Summary
Blodbaserade biomarkörer för neurodegenerativa sjukdomar är nödvändiga för att genomföra storskaliga kliniska studier. Ett tillförlitligt och validerat blodprov bör kräva en liten provvolym samt vara en mindre invasiv provtagningsmetod, prisvärd och reproducerbar. Detta dokument visar att hög genomströmning kapillär elektrofores immunassay uppfyller kriterierna för potentiell biomarkör utveckling.
Abstract
Kapillär elektrofores immunoassay (CEI), även känd som kapillär västerländsk teknik, blir en metod för att kontrollera sjukdom relevanta proteiner och läkemedel i kliniska prövningar. Reproducerbarhet, känslighet, små provvolymskrav, multiplexningsantikroppar för flera proteinmärkning i samma prov, automatiserad höggenomströmningsförmåga att analysera upp till 24 enskilda prover och kort tidskrav gör CEI fördelaktigt över den klassiska västra blot immunoassay. Det finns vissa begränsningar av denna metod, såsom oförmåga att använda en gradientgel (4%–20%) hög bakgrund med oraffinerade biologiska prover och kommersiell otillgänglighet av enskilda reagenser. Detta dokument beskriver en effektiv metod för att köra CEI i en multipel analys inställning, optimera proteinkoncentration och primära antikroppstitrering i en analysplatta, och ger användarvänliga mallar för provberedning. Också beskrivs är metoder för att mäta pan TDP-43 och fosforylated TDP-43 derivat i trombocytosol som en del av initiativet i blodbaserad biomarkör utveckling för neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
Det övergripande målet för CEI som beskrivs här är att tillhandahålla ett uppdaterat stegvis protokoll för analys av målproteiner i humana blodplättar. Tilldelning av en blodbaserad signaturmolekyl är en av de viktigaste uppgifterna inom biomarkörutveckling vid mänskliga neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom (AD), amyotrofisk lateral skleros (ALS), frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Parkinsons sjukdom (PD), integration smittosit (IBM), och andra protein-aggregering relevanta patologiskt villkor. Detektion av små mängder av sådana signaturproteiner i stora mängder blod med många störande medel är en utmaning. Därför är specificiteten, känsligheten, förmågan att hantera ett stort antal prover och reproducerbarhet en av den valda metoden avgörande.
Mänskliga blodplättar kan fungera som en miljö för att identifiera och tilldela potentiella biomarkörproteiner för neurodegenerativ sjukdom. Trombocyter ger möjlighet att fungera som en surrogat primär cell modell, som återspeglar vissa funktioner i neuronala celler1,2,3. Det finns vissa funktioner som gör trombocyter till ett av de föredragna sätten att analysera biomarkörkandidatproteiner och deras kemiska derivat. För det första kan blodplätt förvärvas med hjälp av en mindre invasiv metod genom att samla blod från givare (dvs. venipunktur) eller i stora volymer från gemenskapens blodbanker. För det andra kan blodplätt isoleras från hela blodet med minimalt förberedande arbete i minimalt utrustade laboratorier4,5. För det tredje har trombocyter inte kärnor; Därför är de en bra modellcell för att studera förändringar i ämnesomsättningen utan transkriptionsreglering. För det fjärde är biomolekylhalten hos blodplättar inkapslade; Därför skyddar trombocytmikromiljön dess innehåll från serumstörande ämnen (dvs. proteaser). Femte, trombocytberikad plasma kan förvaras i rumstemperatur i 7–8 dagar utan att förlora metabolisk aktivitet. Därför innehåller trombocyter en arbetsmodell där externa faktorer minimeras och kontrolleras.
Traditionella immunoassay tekniker såsom immunblotting (t.ex. västra blotting) och enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) används mer allmänt i specifika proteinanalys. Dessa två metoder har dock flera nackdelar, inklusive flera analyssteg, krav på farliga kemikalier och reagenser, stor urvalsstorlek, problem med analysreproducerbarhet och inter-run datavariationer. Dessa föranledde utvecklingen av en metod som är enklare med färre steg och uppnås på relativt kort tid. Även om den klassiska västra blot tekniken kommer att förbli en populär laboratoriemetod, dess flerstegsförfarande, förnödenheter, giftigt avfall (dvs. akrylamid, metanol, etc.) och analystid blir mindre önskvärt när du utför hög genomströmning kvantitativt proteinanalys.
En automatiserad CEI-metod håller gradvis på att bli en metod för val för laboratorier som genomför proteinanalyser med höggenomströmning 6. CEI eliminerar behovet av geler, gelelektroforesapparater, membran, elektrofores och elektroöverföringsenheter samt mer fysiska hanteringsengagemang. Om en CEI-analys är utformad väl bör den slutföras inom cirka 3,5 timmar, inklusive kvantitativ dataanalys, elektropherogram för publikationskvalitet och diagram med statistisk analys. En annan överlägsenhet i CEI-systemet är dess krav på 10x-20x mindre proteinkoncentration, vilket gör den idealisk för användning i mänskliga prover som används i kliniska prövningar7,8.
Den mest kritiska delen av CEI optimerar analysvillkoren för varje antikropp som köps från olika leverantörer, typ av antikropp (monoklonal kontra polyklonal), optimala proteinkoncentrationer, provberedning, provavbildningstemperatur och elektroforesspänning som appliceras på kapillärerna. Vi har utvecklat en enda analysformatoptimeringsmetod för CEI som ska implementeras innan några nya analyser, vilket kommer att spara tid och resurser. Detta optimeringssteg följs av en automatiserad kvantitativ bedömning av både totalt och fosforylerat derivat av transaktiveringsrespons DNA/RNA-bindningsprotein (TARDP). På grund av dess storlek (43 kDa) kommer förkortningen TDP-43 att användas i hela detta dokument. Här bedöms TDP-43 protein i humantrombocytlysate från ALS-patienter för att hjälpa till att utveckla prediktiv fosforyleringsvärde (PPV) som en potentiell prognostisk biomarkör.
TDP-43 är en ny potentiell sjukdom biomarkör kandidat för ALS. TDP-43 är ett allestädes närvarande protein i alla nukleinerade celler; Därför har funktionerna i TDP-43 under olika normala cellulära händelser och i neurodegenerativa sjukdomar undersökts9,10,11,12,13,14. Även om TDP-43 är ett kärnprotein15, har den förmågan att shuttle in och ut mellan kärnan och cytoplasma på grund av förekomsten av nukleära lokalisering och nukleära exportsekvenser16,17,18,19. Cytoplasmatisk TDP-43 är involverad i olika cellulära händelser, såsom mRNA stabilitet och transport, stressrespons, mitokondriell funktion, autophagosome20. Men inte mycket är känt om den roll som fosforylated derivat av TDP-43 annat än deras inblandning i patogenesen vid neurodegenerativsjukdom21.
Detta protokoll illustrerar hur man optimerar analysvillkoren för att analysera innehållet i TDP-43 och dess fosforylerat derivat i trombocyter med CEI-metoden. Eftersom fosforylerat TDP-43 inte är kommersiellt tillgängligt föreslås det att ett prediktivt fosforyleringsvärde (PPV) ska användas för att bedöma TDP-43-profiler hos ALS-patienter. Detta CEI-system använder en liten volym provblandning (2,5–3,0 μL per kapillär). Den totala analysens volyminställning är 8,0 μL per kapillär baserat på tillverkarens protokoll. därför kan forskare använda ett prov blandning beredning för två separata körningar. Tillverkaren utformade analysprotokollet så att eventuella pipettfel minimeras, om inte helt elimineras. De 24 enskilda blandningarna av humant blodplättar är indelade i halvvolymer (dvs. 2,5–3,0 μL per prov) och analyseras i följd av två olika antikroppar inom ~7 h. Cei-systemet som beskrivs här ger en önskvärd analysmodalitet med hög genomströmning. Användare måste testa antikroppar från olika leverantörer och prov beredning modaliteter för målproteinet innan du utför storskalig screening.
Protocol
Alla protokoll om bearbetning av mänskliga blodplättar följer riktlinjerna för både University of Kansas Medical Center och Kansas City University of Medicine and Biosciences IRB kommittéer.
1. Beredning av buffertar och reagenser
Obs: Förbered alla prover enligt tillverkarens riktlinjer. Använd personlig skyddsutrustning (labbrockar, handskar och skyddsglasögon) under denna procedur.
- Förbered citrattvättbuffert genom att kombinera 0,941 g sackaros (11 mM slutlig koncentration), 6,4 ml 5 M NaCl (128 mM slutlig), 5,4 ml 0,2 M NaH2PO4 (4,3 mMM slutlig), 9,4 ml 0,2 M Na2PHO4 (7,5 mM slutlig), 0,352 g natriumcitrat (4,8 mM slutlig), och 0,115 g citronsyra (2,4 mM slutlig). Justera den totala volymen till 250 ml med ddH2O. Filter genom en 0,45 μm filterskiva och justera pH till 6,5. Förvaras upp till 1 år vid 4 °C. Ta med lösningen rumstemperatur (RT) före användning22.
- Förbered bristningsbufferten genom att kombinera 250 mM sackaros, 1 mM EDTA och 10 mM Tris-Cl (pH 7,4) i en 100 ml slutlig volym. Förvaras upp till 1 år vid 4 °C. Tillsätt 2 μl fosfatashämmare cocktail (1:1000 slutlig) och 1 μL proteashämmare cocktail (1:2000 slutlig) i 2 ml brusten buffert. Håll på is tills du använder. Kassera den oanvända brustensbufferten.
2. Trombocytisolering
- Samla in 8–10 ml humant blod i blodsamlingsröret med gulkeps som innehåller syra-citrat-dextrose (ACD) lösning (75 mM trisnatriumcitrat, 124 mM dextrose och 38 mM citronsyra, pH = 7,4; ACD:blod = 1:9). Blanda försiktigt rörinnehållet 5x–6x inverteraför hand.
- Centrifugera rören vid 200 x g i en svängande skoprotor i 20 min vid RT.
- Samla trombocytrik plasma (PRP) (~3–4 ml) i ett koniskt bottenrör på 15 ml och lämna cirka 0,5 ml av PRP från buffycoaten (dimmig fraktion) för att undvika kontaminering. Om någon förorening av röda blodkroppar uppstår upprepar du detta steg.
- Centrifugera PRP-proverna vid 1 200 x g i 15 min vid RT.
- Tvätta trombocytpellets (P1) genom skonsam resuspension i 1 ml citrattvättbuffert och pellet genom centrifugering vid 1 200 x g i 15 min vid RT.
- Spara den rena trombocytpelleten. Kasta supernatanten.
- Resuspend trombocytkulorna i 600 μL av bristningsbufferten som innehåller inhibitorcocktails.
- Sonicate trombocytsuspensionen med hjälp av en sonicator. Placera provet i en miniishink. Ställ in ljudsitorn vid inställning 3 för 20 s i kontinuerligt läge.
OBS: Se till att rengöra sonden med 10% blekmedel följt av destillerat vatten. - Centrifugera de sonicerade proverna vid 20 000 x g i 30 min vid 4 °C för att avlägsna membranösa fraktioner. Aliquot supernatants i 60 μL och lagra på -80 °C. Undvik upprepade upptinings-/fryscykler för trombocytosolicfraktionerna.
3. Förberedelser för CEI
OBS: 100 μl av humantrombocytlysate kombinerades från ALS-patienter (n = 8–10) och friska försökspersoner (n = 8–10) samlades separat och användes för analysoptimeringen.
- Fyll i in-house genererade mallar för CEI layout(tabell 1)och provberedning(tabell 2). Provblandningsberedningstabellen är dynamisk och beräknar automatiskt hur mycket volym som behöver tas bort från källan.
OBS: När det krävs beräknas källvolymen i dynamisk tabell-2, 0,1 X exempelbuffertvolym automatiskt. - Förmärkande 25 0,2 ml PCR-rör med kapillärer #1-#25 och placera dem i ett PCR-rack. Ställ på is.
- Förmärkande 0,6 ml mikrocentrifugrör: ett för varje primär antikropp och utspädning (om det behövs) som ska användas, ett för provbufferten på 0,1 x, ett för luminol-S/peroxid, och ett för varje prov som ska spädas (om nödvändigt). Placera dem på is i rörställ.
- Ta ut provbufferten, tvättbufferten, en platta och en patron som finns i CEI-separationen 12–230 kDa master kit separationsmodul.
- Ur 4 °C-kylskåpet, ta ut antikroppsutspädningsbufferten, primära antikroppar, sekundära antikroppar, luminol, väteperoxid och standardförpackning. Placera alla reagenser på is, utom standardförpackningen, som finns kvar på RT.
OBS: Reagenser från standardförpackningarna är lyofiliserade och förseglade med ett folieskydd. Dessa bör snurras ner kort med hjälp av en mini centrifug innan du öppnar för att minska produktförlusten. För att öppna, reagensrör kan antingen genomborras av en pipett spets eller dras tillbaka från hörnet. - För att förbereda 400 mM DTT, tillsätt 40 μl avjoniserat vatten till det klara röret som innehåller DTT.
- För att förbereda 40 μl fluorescerande 5x-huvudblandning, tillsätt 20 μl av 10x provbufferten och 20 μL av den beredda 400 mM DTT-lösningen på det rosa röret som finns i satsen.
- För att förbereda den biotinylated stegen, tillsätt 16 μl avjoniserat vatten, 2 μL av 10x provbuffert och 2 μL av den beredda 400 mM DTT-lösningen till det vita röret som anges i satsen. Blanda försiktigt och överför till ett 0,2 ml PCR-rör för denaturing.
- Bered 0,1 x provbuffert genom tillsats av 1,5 μl 10x provbuffert och 148,5 μl avjoniserat vatten till ett mikrocentrifugrör på 0,6 ml. Vortex att blanda och placera på is.
- Förbered de önskade antikroppsutspädningarna. Tillsätt antikroppsspädning si varsvolymer som anges i varje förmärkt mikrocentrifugrör. Om volymerna är identiska, använd omvänd rörteknik23; om inte, förskölj pipettspetsen före dispensering.
OBS: I denna analys, a-TDP-43 pan antikroppar och a-p (S409/410-2) TDP-43 antikroppar användes. Anti-ERK-antikroppar användes för en intern kontroll för att se till att analyskomponenterna fungerar. - Utför den omvända pipettningen för antikroppsutspädning enligt beskrivningen nedan. Alternativt finns ytterligare information i litteraturen24.
OBS: Omvänd rörteknik är att föredra vid dispensering av små sekventiella volymer av lösningar23. Denna teknik ger vissa fördelar: (i) ger en exakt volym, (ii) eliminera reagens skumimet i spetsen öppningen, och (iii) idealisk för liten volym (<5 μL) reagenser, viskös lösningar, ytaktiva lösningar och lösningar med högt ångtryck.- Sätt en ordentlig spets i en pipett och tryck kolven ner till det andra stoppet (Steg-2). Sänk ner rörspetsen några millimeter i lösningen. Släpp långsamt kolven för att fylla upp pipspetsen med lösningen medan spetsen fortfarande är nedsänkt i lösningen. Ta bort spetsen från lösningen och tryck försiktigt mot kanten på reagensbehållaren så att överflödig vätska som finns kvar på spetsens utsida avlägsnas.
- Fördela lösningen genom att trycka kolven ner till första stoppet (Steg-1). Fördela inte den återstående lösningen i spetsen.
- Töm den återstående lösningen i spetsen till reagensbehållaren genom att trycka kolven till det andra stoppet (Steg-2). Släpp kolven till det färdiga läget för nästa pipettsteg.
- Tillsätt den antikropp som krävs i volymer som anges i varje förmärkt mikrocentrifugrör (tabell 1) Skölj inte rörspetsen för sköljer: lägg den direkt i spädningen och spola spetsen flera gånger för att ta bort antikroppen. Placera rören på isen.
- För att förbereda CEI-provmixen utför du stegen nedan för PCR-rör märkta lock #2 genom cap #25: Detta är i samma ordning som den visas i tabell 1.
- Öppna alla rör, tillsätt 1,6 μL alikvoter av fluorescerande 5x provbuffert till varje rör med hjälp av en omvänd rörteknik, stäng sedan varje PCR-rör vid tillsats av 5x buffert för att minimera provförlust.
- Öppna alla rör, lägg till 0,1 x provbuffert i volymer som anges i tabell 2 till varje rör och stäng sedan omedelbart efteråt. Om volymerna är identiska använder du en omvänd rörteknik. Om inte, förskölj rörspetsen innan du doserar 0,1 x provbuffert.
- Öppna alla rör, tillsätt proteinprov i volymer som anges i tabell 2 till varje rör och stäng sedan omedelbart efteråt. Om volymerna är identiska använder du omvänd rörteknik. Om inte, förskölj rörspetsen innan du doserar 0,1 x provbuffert.
- Kort centrifugera alla PCR-rör i en bänkskiva centrifug (13.000 x g för 30 s), flick / virvel PCR rör för att blanda, upprepa sedan centrifugering.
- Överför alla PCR-rör till termohjul med ett uppvärmt lock. Avnaturprover vid definierad temperatur och varaktighet (dvs. 95 °C i 5 min; 70 °C i 10 min).
OBS: Avnaturningstemperaturen och varaktigheten måste optimeras för målprotein. - Upprepa steg 3.12.4.
- Returnera alla PCR-rör till rörställ och placera på is.
- Under detafierande steget, förbered utvecklingslösningen (1:1 luminol-S:peroxidlösning), tillsätt sedan 200 μl luminol-S och 200 μL peroxid. Placera på is.
- För att ladda en CEI förfylld platta med provet som bereds ovan, fördela reagenser och prover i analysplattan som visas i analyslayouten(figur 1). Undvik att införa luftbubblor.
OBS: Om volymer och lösning är identiska, använd en omvänd pipettteknik. Om inte, förskölj rörspetsen innan du doserar och inte utvisar resten i plattan väl med hjälp av det andra tabbstoppet på pipetten. En separationsmodul på 12–230 kDa kan innehålla en färgkodad plattlastningsguide. Placera den här guiden under plattan samtidigt som du lägger till reagenser och prover i brunnen, vilket visuellt hjälper vid provlastning. Den plattan-lastning guide kan laddas ner från företagets hemsida, liksom.- I rad E, tillsätt 15 μl luminol:peroxid blandning till varje brunn.
OBS: Helst, förbereda denna reagens strax före användning och lägga till varje brunn. Om detta inte är bekvämt får denna blandning inte förberedas mer än 30 min före plattlastning. - I rad D, till väl D1, tillsätt 10 μL streptavidin-HRP.
- I rad D, till brunnar D2–D25, tillsätt 10 μL av angiven sekundär antikropp.
- I rad B, till varje brunn, tillsätt 10 μL antikroppsspädningsmedel.
- I rad C, till brunn C1, tillsätt 10 μL av antikroppsspädning.
- I rad C, till brunnar C2–C25, tillsätt 10 μl av den utsedda primära antikroppen.
- I rad A, till brunn A1, tillsätt 5 μL biotinylated stege från PCR-rör #1.
- I rad A, till brunnarA2–A25, tillsätt 3 μl av provet, pcr-rör #2-#25 till motsvarande brunnar #2–#25.
- Tillsätt 500 μl tvättbuffert till varje angiven tvättbuffert väl.
- Centrifugera plattan i 5 min vid 1000 x g vid RT.
- I rad E, tillsätt 15 μl luminol:peroxid blandning till varje brunn.
Bild 1: Analyslayout. Både primär antikropp och målproteinprovoptimering kan utföras i en analys. Kapillärerna 2–7, 8–13, 14–19 och 20–24 representerar olika proteinkoncentration och primärantikroppsområde. Kapillär 25 representerar positiv kontroll. Anti-ERK-antikroppar användes. All lämplig positiv kontroll kan dock inkluderas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Utförande av CEI på platta 1
- Slå först på CEI(Table of Materials)analysator, sedan slå på datorn. Öppna programvaran (Materialbord)
- Anslut analysatorn till online-systemet (Table of Materials). Detta är ett nödvändigt steg för att samla in kördata för felsökning och dataåterställning.
- Klicka på Instrumentet från menyn längst upp till vänster och klicka sedan på Anslut. Välj det serienummer som visas som en popup-meny. Klicka på Anslut.
- Välj fliken"Assay"och välj Ny analys eller välj en sparad mall.
- Indataanalysparametrar (tabell 1)eller ändra mall för närvarande. Spara filnamnet och platsen.
- Se till att den blinkande blå färgindikatorn i analysatorn förblir helblå.
- Tryck på silvermetallknappen ovanpå den orangea dörren för att öppna.
- Ta försiktigt bort kapillärpatronen från förpackningen. Sätt i kapillärkassetten enligt beskrivningen i tillverkarens protokoll. Om det är korrekt installerat, vrids innerljuset till "blå".
- Ta bort skyddstätningen från analysplattan. Observera de förfyllda brunnarna för luftbubblor visuellt. Om den observeras, pop dem med en liten pipet spets (Lång axel P10 pipet spets fungerar bra).
- Fyll på skylthållaren genom att placera analysplattan och stäng dörren. Klicka på Start-knappen i datorn.
- Placera isbrickan som innehåller temperaturkänsliga reagenser och prover i mörker vid 4 °C tills den är klar att förbereda andra förfyllda plattan.
- Lämna reagenser/förnödenheter ut i rumstemperatur för den andra plattan.
5. Utförande av CEI på platta 2
OBS: Denna platta är inställd för att analysera fosforylated TDP-43 nivåer.
- Ta bort isbrickan som förvaras vid 4 °C och placera den på bänken, 1 h före den beräknade slutföratiden för den första plattan. Hämta en andra platta och patron.
- Förbered eventuella antikroppsutspädningar som behövs för det andra åket och förvara dem på is. Förbered färsk 1:1 luminol-S:peroxidlösning (steg 3.12.8 ovan).
- Remixa och centrifugera provmixen och reagensen som behövs för att ladda den förfyllda plattan. Fyll på den andra plattan enligt figur 1. Ladda a-p (S409-410-2) TDP-43 antikroppslösning i rad C-brunnar.
- När den första körningen är klar kasserar du den första plattan och patronen. Ta bort patronen och placera i en skarp behållare för bortskaffande. Håll klistermärkena från plattan och patronen för referensändamål.
- Stäng programfilen och välj samma mall igen. Programvaran kommer ihåg inställningarna från föregående körning. Gör ändringar i anteckningen efter behov (dvs. ändra den primära antikroppen).
- Upprepa steg 4.8–4.10. Lägg undan alla 12–230 kDa master kit separationmodul reagenser och förnödenheter
- Kassera övertagna CEI-provmix, antikroppsutspädningar, 0,1 x provbuffert och luminol-S:peroxidblandningar i enlighet med universitetets föreskrifter.
6. Dataanalys
- När körningen är klar, se till att följande kvalitetskontroller utförs.
- I programvara väljer du ikonen Visa standarder och fliken Diagramvy. Kontrollera alla 25 kapillärerna för toppjusteringarna till interna lysrörsstorlekar. Korrigera feljusteringarna genom att välja Force Standard eller högerklicka på den felaktiga toppen och välj Inte en standard. Utför denna kontroll för varje ny kapillär.
- Klicka på Exempel och ikonen För enkel vy. Välj capillary #1 (biotinylated stege) i experimentfliken. Granska toppjusteringarna till molekylviktsmarkörer. Klicka på toppen i graph view och välj Ta bort topp, om ett felaktigt val av toppen görs av programvaran.
OBS: Som ett exempel visar 12–230 KDa biotinylated stege dimensionering toppar på 12 kDa, 40 kDa, 66 kDa, 116 kDa, 180 kDa och 230 kDa. Storleken på exempeltopparna är felaktig om det här steget inte utförs och genererar felaktiga resultat. - Visa den elektroforesiska filmen och notera om någon onormal migrering inträffade under körningen.
- Härleda data (t.ex. toppar tabellen, inklusive molekylvikt, toppyta, topphöjd och signal-till-brus [S/N]) efter behov för ytterligare beräkningar. Det finns diagramanteckningsverktyg som finns i det övre högra hörnet av diagramfönstret för att ge mer information om diagrammet.
Representative Results
Optimering av cytosolik proteinkoncentration och primär antikroppstitrering
Det är viktigt att upprätta ett linjärt dynamiskt omfång av trombocytosolic proteiner i analysen, eftersom förändringar i signal är direkt proportionella mot förändringar i protein i trombocytosol. Användning av hela trombocytlysate blandningen i analysen kan minska signalintensiteten i målproteiner (TDP-43 och P (S409-412) TDP-43) och bidra till en hög bakgrundssignal. Därför, i denna analys, den tydliga supernatant användes (cyklisk fraktion) efter rupturing trombocyter(figur 2).
Bild 2: Signalskärpa beror på provkvaliteten. a)Hela trombocytlysate homogenat stör anti-TDP-43 antikroppsbindning. därför observerades ett bullrigt elektropherogram. B)Trombocytosolic fraktion erhölls från att utsätta hela lysate till centrifugering (16.000 x g i 30 min). De flesta av membranous proteiner togs bort; därför förbättrades anti-TDP-43 antibody bindning till TDP-43 protein (blå linje spår). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ett linjärt dynamiskt omfång för trombocytosolproteinkoncentration fastställdes till 0,2–0,8 mg/ml. En analysmall antogs så att både proteinkoncentration och primär antikroppstitrering kunde utföras i en analys (figur 3).
Figur 3: Linjärt dynamiskt omfång för cytosolproteinkoncentration. (A)Både proteinkoncentrationer och antikroppstitreringar optimerades i en platta under samma körning. (B)Det linjära arbetsområdet (0,2–0,8 mg/ml) för protein fastställdes. En proteinbelastning på 0,5 mg/ml var märkt med a-ERK-antikroppar som den positiva kontrollen (kapillär 25). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det bör noteras att glycerolhalten i provberedningsröret bör vara mindre än 20 % (slutlig), annars kommer koncentrationen med hög glycerol att inverka negativt på den primära antikroppsbindningen.
Bestämma optimal exponeringstid
I den äldre versionen av programvaran måste den optimala exponeringstiden bestämmas genom att rita toppområde mot proteinkoncentration (mg/ml). Den nya versionen innehåller ett nytt verktyg som heter den höga dynamiska räckvidd (HDR) identifiering profil(Bild 4). Med hjälp av bildpanelen gav sett till att visa alla exponeringstider (dvs. 5 s, 15 s, 30 s, 60 s, 120 s, 240 s, 480 s) tillsammans. Datorprogram analyserade alla exponeringstider och identifierade automatiskt den bästa exponeringstiden (HDR). HDR-detektionsprofilen levererade ett betydligt bredare dynamiskt omfång på grund av CEI:s större känslighet, vilket innebär bättre detektering och kvantantal över ett större urvalskoncentrationsområde. Användare har dock fortfarande möjlighet att välja någon exponeringstid som uppfyller det experimentella målet. Med hjälp av den här funktionen hittades optimal exponeringstid för TDP-43 protein. Toppen representerar den optimala exponeringstiden(figur 4A). En enda exponeringstid (4 s) definierades för denna antikropp efter att ha granskat alla nio exponeringstiderna mellan 1–512 s(figur 4B).
Figur 4: HDR-detektionsprofil (High Dynamic Range) för ett målprotein. (A) TDP-43 proteintopp representerar den optimala exponeringstiden för målproteinet. a-TDP-43 Ab titrering var 1:300, och trombocytosol proteinkoncentrationen var 0,5 mg/ml. Den programvarudefinierade blå linjen anger den optimala exponeringstiden. (B)Denna siffra representerar en användardefinierad enkel exponeringstid (4 s) efter att ha granskat alla nio exponeringstider mellan 1–512 s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
TDP-43 nivåer hos cytosol hos ALS-patienter hos människa
En utveckling av biomarkör en blodbas utfördes. Med hjälp av optimerade analysförhållanden analyserades trombocytosolicfraktioner från ALS-patienter med hjälp av två uppsättningar antikroppar (dvs. anti-TDP-43 [Pan] antikroppar, en antikropp som känner igen fosforylerat derivat av TDP-43 protein; här användes a-P [S409/410-2] TDP-43). I denna demonstration presenteras sjukdomsspecifika TDP-43 och dess fosforerade derivat(figur 5).
Figur 5: En representation av prediktiv fosforyleringsvärde (PPV) för TDP-43. Absolut mängd fosforylated TDP-43 och pan TDP-43 ensam visade inte någon större skillnad mellan ALS och kontrollgrupper. PPV indikerade dock en liten ökning av ALS-kohorten, även om det inte fanns någon statistisk skillnad mellan de två grupperna på grund av otillräckligt antal försökspersoner (ALS = 25, kontroll = 27). Ett lågt Cohens d-värde mellan medlen för ALS och kontrollgrupp visade en låg effektstorlek mellan de två grupperna på grund av liten urvalsstorlek (kontroll = 25, ALS = 27). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Total TDP-43 kvantifierades med kalibreringskurvan (bild 6)
Bild 6: Standardkalibreringskurva. Kommersiellt köptrekombinant TDP-43 proteinkoncentrationer användes för att konstruera en standardkurva. Varje data representerar genomsnittet av triplicates. Proteinbandintensiteterna var koncentrationsberoende (Inset). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kvantifieringen av fosforylated TDP-43 protein var inte möjligt på grund av kommersiellt otillgänglighet av detta protein. Istället fastställdes ett förutspått fosforyleringsvärde (PPV) som definierar procenten av de fosforerade arterna i TDP-43. PPV bestämdes från två sekventiella CEI-analyser för samma prov med hjälp av följande ekvation.
Intra- och inter-run analys variabilitet testades i poolade mänskliga ALS trombocytosolic fraktioner(figur 7)
Figur 7: Analysvariationer. (A)Två kapillärer laddade med samma prov analyserades av CEI, och intra-run analys variation beräknades som CV% = 14,9. (B)Samma prov analyserades på tre olika analysdagar och i tre olika analyskörningar. Inter-run analys variation beräknades som CV% = 18,7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Även om det intra-run (kapillär-till-kapillär variation) koefficient variation värden sjönk i acceptabelt intervall (CV% = 14,9), inter-run analysvärdet var relativt hög (CV% = 18,7). Det tolkas att denna variation kan bero på användning av kapillärpatroner och provplåtar från olika partier. Reproducerbarhetsstudier bör utföras i CEI-komponenter som har samma partinummer.
Tabell 1: MALL för belastning av CEI-analysplattan. Klicka här för att ladda ner det här bordet.
Tabell 2: Interaktiv exempelblandningsberedningsmall. När du har angett lagerproteinkoncentrationen från okända prover kommer interaktiva celler automatiskt att beräkna hur mycket volym som behöver användas för att förbereda provmixen. Klicka här för att ladda ner det här bordet.
Discussion
Kapillärelektroforetisk-baserade immunassay är nu den metod för val för höggenomströmning provanalys och drogscreening25 . Små provvolymer, väloptimerade analyskomponenter, användarvänlig analysplattform och instrumentering, reagensutgifter och låg CV-procent är primära fördelar26,27. Även om det finns flera metoder för att separera proteiner i olika analysformeraliteter, kan den antikroppsbaserade CEI som beskrivs här anpassas av små laboratorier som är engagerade i blodbaserad biomarkörutveckling. Cei-analystekniken som används här ger tillförlitliga, reproducerbara och känsliga mätningar för TDP-4328 och dess fosforylated derivat5.
CEI-systemet ger också ett flerfaldigt val av att analysera TDP-43 och dess fosforylaterade derivat samtidigt och ger direkt kvantifiering av målproteinet, om renad eller rekombinant målprotein finns tillgängligt. Fulllängds rekombinant TDP-43 protein är kommersiellt tillgängligt; rekombinant fosforylated TDP-43 derivat är dock inte. Eftersom fosforylerat TDP-43 inte är kommersiellt tillgängligt genomfördes ett prediktivt fosforyleringsvärde (PPV) för att bedöma TDP-43-profilen hos ALS-patienter. Pan TDP-43 och fosforylated TDP-43 belopp var permanent märkta med en fluoroffor; TDP-43-profilen är därför densamma med eller utan en kvantitativ enhet (dvs. ng/mL, pg/mL osv.). Även om fastställandet av den absoluta mängden TDP-43 och dess fosforylated derivat (dvs. P [S409-410-12] TDP-43) ger en mer kvantitativ mätning, beräkna PPV eliminerar behovet av rekombinant fosforylated TDP-43 för standardisering, eftersom det inte är kommersiellt tillgänglig.
CEI tillhandahåller flera kontrollpunkter i analysplattformen för att korrekt identifiera problemet i händelse av att en analys misslyckas. Detta eliminerar hinder och ger bättre experimentell design. Analysförfarandet är helt automatiserat med undantag för fyllning av provplattan. Detta är en viktig funktion jämfört med standard västra blotting analys. Den här funktionen ger konsekvens från körning till körning. Även om varje laboratorium har unika standardrutiner är det viktigt att följa metoder som minimerar mänskliga fel. Till exempel är det viktigt att förbereda luminol-S/peroxid blandningen strax före plattlastning, eftersom tillsats av peroxid i luminol startar enzymatisk reaktion och förbrukar luminol substrat. Lastning prover och primära / sekundära antikroppar i plattan brunnar utan luftbubblor är också kritiskt viktiga steg.
Dessutom, eftersom plattan brunnar är små i volym och det finns inget utrymme mellan brunnar, användare bör vara försiktig medan pipetting, vilket är det viktigaste steget eftersom allt annat är automatiserat. Belastningsordningen för proverna, antikropparna och andra reagenser är viktig för analysens konsistens(figur 1). Processen för plattberedning tar ca 40–45 min. Därför rekommenderas att först ladda plattan med de nödvändiga analyskomponenterna och förbereda luminol-S/peroxidblandningen strax före rörledningar. På så sätt finns det en konsekvent sekvens av reagens lägga till, och konsekvent luminescens signalstyrka kommer att uppnås. Det rekommenderas inte att använda ett utgånget luminol-S/peroxidreagens, eftersom det i första hand påverkar peroxidens styrka. Den senaste tidens framsteg när det gäller att införa systemet med delad buffert och inklusive det kemiska och tvättmedelskompatibilitetsområdet har förbättrat analyskvaliteten och gett mer reproducerbara och förutsägbara resultat. Nu har en ny combo-analysator från samma tillverkare en funktion för att analysera de prover märkta med chemiluminescence och fluorescens konjugerat antikroppar i samma körning. Den här nya funktionen eliminerar behovet av att köra två enskilda plattor i följd och eliminerar run-to-run variation.
Analysplattorna ska förvaras i omgivningstemperatur. Om det väljs för att hålla analysplattorna i ett kylskåp på 4 °C, skall plattorna tas ut natten före analysen och föras till omgivningstemperaturen. Felaktigt belastade provbrunnar måste tvättas i stor utsträckning (4–5 gånger) med buffert som medföljer i satsen innan du lägger till rätt prov. Varje primär antikropp och biologiska prover är unika; därför bör antikropps-/proteinoptimering utföras innan proverna för målproteiner i biologiska vätskor analyseras.
Här var den primära antikroppsinkubationstiden inställd på 30 min som standard. Om signalen är svag bör användarna överväga att öka den primära antikroppsinkubationstiden tills den önskade signalstyrkan når önskad signalstyrka utan utbrändhetssignal. För humana blodplättar, poolade prover från patienter utarbetades och används för en optimering analys. Provsammanslagningen representerar bättre variationen bland målbiomolekyler. Det rekommenderas att använda tydliga supernatanter snarare än total lysning eller total homogenat för CEI.
Den höga koncentrationen av protein i hela trombocytlysateblandningen kan minska signal-brusförhållandet (figur 2). Upprepade frys-tina cykler av prover bör undvikas, eftersom detta negativt påverkar primära antikroppar bindande. Ingredienserna i lysatebufferten är viktiga, eftersom vissa reagenser inte är kompatibla med CEI29. Det rekommenderas att dubbelkolla listan över kompatibla reagenser som tillhandahålls på tillverkarens webbplats före provberedning. Detta är en begränsning av systemet som inte tolererar höga stringensvillkor för provberedning. Det rekommenderas att optimera analyskörningsparametrarna (dvs. primär antikroppsutspädning, proteinkoncentration, primär inkubationstid för antikroppar osv.) med hjälp av poolade prover för att därefter analysera de enskilda proverna.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiskt intresse utom ProteinSimple, Inc. täckte publiceringskostnaden för detta manuskript.
Acknowledgments
Denna forskning sponsrades av en intramural bidrag som utfärdas för A.A. Detta arbete stöddes av ett CTSA-bidrag från NCATS som tilldelades University of Kansas Medical Center for Frontiers: The Heartland Institute for Clinical and Translational Research (#UL1TR606381). Innehållet är endast författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis NIH eller NCATS officiella åsikter. Vi är tacksamma för University of Kansas Medical Center ALS klinik personlig för att få IRB godkännande för blodprov insamling från friska volontär och ALS patienter. Författarna tackar Emre Agbas för korrekturläsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-230 kDa Separation kit | ProteinSimple | SM-W004 | Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge |
| 3000G Thermocycler | Techne | FTC3G/02 | We used this thermocylcer for heating the sample mix |
| Anti-Mouse detection kit | ProteinSimple | 042-205 | Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker |
| Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody | ProteinTech | 22309-1-AP | Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43 |
| Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody | CosmoBio-USA | TIP-PTD-P02 | Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43 |
| Anti-Rabbit detection kit | ProteinSimple | DM-001 | Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker |
| Anti-TDP-43 (pan) antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein |
| Compass for SimpleWestern (SW) | ProteinSimple | Ver.4.0.0. | Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments |
| Sonic Dismembrator; Model100 | Fisher Scientific | Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350) | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 22625004 | Model# 5810 with swinging plate bucket |
| Wes analyzer | ProteinSimple | 55892-WS-2203 | Performs the capillary gel electrophoresis |
References
- Blair, P., Flaumenhaft, R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates. Blood Reviews. 23 (4), 177-189 (2009).
- Mercado, C. P., Kilic, F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels. Molecular Interventions. 10 (4), 231-241 (2010).
- Goubau, C., et al. Regulated granule trafficking in platelets and neurons: a common molecular machinery. European Journal of Paediatric Neurology. 17 (2), 117-125 (2013).
- Basu, S. S., et al. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Wilhite, R., et al. Platelet phosphorylated TDP-43: an exploratory study for a peripheral surrogate biomarker development for Alzheimer's disease. Future Science OA. 3 (4), 238 (2017).
- Worth, A. J., et al. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. Journal of Visualized Experiments. (110), e53941 (2016).
- Statland, J. M., et al. Rasagiline for amyotrophic lateral sclerosis: A randomized, controlled trial. Muscle and Nerve. 59 (2), 201-207 (2019).
- Charytan, D. M., et al. Safety and cardiovascular efficacy of spironolactone in dialysis-dependent ESRD (SPin-D): a randomized, placebo-controlled, multiple dosage trial. Kidney International. 95 (4), 973-982 (2019).
- Ugras, S. E., Shorter, J. RNA-Binding Proteins in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Neurodegeneration. Neurology Research International. , 432780 (2012).
- Amador-Ortiz, C., et al. TDP-43 immunoreactivity in hippocampal sclerosis and Alzheimer's disease. Annal of Neurology. 61 (5), 435-445 (2007).
- Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3539-3549 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration. Advances in Genetics. 66, 1-34 (2009).
- Guo, W., et al. An ALS-associated mutation affecting TDP-43 enhances protein aggregation, fibril formation and neurotoxicity. Nature Structural Molecular Biology. 18 (7), 822-830 (2011).
- Geser, F., et al. Motor neuron disease clinically limited to the lower motor neuron is a diffuse TDP-43 proteinopathy. Acta Neuropathologica. 121 (4), 509-517 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Buratti, E., Baralle, F. E. TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions. Trends in Biochemical Sciences. 37 (6), 237-247 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. The ALS disease protein TDP-43 is actively transported in motor neuron axons and regulates axon outgrowth. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3703-3718 (2012).
- Ayala, Y. M., et al. Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43. Journal of Cell Sciences. 121, Pt 22 3778-3785 (2008).
- Fiesel, F. C., Kahle, P. J. TDP-43 and FUS/TLS: cellular functions and implications for neurodegeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3550-3568 (2011).
- Birsa, N., Bentham, M. P., Fratta, P. Cytoplasmic functions of TDP-43 and FUS and their role in ALS. Seminars in Cell and Development Biology. , (2019).
- Liachko, N. F., et al. CDC7 inhibition blocks pathological TDP-43 phosphorylation and neurodegeneration. Annals of Neurology. 74 (1), 39-52 (2013).
- Qureshi, A. H., et al. Proteomic and phospho-proteomic profile of human platelets in basal, resting state: insights into integrin signaling. PLoS One. 4 (10), 7627 (2009).
- Suominen, I., Koivisto, S. Increasing Precision When Pipetting Protein Samples: Assessing Reliability of the Reverse Pipetting Technique. American Laboratory. , (2011).
- Pipetting tool box for life sciences. , https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html (2019).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communication. 9 (1), 5167 (2018).
- Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. Journal of Translational Medicine. 13, 182 (2015).
- Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
- Fourier, A., et al. Development of an automated capillary nano-immunoassay-Simple Western assay-to quantify total TDP43 protein in human platelet samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 267-275 (2019).
- Compatibility, S.W.S.A.B. , https://www.proteinsimple.com/technical_library.html (2017).
