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Neuroscience

मानव प्लेटलेट्स में एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस के संभावित बायोमार्कर की खोज के लिए केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस इम्यूनोसे का उपयोग

Published: February 10, 2020 doi: 10.3791/60638
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 3, 3, 1
1Department of Basic Sciences, Kansas City University of Medicine and Biosciences, 2Rice University School of Medicine, 3University of Kansas Medical Center

Summary

बड़े पैमाने पर नैदानिक अध्ययनों को लागू करने के लिए न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए रक्त आधारित बायोमार्कर आवश्यक हैं। एक विश्वसनीय और मान्य रक्त परीक्षण के लिए एक छोटे से नमूना मात्रा के साथ-साथ एक कम आक्रामक नमूना विधि, सस्ती और प्रजनन योग्य होना चाहिए। यह पेपर दर्शाता है कि उच्च-थ्रूपुट केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस इम्यूनोसे संभावित बायोमार्कर विकास के लिए मानदंडों को संतुष्ट करता है।

Abstract

केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस इम्यूनोसे (सीईआई), जिसे केशिका पश्चिमी प्रौद्योगिकी के रूप में भी जाना जाता है, नैदानिक परीक्षणों में रोग प्रासंगिक प्रोटीन और दवाओं की स्क्रीनिंग के लिए पसंद की एक विधि बनता जा रहा है। प्रजनन क्षमता, संवेदनशीलता, छोटे नमूना मात्रा की आवश्यकता, एक ही नमूने में कई प्रोटीन लेबलिंग के लिए मल्टीप्लेक्सिंग एंटीबॉडी, 24 व्यक्तिगत नमूनों का विश्लेषण करने की स्वचालित उच्च-थ्रूपुट क्षमता, और कम समय की आवश्यकता सीईआई बनाती है शास्त्रीय पश्चिमी दाग इम्यूनोअसे पर लाभप्रद। इस विधि की कुछ सीमाएं हैं, जैसे कि ढाल जेल (4%-20%) का उपयोग करने में असमर्थता मैट्रिक्स, अपरिष्कृत जैविक नमूनों के साथ उच्च पृष्ठभूमि, और व्यक्तिगत अभिकर्मकों की वाणिज्यिक अनुपलब्धता। यह पेपर एक बहु परख सेटिंग में सीईआई चलाने, एक परख प्लेट में प्रोटीन एकाग्रता और प्राथमिक एंटीबॉडी टिट्रेशन को अनुकूलित करने और नमूना तैयारकरने के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल टेम्पलेट्स प्रदान करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा वर्णित है कि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए रक्त आधारित बायोमार्कर विकास में पहल के हिस्से के रूप में प्लेटलेट लाइसेट साइटोसोल में पैन टीडीपी-४३ और फॉस्फोरेटेड टीडीपी-४३ व्युत्पन्न को मापने के तरीके हैं ।

Introduction

सीईआई का समग्र लक्ष्य मानव प्लेटलेट्स में लक्ष्य प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक अद्यतन स्टेपवाइज प्रोटोकॉल प्रदान करना है। रक्त आधारित हस्ताक्षर अणु का असाइनमेंट अल्जाइमर रोग (विज्ञापन), एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस (एएलएस), फ्रंटोटेम्पोरल लोबर जैसे मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में बायोमार्कर विकास के क्षेत्र में सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक है। पतन (FTLD), पार्किंसंस रोग (पीडी), शामिल शरीर myositis (आईबीएम), और अन्य प्रोटीन एकत्रीकरण प्रासंगिक पैथोलॉजिकल स्थितियां। कई हस्तक्षेप एजेंटों के साथ रक्त की बड़ी मात्रा में इस तरह के हस्ताक्षर प्रोटीन की मिनट मात्रा का पता लगाना एक चुनौती है । इसलिए, बड़ी संख्या में नमूनों को संभालने की विशिष्टता, संवेदनशीलता, क्षमता और चयनित विधि की प्रजनन क्षमता महत्वपूर्ण है।

मानव प्लेटलेट्स न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के लिए संभावित बायोमार्कर प्रोटीन की पहचान करने और असाइन करने के लिए एक परिवेश के रूप में काम कर सकते हैं। प्लेटलेट्स एक सरोगेट प्राथमिक सेल मॉडल के रूप में सेवा करने का अवसर प्रदान करते हैं, जो न्यूरोनल कोशिकाओंकीकुछ विशेषताओं को प्रतिबिंबित करता है1,2,3। कुछ विशेषताएं हैं जो प्लेटलेट्स को बायोमार्कर उम्मीदवार प्रोटीन और उनके रासायनिक डेरिवेटिव का विश्लेषण करने के लिए पसंदीदा साधनों में से एक बनाती हैं। सबसे पहले, प्लेटलेट्स आसानी से दाताओं (यानी, veniपंक्चर) या समुदाय के रक्त बैंकों से बड़ी मात्रा में से रक्त एकत्र करके एक कम आक्रामक दृष्टिकोण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । दूसरा, प्लेटलेट्स को न्यूनतम सुसज्जित प्रयोगशालाओं4,5में न्यूनतम प्रारंभिक कार्य के साथ पूरे रक्त से आसानी से अलग किया जा सकता है। तीसरा, प्लेटलेट्स में नाभिक नहीं होता है; इसलिए, वे प्रतिलेखन विनियमन के बिना चयापचय में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल सेल हैं। चौथा, प्लेटलेट्स की जैव अणु सामग्री को समझाया जाता है; इसलिए, प्लेटलेट माइक्रोएनवायरमेंट सीरम-इंटरफेइंग पदार्थों (यानी, प्रोटीज़) से इसकी सामग्री की रक्षा करता है। पांचवां, प्लेटलेट-समृद्ध प्लाज्मा मेटाबोलिक गतिविधि खोने के बिना 7-8 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। इसलिए प्लेटलेट्स एक वर्किंग मॉडल प्रदान करते हैं जिसमें बाहरी कारकों को कम और नियंत्रित किया जाता है।

इम्यूनोअसे तकनीक जैसे इम्यूनोलोटिंग (जैसे, वेस्टर्न ब्लॉटिंग) और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) का विशिष्ट प्रोटीन विश्लेषण में अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन दो तरीकों में कई परख के कदम, खतरनाक रसायनों और अभिकर्मकों की आवश्यकता, बड़े नमूना आकार, परख प्रजनन क्षमता के साथ मुद्दों, और अंतर-संचालित डेटा वेरिएबिलिटी सहित कई नुकसान हैं। ये एक विधि है कि कम कदम और एक अपेक्षाकृत कम अवधि में प्राप्त करने के साथ सरल है के विकास के लिए प्रेरित किया । हालांकि शास्त्रीय पश्चिमी दाग तकनीक एक लोकप्रिय प्रयोगशाला विधि रहेगी, इसकी बहु-चरण प्रक्रिया, आपूर्ति, विषाक्त अपशिष्ट (यानी, एक्रिलामाइड, मेथनॉल, आदि) और परख का समय उच्च-थ्रूपुट मात्रात्मक प्रदर्शन करते समय कम वांछनीय होता जा रहा है प्रोटीन विश्लेषण।

एक स्वचालित सीईआई दृष्टिकोण धीरे-धीरे प्रयोगशालाओं के लिए पसंद की एक विधि बनता जा रहा है जो उच्च थ्रूपुट प्रोटीन परख6का संचालन करते हैं। सीईआई जैल, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण, झिल्ली, इलेक्ट्रोफोरेसिस और इलेक्ट्रो-ट्रांसफर उपकरणों और अधिक भौतिक हैंडलिंग भागीदारी की आवश्यकता को समाप्त करता है। यदि अच्छी तरह से डिज़ाइन किया गया है, तो सीईआई परख लगभग 3.5 घंटे के भीतर पूरी की जानी चाहिए, जिसमें मात्रात्मक डेटा विश्लेषण, प्रकाशन गुणवत्ता इलेक्ट्रोप्रोग्राम और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ रेखांकन शामिल हैं। सीईआई प्रणाली की एक और श्रेष्ठता 10x-20x कम प्रोटीन एकाग्रता की आवश्यकता है, जिससे यह नैदानिकपरीक्षणों7,8में उपयोग किए जाने वाले मानव नमूनों में उपयोग के लिए आदर्श है।

सीईआई का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा विभिन्न विक्रेताओं से खरीदे गए प्रत्येक एंटीबॉडी, एंटीबॉडी (मोनोक्लोनल बनाम पॉलीक्लोनल), इष्टतम प्रोटीन सांद्रता, नमूना तैयारी, नमूना निंदा तापमान, और केशिकाओं पर लागू इलेक्ट्रोफोरेसिस वोल्टेज के लिए परख की स्थिति का अनुकूलन कर रहा है। हमने सीईआई के लिए एक एकल परख प्रारूप अनुकूलन विधि विकसित की है जिसे किसी भी नए परख से पहले लागू किया जाना चाहिए, जिससे समय और संसाधनों की बचत होगी । इस अनुकूलन कदम के बाद ट्रांसएक्टिवेशन रिस्पांस डीएनए/आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (TARDP) के कुल और फॉस्फोरीेटेड डेरिवेटिव दोनों का स्वचालित मात्रात्मक आकलन किया जाता है । इसके आकार (43 केडीए) के कारण इस पूरे पेपर में परिवर्णी शब्द टीडीपी-43 का इस्तेमाल किया जाएगा। यहां, एएलएस रोगियों से प्राप्त मानव प्लेटलेट लाइसेट में टीडीपी-43 प्रोटीन का आकलन किया जाता है ताकि संभावित शकुन बायोमार्कर के रूप में भविष्य कहनेवाला फॉस्फोरिलाइजेशन वैल्यू (पीपीवी) विकसित करने में मदद मिल सके।

टीडीपी-43 एएलएस के लिए एक नया संभावित रोग बायोमार्कर उम्मीदवार है। टीडीपी-43 सभी नाभिक कोशिकाओं में एक सर्वव्यापी प्रोटीन है; इसलिए, विभिन्न सामान्य सेलुलर घटनाओं के दौरान और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में टीडीपी-43 के कार्यों की जांच9,10,11,12,13,14की गई है। यद्यपि टीडीपी -43 एक परमाणु प्रोटीन15है , लेकिन परमाणु स्थानीयकरण और परमाणु निर्यात दृश्यों16, 17,18,19की उपस्थिति के कारण इसमें नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच और बाहर शटल करने की क्षमता है । साइटोप्लाज्मिक टीडीपी-43 विभिन्न सेलुलर घटनाओं में शामिल है, जैसे एमआरएनए स्थिरता और परिवहन, तनाव प्रतिक्रिया, माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन, ऑटोफागोसोम20। हालांकि, न्यूरोडीजेनेरेटिव डिजीज21के रोगजनकों में उनकी भागीदारी के अलावा टीडीपी-43 के फॉस्फोरीडेटिव डेरिवेटिव्स की भूमिका के बारे में ज्यादा जानकारी नहीं है।

यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि सीईआई दृष्टिकोण का उपयोग करके टीडीपी-43 की सामग्री और प्लेटलेट्स में इसके फॉस्फोरोरिलेटेड डेरिवेटिव का विश्लेषण करने के लिए परख की शर्तों को कैसे अनुकूलित किया जाए। चूंकि फॉस्फोरीटेड टीडीपी-43 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, इसलिए एएलएस रोगियों में टीडीपी-43 प्रोफाइल का आकलन करने के लिए भविष्य कहनेवाला फॉस्फोरिलेशन वैल्यू (पीपीवी) का उपयोग करने का प्रस्ताव है। यह सीईआई सिस्टम नमूना मिश्रण (2.5-3.0 माइक्रोन प्रति केशिका) की एक छोटी मात्रा का उपयोग करता है। कुल परख की मात्रा सेट-अप निर्माता के प्रोटोकॉल के आधार पर प्रति केशिका 8.0 माइक्रोन है; इसलिए, शोधकर्ता दो अलग-अलग रन के लिए एक नमूना मिश्रण तैयारी का उपयोग कर सकते हैं। निर्माता ने परख प्रोटोकॉल डिजाइन किया ताकि किसी भी पाइपिंग त्रुटियों को कम किया जा सके, यदि पूरी तरह से समाप्त नहीं किया जाता है। 24 व्यक्तिगत मानव प्लेटलेट लाइसेट नमूना मिश्रण को आधे वॉल्यूम (यानी, 2.5-3.0 माइक्रोन प्रति नमूना) में विभाजित किया जाता है और ~ 7 घंटे के भीतर दो अलग-अलग एंटीबॉडी द्वारा लगातार विश्लेषण किया जाता है। सीईआई प्रणाली यहां वर्णित एक वांछनीय उच्च थ्रूपुट परख तौर-तरीके प्रदान करता है । उपयोगकर्ताओं को बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग करने से पहले विभिन्न विक्रेताओं और लक्ष्य प्रोटीन के लिए नमूना तैयारी के तौर-तरीकों का परीक्षण करने की आवश्यकता है ।

Protocol

मानव प्लेटलेट्स के प्रसंस्करण से संबंधित सभी प्रोटोकॉल कंसास मेडिकल सेंटर और कंसास सिटी यूनिवर्सिटी ऑफ मेडिसिन एंड बायोसाइंसेज आईआरबी समितियों दोनों के दिशा-निर्देशों का पालन करते हैं।

1. बफ़र्स और अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: निर्माता के दिशा-निर्देशों के अनुसार सभी नमूने तैयार करें। इस प्रक्रिया के दौरान व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और चश्मे) पहनें।

  1. 0.941 ग्राम सुक्रोज (11 एमएम अंतिम एकाग्रता), 5 एम एनएसीएल (128 एमएम फाइनल), 0.2 एम एनएएच2पीओ4 (4.3 मीटर) के 5.4 एमएल के संयोजन से सिट्रेट वॉश बफर तैयार करें एम फाइनल), 0.2 एम एनए2एफओएफए4 (7.5 एमएम फाइनल), 0.352 ग्राम सोडियम साइटेट (4.8 एमएम फाइनल) का 9.4 एमएल, और 0.115 ग्राम साइट्रिक एसिड (2.4 एमएम फाइनल)। 0.45 माइक्रोन फिल्टर डिस्क के माध्यम से डीडीएच2ओ फ़िल्टर के साथ कुल मात्रा को 250 मीटर तक समायोजित करें और पीएच को 6.5 में समायोजित करें। 1 साल तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 22का उपयोग करने से पहले समाधान कक्ष तापमान (आरटी) लाओ ।
  2. 100 एमएम फाइनल वॉल्यूम में 250 एमएम सुक्रोज, 1 एमएम ईटीए और 10 एमएम ट्रिस-सीएल (पीएच 7.4) के संयोजन से टूटना बफर तैयार करें। 1 साल तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फॉस्फेटेज अवरोधक कॉकटेल (1:1000 फाइनल) और 1 माइक्रोन ऑफ प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल (1:2000 फाइनल) के 2 माइक्रोन को टूटना बफर के 2 mL में जोड़ें। उपयोग तक बर्फ पर रखें। अप्रयुक्त टूटना बफर को त्यागें।

2. प्लेटलेट अलगाव

  1. येलो-कैप रक्त संग्रह ट्यूब में 8-10 मीटर मानव रक्त एकत्र करें जिसमें एसिड-साइट्रेट-डेक्सट्रोस (एसीडी) समाधान (75 एम ट्राइसोडियम सिट्रेट, 124 एमएम डेक्सट्रोस, और 38 एम मीटर साइट्रिक एसिड, पीएच = 7.4; एसीडी: रक्त = 1:9)। ट्यूब सामग्री को धीरे-धीरे हाथ से 5x-6x उलटा मिलाएं।
  2. आरटी में 20 मिन के लिए एक झूल बाल्टी रोटर में २०० x ग्राम पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र ।
  3. प्लेटलेट से भरपूर प्लाज्मा (पीआरपी) (~ 3-4 मिलीएल) को 15 मिलील शंकुनीचे ट्यूब में एकत्र करें और संदूषण से बचने के लिए बफी कोट (धुंधला दिखने वाला अंश) से पीआरपी का लगभग 0.5 मिलील छोड़ दें। यदि कोई लाल रक्त कोशिका संदूषण होता है, तो इस कदम को दोहराएं।
  4. आरटी में 15 मिन के लिए 1,200 x ग्राम पर पीआरपी नमूने अपकेंद्रित्र।
  5. सीटी पर 15 मिन के लिए 1,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा सिट्रेट वॉश बफर और पैलेट के 1 mL में कोमल रिस्पेंशन द्वारा प्लेटलेट छर्रों (पी 1) को धोएं।
  6. शुद्ध प्लेटलेट गोली बचाओ। अधिस्थान त्यागें।
  7. अवरोधक कॉकटेल युक्त टूटना बफर के 600 μL में प्लेटलेट छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  8. सोनिकेटर का उपयोग करके प्लेटलेट निलंबन को सोनीकेट करें। नमूने को एक मिनी आइस बकेट में रखें। लगातार मोड में 20 एस के लिए 3 सेट करने पर सोनिकेटर सेट करें।
    नोट: आसुत पानी के बाद 10% ब्लीच के साथ जांच को साफ करना सुनिश्चित करें।
  9. झिल्लीदार अंशों को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर ध्वनियुक्त नमूने को केंद्रित करें। 60 माइक्रोन में एलिकोट सुपरनेटेंट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्लेटलेट साइटोसोलिक अंशों के लिए बार-बार विगलन/फ्रीजिंग चक्र से बचें।

3. सीईआई के लिए तैयारी

नोट: मानव प्लेटलेट लिसेट के 100 माइक्रोन को एएलएस रोगियों (एन = 8-10) से जोड़ा गया था, और स्वस्थ विषयों (एन = 8-10) को अलग से पूल किया गया था और परख अनुकूलन के लिए उपयोग किया गया था।

  1. सीईआई लेआउट(टेबल 1)और नमूना तैयारी(तालिका 2)के लिए इन-हाउस जनित टेम्पलेट्स भरें। नमूना मिश्रण तैयारकरने की तालिका गतिशील है और स्वचालित रूप से गणना करेगी कि स्रोत से कितनी मात्रा को हटाने की आवश्यकता है।
    नोट: जब गतिशील तालिका-2 में दर्ज आवश्यक स्रोत मात्रा, 0.1 एक्स नमूना बफर वॉल्यूम स्वचालित रूप से गणना की जाएगी।
  2. प्री-लेबल 25 0.2 मिलीएम पीसीआर ट्यूब केशिकाओं के साथ #1-#25 और उन्हें पीसीआर रैक में रखें। बर्फ पर सेट करें।
  3. प्री-लेबल 0.6 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब: प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी और कमजोर पड़ने के लिए एक (यदि आवश्यक हो) का उपयोग किया जाना है, 0.1x नमूना बफर के लिए एक, ल्यूमिनॉल-एस/पेरोक्साइड के लिए एक, और प्रत्येक नमूने के लिए एक पतला होने के लिए (यदि आवश्यक हो)। उन्हें ट्यूब रैक में बर्फ पर रखें।
  4. सीईआई सेपरेशन 12-230 केडीए मास्टर किट सेपरेशन मॉड्यूल में दिए गए सैंपल बफर, वॉश बफर, एक प्लेट और कारतूस को बाहर निकालें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर, प्राइमरी एंटीबॉडी, सेकेंडरी एंटीबॉडी, ल्यूमिनॉल, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और स्टैंडर्ड पैक को बाहर निकाल लें। मानक पैक को छोड़कर, सभी अभिकर्मकों को बर्फ पर रखें, जो आरटी में रहता है।
    नोट: मानक पैक से अभिकर्मकों lyophilized और एक पन्नी कवर के साथ सील कर रहे हैं । उत्पाद हानि को कम करने के लिए खोलने से पहले एक मिनी अपकेंद्री का उपयोग करके इन्हें संक्षेप में नीचे घूमती होनी चाहिए। खोलने के लिए, अभिकर्मक ट्यूबों को या तो पिपेट टिप से छेदा जा सकता है या कोने से वापस खींच लिया जा सकता है।
  6. 400 एमएम डीटीटी तैयार करने के लिए, डीटीटी युक्त स्पष्ट ट्यूब में 40 माइक्रोनयुक्त पानी जोड़ें।
  7. फ्लोरोसेंट 5x मास्टर मिक्स के 40 माइक्रोन तैयार करने के लिए, किट में प्रदान की गई गुलाबी ट्यूब के लिए तैयार 400 मीटर डीटीटी समाधान के 10x नमूना बफर के 20 माइक्रोन और 20 माइक्रोन जोड़ें।
  8. बायोटिनेटेड सीढ़ी तैयार करने के लिए, किट में प्रदान की गई सफेद ट्यूब के लिए तैयार 400 मीटर डीटीटी समाधान के 16 माइक्रोन, 10x नमूना बफर के 2 माइक्रोन और 2 माइक्रोन जोड़ें। धीरे-धीरे मिलाएं और निंदा के लिए 0.2 मिलीएल पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  9. 0.6 मीटर माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में 10x नमूना बफर के 1.5 माइक्रोन और डिओनाइज्ड पानी के 148.5 माइक्रोन जोड़कर 0.1 x नमूना बफर तैयार करें। भंवर मिश्रण और बर्फ पर जगह है।
  10. वांछित एंटीबॉडी कमजोरहोने को तैयार करें। प्रत्येक पूर्व लेबल माइक्रो-अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए नामित मात्रा में एंटीबॉडी डिल्यूंट जोड़ें। यदि मात्रा समान हैं, तो रिवर्स पाइपिंग तकनीक का उपयोगकरें 23; यदि नहीं, तो वितरण से पहले पिपेट टिप को पूर्व-कुल्ला करें।
    नोट: इस परख में, ए-TDP-४३ पैन एंटीबॉडी और ए-पी (S409/410-2) TDP-४३ एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया । एंटी-ईर्क एंटीबॉडी का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि परख घटक काम कर रहे हैं।
  11. नीचे वर्णित एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए रिवर्स पाइपिंग करें। वैकल्पिक रूप से, अतिरिक्त जानकारी24साहित्य में पाया जा सकता है ।
    नोट: समाधान23के छोटे अनुक्रमिक मात्रा का वितरण करते समय रिवर्स पाइपिंग तकनीक पसंद की जाती है । यह तकनीक कुछ फायदे प्रदान करती है: (i) एक सटीक मात्रा प्रदान करती है, (ii) टिप छिद्र में रिएजेंट फोमिंग को नष्ट करना, और (iii) छोटी मात्रा (<5 μL) रिएजेंट्स, चिपचिपा समाधान, सर्फेक्टेंट समाधान और उच्च वाष्प दबाव वाले समाधानों के लिए आदर्श।
    1. एक पिपेट में एक उचित टिप रखो और दूसरे पड़ाव (चरण-2) के लिए नीचे प्लंजर प्रेस । पिपेट टिप को कुछ मिलीमीटर को समाधान में विसर्जित करें। धीरे-धीरे समाधान के साथ पिपेट टिप को भरने के लिए प्लंजर जारी करें जबकि टिप अभी भी समाधान में डूबी हुई है। समाधान से टिप निकालें और धीरे-धीरे अभिएजेंट जलाशय के किनारे के खिलाफ स्पर्श करें ताकि टिप के बाहर पर शेष अतिरिक्त तरल हटा दिया जाए।
    2. पहले स्टॉप (स्टेप-1) के नीचे प्लंजर दबाकर समाधान बांटें। टिप में बचे हुए घोल को न बांटें।
    3. टिप में बचे हुए घोल को दूसरे स्टॉप (स्टेप-2) में प्लंजर दबाकर रिएजेंट जलाशय में खाली कर दें। अगले पाइपिंग चरण के लिए तैयार स्थिति के लिए प्लंजर जारी करें।
    4. प्रत्येक पूर्व लेबल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब(टेबल 1)के लिए नामित मात्रा में आवश्यक एंटीबॉडी जोड़ें पिपेट टिप को पहले से न कुल्ला करें: इसे सीधे डिल्यूंट में जोड़ें और एंटीबॉडी को हटाने के लिए टिप को कई बार फ्लश करें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
  12. सीईआई नमूना-मिश्रण तैयार करने के लिए, कैप #25 के माध्यम से कैप #2 लेबल वाली पीसीआर ट्यूबों के लिए नीचे सूचीबद्ध चरणों का प्रदर्शन करें: यह उसी क्रम में है जैसा कि तालिका 1में दिखाई देता है।
    1. सभी ट्यूब खोलें, रिवर्स पाइपिंग तकनीक का उपयोग करके प्रत्येक ट्यूब में फ्लोरोसेंट 5x नमूना बफर के 1.6 माइक्रोन एलिकोट जोड़ें, फिर नमूना हानि को कम करने के लिए 5x बफर के अलावा प्रत्येक पीसीआर ट्यूब को बंद करें।
    2. सभी ट्यूब खोलें, प्रत्येक ट्यूब के लिए तालिका 2 में नामित संस्करणों में 0.1 x नमूना बफर जोड़ें, फिर तुरंत बाद बंद करें। यदि मात्रा समान हैं, तो रिवर्स पाइपिंग तकनीक का उपयोग करें। यदि नहीं, तो 0.1 x नमूना बफर वितरित करने से पहले प्री-कुल्ला पाइप्ट टिप।
    3. सभी ट्यूब खोलें, प्रत्येक ट्यूब के लिए तालिका 2 में नामित मात्रा में प्रोटीन नमूना जोड़ें, फिर तुरंत बाद बंद करें। यदि मात्रा समान हैं, तो रिवर्स पाइपिंग तकनीक का उपयोग करें। यदि नहीं, तो 0.1 x नमूना बफर वितरित करने से पहले प्री-कुल्ला पाइप्ट टिप।
    4. संक्षेप में एक बेंचटॉप अपकेंद्री में सभी पीसीआर ट्यूबों अपकेंद्रित्र (30 एस के लिए १३,००० x ग्राम), झटका/भंवर पीसीआर ट्यूबमिश्रण करने के लिए, तो अपकेंद्रित्र दोहराने ।
    5. सभी पीसीआर ट्यूबों को गर्म ढक्कन के साथ थर्मोसाइकिलर में स्थानांतरित करें। परिभाषित तापमान और अवधि (यानी, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस) पर विस्वभाव नमूने।
      नोट: लक्ष्य प्रोटीन के लिए निंदा तापमान और अवधि को अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
    6. दोहराएं चरण 3.12.4।
    7. सभी पीसीआर ट्यूब ों को ट्यूब रैक और बर्फ पर जगह पर वापस करें।
    8. डेनाट्यूरिंग स्टेप के दौरान, विकास समाधान (1:1 ल्यूमिनोल-एस: पेरोक्साइड सॉल्यूशन) तैयार करें, फिर ल्यूमिनॉल-एस के 200 माइक्रोन और पेरोक्साइड के 200 माइक्रोन जोड़ें। बर्फ पर रखें।
    9. ऊपर तैयार नमूने के साथ सीईआई पूर्व से भरी प्लेट लोड करने के लिए, परख लेआउट(चित्रा 1)में दिखाए गए परख प्लेट में अभिकर्मकों और नमूनों को वितरित करें। हवा के बुलबुले शुरू करने से बचें।
      नोट: यदि वॉल्यूम और समाधान समान हैं, तो रिवर्स पाइपिंग तकनीक का उपयोग करें। यदि नहीं, तो वितरण से पहले पिपेट टिप को प्री-कुल्ला करें और पिपेट पर दूसरे टैब स्टॉप का उपयोग करके शेष को अच्छी तरह से प्लेट में निष्कासित न करें। 12-230 केडीए सेपरेशन मॉड्यूल में कलर-कोडेड प्लेट-लोडिंग गाइड हो सकता है। अच्छी तरह से अभिकर्मकों और नमूनों को जोड़ते समय प्लेट के नीचे इस गाइड को रखें, जो नमूना लोडिंग करते समय नेत्रहीन मदद करता है। प्लेट लोडिंग गाइड कंपनी की वेबसाइट से भी डाउनलोड किया जा सकता है।
      1. पंक्ति ई में, ल्यूमिनोल के 15 μL जोड़ें: पेरोक्साइड मिश्रण प्रत्येक अच्छी तरह से ।
        नोट: आदर्श रूप से, उपयोग से ठीक पहले इस अभिकर्मक को तैयार करें और प्रत्येक कुएं में जोड़ें। यदि यह सुविधाजनक नहीं है, तो यह मिश्रण प्लेट लोडिंग से पहले 30 से अधिक नहीं तैयार किया जा सकता है।
      2. पंक्ति डी में, अच्छी तरह से D1 करने के लिए, स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी के 10 माइक्रोन जोड़ें।
      3. पंक्ति डी में, वेल्स D2-D25 के लिए, नामित माध्यमिक एंटीबॉडी के 10 μL जोड़ें ।
      4. पंक्ति बी में, प्रत्येक अच्छी तरह से, एंटीबॉडी डिल्यूंट के 10 μL जोड़ें।
      5. पंक्ति सी में, अच्छी तरह से C1 करने के लिए, एंटीबॉडी डिलुएंट के 10 μL जोड़ें ।
      6. पंक्ति सी में, C2-C25 कुओं के लिए, नामित प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 μL जोड़ें ।
      7. पंक्ति ए में, अच्छी तरह से A1 करने के लिए, पीसीआर ट्यूब #1 से बायोटिनेटेड सीढ़ी के 5 μL जोड़ें ।
      8. पंक्ति में, A2-A25 कुओं के लिए, नमूना के 3 μL जोड़ें, पीसीआर ट्यूब#2-#2-#25 इसी कुओं में #25 ।
      9. प्रत्येक नामित वॉश बफर में वॉश बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें अच्छी तरह से।
      10. आर टी पर 1,000 x ग्राम पर 5 मिन के लिए प्लेट को सेंट्रलाइज किया।

Figure 1
चित्रा 1: परख लेआउट। प्राथमिक एंटीबॉडी और लक्ष्य प्रोटीन नमूना अनुकूलन दोनों एक परख में किया जा सकता है। केशिका2-7, 8-13, 14-19 और 20-24 विभिन्न प्रोटीन एकाग्रता और प्राथमिक एंटीबॉडी रेंज का प्रतिनिधित्व करते हैं। केशिका 25 सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है। विरोधी ईआरके एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था; हालांकि, किसी भी उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण को शामिल किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. प्लेट 1 पर सीईआई प्रदर्शन

  1. सबसे पहले, सीईआई(सामग्री की तालिका)एनालाइजर चालू करें, फिर कंप्यूटर चालू करें। सॉफ्टवेयर खोलें(सामग्री की तालिका)
  2. एनालाइजर को ऑनलाइन सिस्टम(टेबल ऑफ मैटेरियल)से कनेक्ट करें। यह मुसीबत शूटिंग प्रयोजनों और डेटा वसूली के लिए रन डेटा एकत्र करने के लिए एक आवश्यक कदम है।
  3. ऊपर से छोड़ दिया मेनू से इंस्ट्रूमेंट पर क्लिक करें, तो कनेक्टपर क्लिक करें । ऐसे इंस्ट्रूमेंट सीरियल नंबर का चयन करें जो पॉप-अप मेन्यू के रूप में दिखाई देता है। कनेक्ट पर क्लिक करें।
  4. 'परख'टैब का चयन करें और नई परख का चयन करें या एक सहेजे गए टेम्पलेट का चयन करें।
  5. इनपुट परख मापदंडों(तालिका 1)या वर्तमान में टेम्पलेट को संशोधित करें। फाइल का नाम और स्थान सहेजें।
  6. सुनिश्चित करें कि विश्लेषक में निमिष नीला रंग संकेतक ठोस नीला रहता है।
  7. खोलने के लिए नारंगी दरवाजे के शीर्ष पर चांदी धातु बटन स्पर्श करें।
  8. ध्यान से अपनी पैकेजिंग से केशिका कारतूस निकालें। निर्माता के प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित केशिका कारतूस डालें। यदि सही ढंग से स्थापित किया जाता है, तो अंदर की रोशनी "नीला" हो जाती है।
  9. परख की थाली से सुरक्षात्मक सील निकालें। नेत्रहीन हवा के बुलबुले के लिए पूर्व से भरे कुओं का निरीक्षण करें। यदि देखा जाता है, तो उन्हें एक छोटे से पाइप टिप (लांग-शाफ्ट पी10 पाइप टिप अच्छी तरह से काम करता है) के साथ पॉप करें।
  10. परख की थाली रखकर प्लेट धारक को लोड करें और दरवाजा बंद कर दें। कंप्यूटर में स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
    1. बर्फ ट्रे जिसमें तापमान संवेदनशील अभिकर्मक और नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखें जब तक कि दूसरी प्री-भरी प्लेट तैयार करने के लिए तैयार न हो जाएं।
    2. दूसरी थाली के लिए कमरे के तापमान पर अभिकर्मकों/आपूर्ति को छोड़ दें ।

5. प्लेट 2 पर सीईआई प्रदर्शन

नोट: यह प्लेट फॉस्फोरोरीटेड टीडीपी-43 स्तरों का विश्लेषण करने के लिए निर्धारित है।

  1. आइस ट्रे को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित कर के बेंच पर रखें, पहली प्लेट के अनुमानित पूरा होने के समय से पहले 1 घंटे। एक दूसरी थाली और कारतूस पुनः प्राप्त।
  2. दूसरे रन के लिए आवश्यक किसी भी एंटीबॉडी कमजोराई तैयार करें और उन्हें बर्फ पर स्टोर करें। ताजा 1:1 ल्यूमिनोल-एस: पेरोक्साइड समाधान (ऊपर चरण 3.12.8) तैयार करें।
  3. रीमिक्स और संक्षेप में पूर्व भरी हुई प्लेट लोड करने के लिए आवश्यक नमूना मिश्रण और अभिकर्मकों को फिर से अपकेंद्रित करें। चित्रा 1के अनुसार दूसरी प्लेट लोड करें। पंक्ति सी कुओं में लोड ए-पी (S409-410-2) TDP-43 एंटीबॉडी समाधान।
  4. जब पहला रन पूरा हो जाए, तो पहली प्लेट और कारतूस को त्याग दें। कारतूस निकालें और निपटान के लिए एक तेज कंटेनर में जगह है। संदर्भ उद्देश्यों के लिए प्लेट और कारतूस से स्टिकर रखें।
  5. सॉफ्टवेयर फ़ाइल को बंद करें और उसी टेम्पलेट को फिर से चुनें। सॉफ्टवेयर पूर्व भागसे सेटिंग्स याद होगा। आवश्यकतानुसार एनोटेशन में कोई परिवर्तन करें (यानी, प्राथमिक एंटीबॉडी को बदलना)।
  6. दोहराएं चरण 4.8-4.10। सभी 12-230 केडीए मास्टर किट जुदाई मॉड्यूल अभिकर्मकों और आपूर्ति दूर रखो
  7. सीईआई नमूना-मिश्रण, एंटीबॉडी कमजोर, 0.1 x नमूना बफर और ल्यूमिनोल-एस: पेरोक्साइड पर छोड़ दिया त्यागें विश्वविद्यालय के नियमों के अनुसार घोला जा सकता है ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. एक बार रन पूरा हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित गुणवत्ता की जांच की जाए।
    1. सॉफ्टवेयर में शो स्टैंडर्ड्स आइकन और ग्राफ व्यू टैब का चयन करें। - पीक अलाइनमेंट के लिए सभी 25 केशिकाओं को इंटरनल फ्लोरोसेंट मार्कर साइज में चेक करें। गलत चोटी पर फोर्स स्टैंडर्ड या राइट क्लिक का चयन करके गलत संरेखण को सही करें, फिर मानक काचयन नहीं करें। प्रत्येक नए केशिका के लिए इस जांच करें।
    2. नमूनों और एकल दृश्य आइकन पर क्लिक करें। प्रयोग टैब में केशिका #1 (बायोटिनी सीढ़ी) का चयन करें। आणविक वजन मार्कर के लिए चोटी संरेखण की समीक्षा करें। ग्राफ व्यू में चोटी पर क्लिक करें और चुनें कियदि सॉफ्टवेयर द्वारा चोटी का गलत चयन किया जाता है।
      नोट: उदाहरण के तौर पर 12-230 केडीए बायोटिनेटेड सीढ़ी में 12 केडीए, 40 केडीए, 66 केडीए, 116 केडीए, 180 केडीए और 230 केडीए में आकार की चोटियों को दिखाया जाएगा। यदि यह कदम नहीं उठाया जाता है और गलत परिणाम उत्पन्न करेंगे तो नमूना चोटियों का आकार गलत होगा।
    3. इलेक्ट्रोफोरेटिक मूवी देखें और ध्यान दें कि क्या रन के दौरान कोई असामान्य माइग्रेशन हुआ।
    4. आगे की गणना के लिए आवश्यक आणविक वजन, पीक क्षेत्र, चोटी की ऊंचाई और सिग्नल-टू-शोर [एस/एन]) सहित डेटा (उदाहरण के लिए, चोटियों की मेज प्राप्त करें। ग्राफ के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने के लिए ग्राफ विंडो के ऊपरी-दाएं कोने पर स्थित ग्राफ एनोटेशन उपकरण हैं।

Representative Results

प्लेटलेट साइटोसोलिक प्रोटीन एकाग्रता और प्राथमिक एंटीबॉडी टिट्रेशन का अनुकूलन
परख में प्लेटलेट साइटोसोलिक प्रोटीन की एक रैखिक गतिशील रेंज स्थापित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि सिग्नल में परिवर्तन सीधे प्लेटलेट साइटोसोल में प्रोटीन में परिवर्तन के आनुपातिक होते हैं। परख में पूरे प्लेटलेट लाइसेट मिश्रण के उपयोग से लक्ष्य प्रोटीन (टीडीपी-43 और पी (S409-412) टीडीपी-43) की सिग्नल तीव्रता कम हो सकती है और उच्च पृष्ठभूमि के संकेत में योगदान हो सकता है। इसलिए, इस परख में, प्लेटलेट्स(चित्रा 2)को तोड़ने के बाद स्पष्ट अधिष्णक का उपयोग (साइटोसोलिक अंश) किया गया था।

Figure 2
चित्रा 2: सिग्नल स्पष्टता नमूना गुणवत्ता पर निर्भर करती है। (A)पूरे प्लेटलेट लाइसेट होमोजेनेट टीडीपी-43 एंटीबॉडी बाइंडिंग में हस्तक्षेप करते हैं; इसलिए, शोर इलेक्ट्रोप्रोग्राम देखा गया। (ख)प्लेटलेट साइटोसोलिक अंश को पूरे लाइसेट से अपकेंद्रित्र (30 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम) के अधीन करने से प्राप्त किया गया था। अधिकांश झिल्लीदार प्रोटीन हटा दिए गए; इसलिए टीडीपी-43 एंटीबॉडी को टीडीपी-43 प्रोटीन के लिए बाध्यकारी करते हुए बढ़ाया गया (ब्लू लाइन ट्रेस)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्लेटलेट साइटोसोल प्रोटीन एकाग्रता के लिए एक रैखिक गतिशील रेंज 0.2-0.8 मिलीग्राम/mL पर स्थापित किया गया था । एक परख टेम्पलेट अपनाया गया था ताकि प्रोटीन एकाग्रता और प्राथमिक एंटीबॉडी टिट्रेशन दोनों को एक परख(चित्रा 3)में प्रदर्शन करने में सक्षम थे।

Figure 3
चित्रा 3: प्लेटलेट साइटोसोल प्रोटीन एकाग्रता के लिए रैखिक गतिशील रेंज। (क)एक ही रन के दौरान एक प्लेट में प्रोटीन सांद्रता और एंटीबॉडी टिट्रेशन दोनों को अनुकूलित किया गया था । (ख)प्रोटीन के लिए रैखिक कार्य श्रृंखला (0.2-0.8 मिलीग्राम/मिलीएल) स्थापित की गई थी । एक ०.५ मिलीग्राम/mL प्रोटीन लोड सकारात्मक नियंत्रण (केशिका 25) के रूप में एक ईईआरके एंटीबॉडी द्वारा लेबल किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नमूना तैयारी ट्यूब में ग्लाइसेरोल सामग्री 20% (अंतिम) से कम होनी चाहिए, अन्यथा उच्च ग्लाइसेरोल एकाग्रता प्राथमिक एंटीबॉडी बाध्यकारी को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करेगी।

इष्टतम एक्सपोजर समय निर्धारित करना
सॉफ्टवेयर के पुराने संस्करण में, इष्टतम एक्सपोजर समय प्रोटीन एकाग्रता (mg/mL) के खिलाफ पीक क्षेत्र की साजिश रचने के द्वारा निर्धारित किया जाना था । नया संस्करण हाई डायनेमिक रेंज (एचडीआर) डिटेक्शन प्रोफाइल(चित्रा 4)नाम से एक नया उपकरण प्रदान करता है। इमेज पैनल का उपयोग करने से सभी एक्सपोजर समय (यानी 5 एस, 15 एस, 30 एस, 60 एस, 120 एस, 240 एस, 480 एस) को एक साथ देखने का विकल्प प्रदान किया गया। कंप्यूटर सॉफ्टवेयर ने सभी एक्सपोजर समय का विश्लेषण किया और स्वचालित रूप से सबसे अच्छा एक्सपोजर समय (एचडीआर) की पहचान की। एचडीआर डिटेक्शन प्रोफाइल ने सीईआई की अधिक संवेदनशीलता के कारण काफी व्यापक गतिशील रेंज प्रदान की, जिसका अर्थ है एक बड़ा नमूना एकाग्रता सीमा पर बेहतर पता लगाना और परिमाणन। हालांकि, उपयोगकर्ताओं के पास अभी भी किसी भी एक्सपोजर समय का चयन करने का विकल्प है जो प्रयोगात्मक लक्ष्य को संतुष्ट करता है। इस फीचर का इस्तेमाल करते हुए टीडीपी-43 प्रोटीन के लिए इष्टतम एक्सपोजर टाइम पाया गया। चोटी इष्टतम एक्सपोजर समय(चित्र4ए)का प्रतिनिधित्व करती है। 1-512 एस(चित्रा 4बी)के बीच सभी नौ एक्सपोजर समय की समीक्षा करने के बाद इस एंटीबॉडी के लिए एक एकल एक्सपोजर टाइम (4 एस) परिभाषित किया गया था।

Figure 4
चित्रा 4: एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए उच्च गतिशील रेंज (एचडीआर) का पता लगाने प्रोफ़ाइल। (A)टीडीपी-43 प्रोटीन पीक लक्ष्य प्रोटीन के लिए इष्टतम एक्सपोजर समय का प्रतिनिधित्व करता है। ए-टीडीपी-४३ एबी टिट्रेशन 1:300 था, और प्लेटलेट साइटोसोल प्रोटीन एकाग्रता ०.५ मिलीग्राम/mL थी । सॉफ्टवेयर-परिभाषित ब्लू लाइन इष्टतम एक्सपोजर समय को इंगित करती है। (ख)यह आंकड़ा 1-512 एस के बीच सभी नौ एक्सपोजर समय की समीक्षा करने के बाद एक उपयोगकर्ता-परिभाषित एकल एक्सपोजर समय (4 एस) का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एएलएस रोगियों के मानव प्लेटलेट साइटोसोल में टीडीपी-43 का स्तर
ब्लड बेस बायोमार्कर डेवलपमेंट किया गया। अनुकूलित परख की स्थिति का उपयोग करते हुए, एएलएस रोगियों से प्राप्त प्लेटलेट लाइसेट साइटोसोलिक अंशों का विश्लेषण एंटीबॉडी के दो सेटों (यानी, एंटी-टीडीपी-43 [पैन] एंटीबॉडी, एक एंटीबॉडी जो टीडीपी-43 प्रोटीन के फॉस्फोरीेटेड डेरिवेटिव को पहचानता है; यहां, ए-पी [S409/410-2] टीडीपी-43 का उपयोग किया गया था)। इस प्रदर्शन में, रोग-विशिष्ट टीडीपी-43 और इसके फॉस्फोरोरिलेटेड डेरिवेटिव प्रस्तुत किए जाते हैं(चित्र5)।

Figure 5
चित्रा 5: टीडीपी-43 के भविष्य कहनेवाला फॉस्फोरिलेशन वैल्यू (पीपीवी) का प्रतिनिधित्व। फॉस्फोरेटेड टीडीपी-४३ और पैन टीडीपी-४३ की निरपेक्ष मात्रा में अकेले एएलएस और नियंत्रण समूहों के बीच ज्यादा अंतर नहीं दिखा । हालांकि, PPV ALS पलटन में थोड़ी वृद्धि का संकेत दिया है, हालांकि वहां विषयों की अपर्याप्त संख्या (ALS = 25, नियंत्रण = 27) के कारण दो समूहों के बीच कोई सांख्यिकीय अंतर था । एएलएस और नियंत्रण समूह के साधनों के बीच एक कम कोहेन के डी मूल्य ने छोटे नमूना आकार (नियंत्रण = 25, एएलएस = 27) के कारण दो समूहों के बीच कम प्रभाव आकार दिखाया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कुल टीडीपी-43 अंशांकन वक्र का उपयोग करके निर्धारित किया गया था(चित्र6)

Figure 6
चित्रा 6: मानक अंशांकन वक्र। व्यावसायिक रूप से खरीदे गए पुनर्संयोजन टीडीपी-43 प्रोटीन सांद्रता का उपयोग एक मानक वक्र का निर्माण करने के लिए किया गया था। प्रत्येक डेटा ट्रिपलिकेट के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। प्रोटीन बैंड की तीव्रता एकाग्रता पर निर्भर (इनसेट) थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस प्रोटीन की व्यावसायिक रूप से अनुपलब्धता के कारण फॉस्फोरेटेड टीडीपी-43 प्रोटीन का परिमाणीकरण संभव नहीं था। इसके बजाय, एक भविष्यवाणी फॉस्फोरिलाइजेशन वैल्यू (पीपीवी) की स्थापना की गई थी जो टीडीपी-43 की फॉस्फोरीफाइड प्रजातियों के प्रतिशत को परिभाषित करती है। पीपीवी निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कर एक ही नमूना के लिए दो अनुक्रमिक CEI परख से निर्धारित किया गया था ।

Equation 1

अंतर-और अंतर-भागो परख परिवर्तनशीलता का परीक्षण पूल्ड ह्यूमन एल्स प्लेटलेट साइटोसोलिक अंशों में किया गया(चित्र7)

Figure 7
चित्रा 7: परख विविधताओं । (A)सीईआई द्वारा एक ही नमूने से भरे दो केशिकाओं का विश्लेषण किया गया था, और इंट्रा-रन परख भिन्नता की गणना सीवी% = 14.9 के रूप में की गई थी। (ख)एक ही नमूने का विश्लेषण तीन अलग परख के दिनों में और तीन अलग परख रन में किया गया था । अंतर-भागो परख भिन्नता की गणना सीवी% = 18.7 के रूप में की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हालांकि इंट्रा-रन (केशिका-टू-केशिका भिन्नता) गुणांक भिन्नता मूल्य स्वीकार्य सीमा (सीवी% = 14.9) में गिर गए, अंतर-भागो परख मूल्य अपेक्षाकृत अधिक था (सीवी% = 18.7)। यह व्याख्या की जाती है कि यह भिन्नता विभिन्न लॉट से केशिका कारतूस और नमूना प्लेटों का उपयोग करने के कारण हो सकती है। यह सिफारिश की जाती है कि सीईआई घटकों में प्रजनन अध्ययन किए जाने चाहिए जिनमें एक ही संख्या है।

तालिका 1: सीईआई परख प्लेट लोडिंग टेम्पलेट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: इंटरएक्टिव नमूना मिश्रण तैयारी टेम्पलेट। अज्ञात नमूनों से स्टॉक प्रोटीन एकाग्रता में प्रवेश करने के बाद, इंटरैक्टिव कोशिकाएं स्वचालित रूप से गणना करेंगी कि नमूना मिश्रण तैयार करने के लिए कितनी मात्रा का उपयोग करने की आवश्यकता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

केशिका इलेक्ट्रोफोरेटिक आधारित इम्यूनोसे अब उच्च थ्रूपुट नमूना विश्लेषण और दवा स्क्रीनिंग25के लिए पसंद की विधि है । छोटे नमूना मात्रा, अच्छी तरह से अनुकूलित परख घटक, उपयोगकर्ता के अनुकूल परख मंच और इंस्ट्रूमेंटेशन, पुनः एजेंट व्यय, और कम सीवी प्रतिशत प्राथमिक लाभ26,27हैं । हालांकि विभिन्न परख के तौर-तरीकों में प्रोटीन को अलग करने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन यहां वर्णित एंटीबॉडी आधारित सीईआई को छोटी प्रयोगशालाओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है जो रक्त आधारित बायोमार्कर विकास में लगे हुए हैं। सीईआई परख प्रौद्योगिकी यहां इस्तेमाल किया गया टीडीपी-4328 और इसके फॉस्फोरोरिटेड डेरिवेटिव5के लिए विश्वसनीय, प्रजनन योग्य और संवेदनशील माप प्रदान करता है।

सीईआई प्रणाली टीडीपी-43 और इसके फॉस्फोरीडेटिव ्सका विश्लेषण करने और यदि शुद्ध या पुनः संयोजन लक्ष्य प्रोटीन उपलब्ध है तो लक्ष्य प्रोटीन का प्रत्यक्ष परिमाणीकरण प्रदान करने का एक मल्टीप्लेक्सिंग विकल्प भी प्रदान करती है। पूर्ण लंबाई के पुनर्संयोजन टीडीपी-43 प्रोटीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है; हालांकि, पुनः संयोजन फॉस्फोरेटेड टीडीपी-43 व्युत्पन्न नहीं है। चूंकि फॉस्फोरीटेड टीडीपी-43 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, इसलिए एएलएस रोगियों में टीडीपी-43 प्रोफाइल का आकलन करने के लिए एक भविष्य कहनेवाला फॉस्फोरिलेशन वैल्यू (पीपीवी) लागू किया गया था। पैन टीडीपी-43 और फॉस्फोरीटेड टीडीपी-43 राशिस्थायी रूप से फ्लोरोफोर के साथ लेबल की गई थी; इसलिए, टीडीपी-43 प्रोफ़ाइल मात्रात्मक इकाई (यानी एनजी/एमएल, पीजी/एमएल आदि) के साथ या बिना समान रहती है। यद्यपि टीडीपी-43 और इसके फॉस्फोरेटेड डेरिवेटिव (यानी, पी [S409-410-12] टीडीपी-43) की पूर्ण मात्रा का निर्धारण करना अधिक मात्रात्मक माप प्रदान करता है, पीपीवी की गणना मानकीकरण के लिए पुनः संयोजन फॉस्फोरेटेड टीडीपी-43 की आवश्यकता को समाप्त करती है, क्योंकि यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है।

CEI परख मंच में कई चौकियों प्रदान करता है सही मामले में समस्या की पहचान है कि एक परख विफल रहता है । यह बाधाओं को समाप्त करता है और बेहतर प्रयोगात्मक डिजाइन प्रदान करता है। परख प्रक्रिया नमूना प्लेट भरने के अलावा पूरी तरह से स्वचालित है। यह मानक पश्चिमी दाग विश्लेषण की तुलना में एक महत्वपूर्ण विशेषता है। यह सुविधा रन-टू-रन से स्थिरता प्रदान करती है। यद्यपि प्रत्येक प्रयोगशाला में अद्वितीय मानक परिचालन प्रक्रियाएं होती हैं, लेकिन मानव त्रुटि को कम करने वाली प्रथाओं का पालन करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, प्लेट लोडिंग से ठीक पहले ल्यूमिनोल-एस/पेरोक्साइड मिश्रण तैयार करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ल्यूमिनोल में पेरोक्साइड जोड़ने से एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया शुरू होती है और ल्यूमिनॉल सब्सट्रेट का उपभोग होता है । हवा के बुलबुले के बिना प्लेट कुओं में लोड िंग नमूने और प्राथमिक/माध्यमिक एंटीबॉडी भी गंभीर रूप से महत्वपूर्ण कदम हैं ।

इसके अतिरिक्त, चूंकि प्लेट कुएं मात्रा में छोटे होते हैं और कुओं के बीच कोई जगह नहीं है, इसलिए उपयोगकर्ताओं को पाइपिंग करते समय सावधानी का उपयोग करना चाहिए, जो कि बाकी सब कुछ स्वचालित होने के बाद से सबसे महत्वपूर्ण कदम है। परख(चित्रा 1)की निरंतरता के लिए नमूनों, एंटीबॉडी और अन्य अभिकर्मकों का लोडिंग ऑर्डर महत्वपूर्ण है। प्लेट तैयार करने की प्रक्रिया में लगभग 40-45 मिन लगते हैं। इसलिए, प्लेट को पहले आवश्यक परख घटकों के साथ लोड करने और पाइपिंग से ठीक पहले ल्यूमिनोल-एस/पेरोक्साइड मिश्रण तैयार करने की सिफारिश की जाती है। इस तरह, अभिकर्मक जोड़ने का एक सुसंगत अनुक्रम है, और लगातार ल्यूमिनेसेंस सिग्नल ताकत प्राप्त की जाएगी। एक्सपायर्ड ल्यूमिनॉल-एस/पेरोक्साइड रिएजेंट का इस्तेमाल करने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि यह मुख्य रूप से पेरोक्साइड की ताकत को प्रभावित करता है । विभाजन बफर प्रणाली शुरू करने में हाल ही में प्रगति और रासायनिक और डिटर्जेंट अनुकूलता रेंज सहित परख की गुणवत्ता में वृद्धि हुई है और अधिक प्रजनन और उंमीद के मुताबिक परिणाम का उत्पादन किया । अब, एक ही निर्माता से एक नया कॉम्बो-एनालाइजर एक ही रन में केमिलुमिनेसेंस और फ्लोरेसेंस संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक सुविधा के पास है । यह नई सुविधा लगातार दो व्यक्तिगत प्लेटों को चलाने की आवश्यकता को समाप्त करती है और रन-टू-रन भिन्नता को समाप्त करती है।

परख प्लेटों परिवेश के तापमान में संग्रहीत किया जाना चाहिए। यदि इसे परख प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखने के लिए चुना जाता है, तो प्लेटों को परख से पहले रात को बाहर निकालकर परिवेश के तापमान पर लाया जाना चाहिए। गलत तरीके से लोड किए गए नमूना कुओं को सही नमूना जोड़ने से पहले किट में प्रदान किए गए बफर के साथ बड़े पैमाने पर (4-5 बार) धोया जाना चाहिए। प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी और जैविक नमूने अद्वितीय हैं; इसलिए, जैविक तरल पदार्थों में लक्ष्य प्रोटीन के लिए नमूनों का विश्लेषण करने से पहले एंटीबॉडी/प्रोटीन अनुकूलन किया जाना चाहिए ।

यहां प्राइमरी एंटीबॉडी इनक्यूबेशन का समय डिफॉल्ट करके 30 मिन के लिए तय किया गया था। यदि सिग्नल कमजोर है, तो उपयोगकर्ताओं को फ्लोरेसेंस सिग्नल बर्नआउट के बिना वांछित सिग्नल ताकत तक पहुंचने तक प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन समय बढ़ाने पर विचार करना चाहिए। मानव प्लेटलेट्स के लिए, रोगियों से पूल किए गए नमूने तैयार किए गए थे और अनुकूलन परख के लिए उपयोग किए जाते थे। नमूना पूलिंग बेहतर लक्ष्य जैव अणुओं के बीच भिन्नता का प्रतिनिधित्व करता है। सीईआई के लिए कुल lysate या कुल समरूप के बजाय स्पष्ट सुपरनेटेंट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

पूरे प्लेटलेट लाइसेट मिश्रण में प्रोटीन की उच्च सांद्रता सिग्नल-टू-शोर अनुपात(चित्रा 2)को कम कर सकती है। नमूनों के बार-बार फ्रीज-गल चक्रों से बचा जाना चाहिए, क्योंकि इससे प्राथमिक एंटीबॉडी बाइंडिंग पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है । lysate बफर की सामग्री महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि कुछ अभिकर्मक सीईआई29के साथ संगत नहीं हैं। नमूना तैयार करने से पहले निर्माता की वेबसाइट पर प्रदान किए गए संगत अभिकर्मकों की सूची को क्रॉस-चेक करने की सलाह दी जाती है। यह प्रणाली की एक सीमा है जो नमूना तैयार करने के लिए उच्च स्ट्रिंग शर्तों को बर्दाश्त नहीं करती है। बाद में व्यक्तिगत नमूनों का विश्लेषण करने के लिए पूल किए गए नमूनों का उपयोग करके परख चलाने के मापदंडों (यानी, प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने, प्रोटीन एकाग्रता, प्राथमिक एंटीबॉडी इन्क्यूबेशन समय आदि) को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है।

Disclosures

लेखक प्रोटीनसिंपल को छोड़कर कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित घोषित नहीं करते हैं, इंक ने इस पांडुलिपि की प्रकाशन लागत को कवर किया।

Acknowledgments

इस शोध को एए के लिए दिए गए इंट्राम्यूरल ग्रांट द्वारा प्रायोजित किया गया था । इस काम को NCATS से एक CTSA अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था फ्रंटियर्स के लिए कंसास मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय को संमानित किया: गढ़ नैदानिक और ट्रांसलेशनल रिसर्च के लिए संस्थान (#UL1TR606381) । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी एनआईएच या NCATS के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। हम स्वस्थ स्वयंसेवक और एएलएस रोगियों से रक्त नमूना संग्रह के लिए आईआरबी अनुमोदन प्राप्त करने के लिए कंसास मेडिकल सेंटर एएलएस क्लिनिक व्यक्तिगत विश्वविद्यालय के लिए आभारी हैं । लेखक पांडुलिपि के प्रूफरीडिंग के लिए Emre Agbas शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-230 kDa Separation kit ProteinSimple SM-W004 Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge
3000G Thermocycler Techne FTC3G/02 We used this thermocylcer for heating the sample mix
Anti-Mouse detection kit ProteinSimple 042-205 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody ProteinTech 22309-1-AP Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody CosmoBio-USA TIP-PTD-P02 Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-Rabbit detection kit ProteinSimple DM-001 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-TDP-43 (pan) antibody ProteinTech 10782-2-AP Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein
Compass for SimpleWestern (SW) ProteinSimple Ver.4.0.0. Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments
Sonic Dismembrator; Model100 Fisher Scientific Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350)
Table top centrifuge Eppendorf 22625004 Model# 5810 with swinging plate bucket
Wes analyzer ProteinSimple 55892-WS-2203 Performs the capillary gel electrophoresis

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References

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