متصل خط الانحدار الخطي. معامل الارتباط سبيرمان (r-القيمة) و p-تظهر قيمة. WT: n = 12؛ لا: n = 13. وتمثل البيانات البيانات المجمعة من ثلاث تجارب فردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

نقاط 0 1 2 3
الشفافية الجدار colonic خارج الأمعاء الداخلية الأجهزة (مثل الطحال) دقة مرئية الحد منفصلة للتعريف بأجهزة خارج الأمعاء بسبب عتامة خفيفة من الجدار colonic خفض معتدل لرؤية أجهزة خارج الأمعاء بسبب غموض كبير الجدار colonic الافتقار إلى رؤية أجهزة خارج المعوية، والجدار colonic أي غير شفافة
الحبوبية مظهر سطح المخاطية لا تتأثر، على نحو سلس؛ سرداب colonic نمط مرئي المظهر تخشين وحصاه كبيرة منفصلة من سطح المخاطية معتدلة مظهر السطح المخاطي تخشين وحصاه كبيرة تخشين شديدة وظهور حصاة كبيرة من سطح المخاطية؛ ظهور مثل وسادة للغشاء المخاطي
الأوعية الدموية يتغير نمط الأوعية الدموية عرض شبكة الاتصال من السفن الكبيرة والصغيرة تعديلات منفصلة لنمط الأوعية الدموية؛ نمط السفينة ويبدو أن المعركة الانتخابية بعض السفن غير مرئية؛ شبكة السفينة متقطع اتصل بنزيف المستحث؛ نمط دوت مثل السفن
اتساق البراز عادي; البراز الصلب؛ المواضيع الجميلة من المخاط
ويمكن ملاحظة بين البراز وول colonic		 لا يزال يتشكل البراز ولكن قد يحتوي على حواف خشنة؛ تشوه بطرف المنظار البراز لينة وأونشابيد
البراز أكثر وضوحاً ساطع (أعلى محتوى الماء)		 البراز فضفاضة، والسائل؛ إسهال مائي. البراز قد تكون موزعة عشوائياً على سطح القولون المخاطي

الجدول 1: مصغرة-المنظار التهديف والدرجات مصفوفة آفات المعوية المتصلة جفهد في القولون الفئران الو-كليات التقنية العليا-تعامل مباشر. تعديلات مورفولوجية القولون اندولومينال وترانسمورال في الفئران الو-HCT pretreated قيمت قبل تنظير قولون المستقيم والقولون القاصي من الفئران تخديره، يعيش، باستخدام نظام مورين التنظير المصغر. تم تصنيف الآفات colonic مع مساعدة نظام التسجيل بالمنظار (فهرس المنظار مورين المعدلة من شدة التهاب القولون [ميكس]) الذي يتم استخلاصه من ميكس الأصلي سجل النظام عنها بيكر et al.9 وتتكيف مع سياق الو-كليات التقنية العليا. يتم تقييم القولون القاصي بصريا لوجود وحجم المعلمات الأربع التالية: 1. نفاذية الضوء بالمنظار (الشفافية) من خلال جدار الأمعاء colonic كسماكة الجدار؛ 2-سطح المخاطية عرض مظهر حصاة كبيرة (تقسيمات) من سطح المخاطية المنحى اندولومينال؛ 3-نمط تغيير الأوعية الدموية (الأوعية الدموية)؛ 4-اندوسكوبيكالي تقييم مظهر البراز في الموقع (اتساق البراز). يتم تسجيل كل معلمة من 0 (أي علامات) إلى 3 (أشد النمط الظاهري)، إضافة ما يصل إلى درجة مجموع الحد أقصى من 12 للماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصف البروتوكول منهجية الاستقراء والتقييم ميني المنظار من النمط الظاهري colonic لاحظ أثناء جفهد المعوية. أنه يخدم الغرض الأوسع نطاقا لتمكين العلماء لدراسة جفهد المعوية طوليا ونونينفاسيفيلي على مدى كامل من المرض (أي من بداية مظاهر colonic والتقدم حتى نشاط المرض القصوى).

ومع ذلك، هناك بعض الخطوات الحاسمة والهامة القيود الملازمة للمنهجيات المقدمة المجرب يحتاج إلى أن تكون على علم قبل تطبيق التكنولوجيات في سياق العلمية الخاصة بكل منها. أولاً، على الرغم من أننا استخدمت بنجاح تقييم الآفات colonic المعوية المتصلة GvHD ميني المنظار في نظام نموذجي بسيطة متطابقة histocompatibility11، قدم البروتوكول هنا حاليا ينطبق حصرا على MHC الفئة الأولى نماذج GvHD الحاد غير متطابقة تماما. بينما الفئة MHC أنا متطابقة تماما نموذج GvHD الشائعة والمستخدمة بشكل متكرر5، من الأمور الثابتة أن خصائص مظهر GvHD تعتمد اعتماداً كبيرا على سوبسترينس الماوس المستخدمة منذ ذلك بقوة يؤثر، على سبيل المثال، حساسية للإشعاع. وعلاوة على ذلك، خطيرة قد تؤثر على المصدر الماوس تجريبية مع، على سبيل المثال، تكوين متفاوتة الحجمية المعوية والأرقام المستخدمة لنقل الخلايا T متمكنة حركية وحيوية من مظاهر GvHD المعوية12. ومن ثم فهو خطوة حاسمة اختبار والتحقق من صحة التدابير المشار إليها لقدرتها على حمل GvHD المعوية بنجاح كما هو موضح بعناية.

وفيما يتعلق بالتنفيذ الناجح لتقييم ميني المنظار يعيش GvHD المعوية الحادة، نود أن نشدد على أنه، أثناء معالجة المنظار هو مباشرة، قد يتطلب الأمر بعض التدريب، التقليل من مخاطر تواجه معظم اللعين مضاعفات (أي، ثقب في جدار الأمعاء بأداة صلبة في تركيبة مع الحاجة إلى الهواء-تضخم القولون). سبب زيادة الضعف الناجم عن التهاب وانخفاض مرونة الأنسجة colonic، قد تكون سلامة جدار الأمعاء أكثر عرضه للخطر أثناء مرحلة الانتعاش بوسترادييشن (i.e.,until يوم 10) وعند مظهر كامل للامعاء جفهد المتصلة التهاب القولون (أي بعد حوالي يوم 25). الأهم من ذلك، بيد لا لاحظنا معدلات زيادة كبيرة من المضاعفات تعتمد على هذه النقطة الزمنية من التنظير، طالما هو المتقدم المنظار بلطف تحت الرؤية الكافية. وفي المقابل، حددنا يجرب المخدرات دون المستوى الأمثل لأن عامل خطر يمكن أن يؤدي حدوث حركات الجسم غير المرغوب فيها من الماوس التجريبية عمق غير كاف للتخدير، والتتابع، أحداث انثقاب الجدار colonic. ثانيا، أن الخطوة الأكثر أهمية أثناء عملية التسجيل يمثل القيود في هذه المسألة بسبب الوجود غير المرغوب فيها من صلبة أو البراز السائل (مثل الإسهال) في تجويف القناة الهضمية المجرب يتحرك المنظار في موقف التهديف. في هذه الحالة، مسح منطقة القولون والمستقيم مع المحلول الملحي ماصة بلاستيكية مرنة باستخدام مطلوب كثيرا. بيد أن هذا الإجراء قد يخل التهديف الدقة والتحديد للعديد من المعلمات (مثلاً، اتساق البراز)، يحتاج هذا التحذير بعناية أن تؤخذ في الاعتبار عند التهديف.

وهناك العديد من القيود التي تقيد بالتفسير والاستنتاجات المستمدة من هذا النهج بالمنظار. أولاً، الجوهرية لمنهجية استخدام المنظار غير مرنة عبر الطريق المستقيم، تقييمات تقتصر على الماضي 3-4 سم من القناة الهضمية (المستقيم والقولون القاصي). ولذلك، المحبة المرتبطة GvHD الدانية القولون والأمعاء الدقيقة حتى يتم افتراضياً مستبعدة من التقييم، مشيراً إلى أن المسائل العلمية مع التركيز على النمط الظاهري الأمعاء الصغيرة من GvHD لن تستفيد من هذا النهج. ثانيا، على الرغم من أن التهاب واحدة من سمات مميزة مورفولوجك GvHD المعوية، خصائص إضافية، مثل معدل زيادة المبرمج للخلايا الظهارية المعوية وفقدان العمارة سرداب المعوية، وكثيراً ما توجد و وشملت في سير العمل نسيجية الكامنة وراء GvHD المعوية التهديف والدرجات من أخصائيي علم الأمراض في المرضى الو-كليات التقنية العليا. هنا، نحن ريستريكتيدلي يرتبط عشرات GvHD المعوية ميني--اندوسكوبيكالي المقررة مع علامات التهاب هيستوباثولوجيكالي المقررة. اتخاذ هذا النهج، وصلنا إلى استنتاج مفاده أن التهاب colonic عتبة معينة في التهديف كولونوسكوبيك موثوق بها توقع وجود التهاب درجة معتدلة إلى عالية، حسب تقييم التحليلات تشريح الجثة نسيجية. ومع ذلك، الدراسات المستقبلية بحاجة إلى التحقيق في كيف، على سبيل المثال، معدلات المبرمج المقررة هيستوباثولوجيكالي تتصل بالمنظار ميني إجمالي مجموع الدرجات أو إلى، على سبيل المثال، إحدى المعلمات الأربعة الفردية المضمنة في مجموع النتائج. ثالثا، بينما يمكن تعريف الفئران تعاني من جفهد هيستوباثولوجيكالي معتدل-إلى-عالية-الصف سهولة النهج التهديف بالمنظار، الفئران مع المزيد من علامات التهاب الأمعاء الدقيقة قد يكون غاب عن النهج المبين، نظراً للحقيقة أن سجل نسيجية كشفت عن وجود علامات خفيفة من التهاب في مجموعة الفئران لم تشهد وحدها، دون زرع اللوريكتيفي المانحة لمفاوية الو-كليات التقنية العليا. بيولوجيا، هذا الاستنتاج قد يكون ممكناً، حيث قد تم اللوترانسبلانتيد لا الفئران، والتهاب القولون الحد الأدنى، في الواقع، تعكس وجود مستويات منخفضة من GvHD نظراً إزالة كاملة من خلايا تي من الكسر خلايا نخاع العظام أو إعادة تشكيل اللوريكتيفي تي الخلايا من نخاع العظام مع مرور الوقت. الدراسات المستقبلية تحتاج إلى معالجة هذه المسائل بمزيد من التفصيل. رابعا، رسميا، هذا البروتوكول يركز على التهاب القولون المرتبط GvHD المعوية ثابتة تماما. ولكن، وكما هو مبين ونشرت سابقا، البداية من التهاب القولون حول يوم 15 يمكن الكشف عن اندوسكوبيكالي وكوانتيتاتيد11. هنا، يمكن التمييز بوضوح بين من لا الفئران التي قد يكون النمط الظاهري colonic فقط بسبب علامات متبقية من الأضرار الناجمة عن تشعيع الأنسجة، أو بدلاً من ذلك، مرآة استجابة الانتعاش المخاطية بعد التشعيع11الفئران المعرضة GvHD. ومع ذلك، تحتاج إلى الدراسات المستقبلية للربط بين عمليات التقييم بالمنظار وتهدف تحليلات تفصيلية نسيجية للفئران المعرضة GvHD مقارنة بالفئران التحكم في نقاط زمنية سابقة.

وأخيراً، تطبيق الوظيفة إضافية مثيرة للاهتمام ومفيدة للتهديف بالمنظار من GvHD المعوية هو استخدام القناة عمل المنظار للمباشرة ملقط خزعة مصغر لهيكل التشريحية للاختيار في القولون. توفر هذه الميزة، كنوع من بنيت في الخيار، إمكانية اتخاذ خزعات الأنسجة الموجهة بطريقة العرض التي يمكن تحليلها كذلك بسلسلة من التقنيات المصب مثل الأنسجة وتلطيخ الفلورة وتحاليل PCR الوقت الحقيقي الجينات من الفائدة. ومع ذلك، الدراسات المستقبلية بحاجة إلى رسميا تقدير ما إذا كانت، على سبيل المثال، التهديف ورتب اندوسكوبيكالي تؤخذ خزعات نسيجية يعادل نسيجية النتائج استناداً إلى عينات تؤخذ تقليديا (أي، من euthanized الفئران).

عموما، مع هذا البروتوكول وصف تحريض وتقييمها بالمنظار ميني من GvHD المعوية، نحن نقدم منهجية لتقييم ونقاط الصف GvHD المعوية في صلة موريني GvHD نموذج نظام لالو-كليات التقنية العليا. التقييم بالمنظار يمكن أن تتكرر في الماوس نفسه في نقاط زمنية متعددة على مر الزمن، مما يلغي الحاجة euthanize الفئران للتتابع تقييم الأمراض المعوية الأنسجة المرتبطة GvHD (على سبيل المثال، في أجواء علاجية). أثبتت نتائج التهديف بالمنظار مصغرة مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها من تقييم التشريحية المرضية لالتهاب الأمعاء في القولون وارتباطاً جيدا مع الجهازية GvHD النشاط. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين هذا الإجراء مع الخزعات الموجهة بطريقة العرض عن طريق قناة العامل المنظار. في نهاية المطاف، بيد أن الدراسات المستقبلية لتقييم مدى الميزات المورفولوجية هيستوباثولوجيكالي العزم خلاف التهاب، التي كثيرا ما توجد في الآفات المعوية المتضررة من GvHD، تتعلق بالنتائج التي تم الحصول عليها بهذا تقييم ميني المنظار وسجل النهج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

دعمت هذه الدراسة التعاونية أبحاث المراكز (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG، #324392634؛ المشروع B03) (إلى ك. أ.) و 1181 لجنة حقوق الطفل (CRC-DFG، مشروع B05) (إلى ك. أ.)، وكلاهما يمولها الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS ) Sigma-Aldrich Co. LLC. D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) Fine Science Tools 11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) Fine Science Tools 14090-09
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich Co. LLC. R8758-500ML 
Hypodermic needle (26 G) B. Braun Melsungen AG 4657683
1 mL syring B. Braun Melsungen AG 9166017V
50 mL tube Sarstedt Ag & Co.KG 62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen BD Falcon 352340
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma-Aldrich Co. LLC. 11209 ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) Carl Roth GmbH & Co.KG 8043.2 ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3) Merck KGaA 1,048,540,500 ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-049-101 magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-095-130 magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) Biolegend 109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) Biolegend 100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) Biolegend 100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) Biolegend 110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) Biolegend 100714
Filtrated bovine serum  Pan Biotec P40-47500 ingredient of FACS buffer 
96-well polystyrene V-bottom plates Greiner Bio-One 651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) Falcon 352052
BD LSRFortessa II flow cytometer BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G) BD 324826
Oxy Vet Oxymat 3 Eickemeyer oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet  Eickemeyer 213062
Plexiglass chamber  Eickemeyer 214620
Straight Forward Telescope KARL STORZ SE &Co KG 64301 AA part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath KARL STORZ SE &Co KG 61029 C part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel KARL STORZ SE &Co KG 61029 D part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps KARL STORZ SE &Co KG 61071 ZJ  part of the experimental setup for colonoscopy
 175 Watt SCB XenonLight Source KARL STORZ SE &Co KG 20132120 part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable KARL STORZ SE &Co KG 495 NL part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head KARL STORZ SE &Co KG 22220030 part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit KARL STORZ SE &Co KG 22200020 part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor Olympus OEV181H part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran AbbVie Inc.  B506
Formaldehyde solution 37 % Carl Roth GmbH & Co.KG 7398.1
5.0 mL Dispenser tip  Eppendorf AG 30089456

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
  2. Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
  3. Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, Suppl 2 58-64 (2008).
  4. Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
  5. Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
  6. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  7. Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
  8. Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
  9. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
  10. Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
  11. Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
  12. Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 144، أمراض الدم، أمراض الجهاز الهضمي، وعلم المناعة، زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم متمكنة، التهاب القولون، جفهد المعوية، التهاب الأغشية المخاطية الأنسجة الجهاز الهضمي، التنظير
التعريفي للابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض وتقييمها بالمنظار ميني في الفئران حية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchele, V., Büttner-Herold,… More

Buchele, V., Büttner-Herold, M., Vogler, T., Neurath, M. F., Hildner, K. Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice. J. Vis. Exp. (144), e58871, doi:10.3791/58871 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter