Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Brug af kapillær elektroforese Immunoassay at søge efter potentielle biomarkører for amyotrofisk lateral sklerose i humane blodplader

Published: February 10, 2020 doi: 10.3791/60638
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 3, 3, 1
1Department of Basic Sciences, Kansas City University of Medicine and Biosciences, 2Rice University School of Medicine, 3University of Kansas Medical Center

Summary

Blodbaserede biomarkører for neurodegenerative sygdomme er afgørende for gennemførelsen af store kliniske undersøgelser. En pålidelig og valideret blodprøve bør kræve en lille prøvevolumen samt være en mindre invasiv prøvetagningsmetode, der er overkommelig og reproducerbar. Dette papir viser, at høj-throughput kapillær elektroforese immunoassay opfylder kriterier for potentielbiomarkør udvikling.

Abstract

Kapillær elektroforese immunoassay (CEI), også kendt som kapillær vestlig teknologi, er ved at blive en metode valg for screening sygdom relevante proteiner og lægemidler i kliniske forsøg. Reproducerbarhed, følsomhed, lille krav til prøvevolumen, multipleksingantistoffer til flere proteinmærkninger i samme prøve, automatiseret højoverførselsevne til at analysere op til 24 individuelle prøver og kort tidskrav gør CEI fordelagtigt i forhold til den klassiske vestlige blot immunassay. Der er nogle begrænsninger af denne metode, såsom manglende evne til at udnytte en gradient gel (4%-20%) matrix, høj baggrund med uraffinerede biologiske prøver og kommerciel utilgængelighed af individuelle reagenser. Dette papir beskriver en effektiv metode til at køre CEI i en multipel analyseindstilling, optimere proteinkoncentration og primær antistoftitrering i én analyseplade og levere brugervenlige skabeloner til prøveforberedelse. Også beskrevet er metoder til måling af pan TDP-43 og fosforlated TDP-43 derivat i blodplade lysatcytosol som en del af initiativet i blod-baserede biomarkør udvikling for neurodegenerative sygdomme.

Introduction

Det overordnede mål for CEI som beskrevet her er at give en opdateret trinvis protokol til analyse af målproteiner i humane blodplader. Overdragelse af et blodbaseret signaturmolekyle er en af de vigtigste opgaver inden for biomarkørudvikling i humane neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Parkinsons sygdom (PD), inklusionsorgan myositis (IBM) og andre proteinsammenlægningsrelevante patologiske tilstande. Påvisning af små mængder af sådanne signaturproteiner i store mængder blod med mange forstyrrende midler er en udfordring. Derfor er specificiteten, følsomheden, evnen til at håndtere et stort antal prøver og reproducerbarhed en af den valgte metode afgørende.

Menneskelige blodplader kan tjene som et miljø til at identificere og tildele potentielle biomarkør proteiner til neurodegenerative sygdomme. Blodplader giver mulighed for at tjene som en surrogat primær celle model, som afspejler nogle funktioner i neuronal celler1,2,3. Der er visse funktioner, der gør blodplader en af de foretrukne midler til at analysere biomarkør kandidat proteiner og deres kemiske derivater. For det første kan blodplader let erhverves ved hjælp af en mindre invasiv tilgang ved at indsamle blod fra donorer (dvs. venipunktur) eller i store mængder fra samfundet blodbanker. For det andet kan blodplader let isoleres fra fuldblod med minimalt forberedende arbejde i minimalt udstyrede laboratorier4,5. For det tredje har blodplader ikke kerner; derfor er de en god model celle til at studere ændringer i stofskiftet uden transskriptionelle regulering. For det fjerde er indholdet af biomolekyle tanske indkapslet. Derfor beskytter blodplademikromiljøet indholdet mod serumforstyrrende stoffer (dvs. proteaseer). Femte, blodplade-beriget plasma kan opbevares ved stuetemperatur i 7-8 dage uden at miste metabolisk aktivitet. Derfor giver blodplader en arbejdsmodel, hvor eksterne faktorer minimeres og kontrolleres.

Traditionelle immunassayteknikker såsom immunblotting (f.eks. vestlig blotting) og enzymrelateret immunorbentassay (ELISA) anvendes mere bredt i specifik proteinanalyse. Men disse to metoder har flere ulemper, herunder flere analysetrin, krav om farlige kemikalier og reagenser, stor stikprøvestørrelse, problemer med analysereproducerbarhed og interkøringsdatavariabiliteter. Disse førte til udviklingen af en metode, der er enklere med færre skridt og opnåelig på relativt kort tid. Selv om den klassiske vestlige blot teknik vil forblive en populær laboratoriemetode, dens multi-trins procedure, forsyninger, giftigt affald (dvs. acrylamid, methanol, osv.) og analyse tid bliver mindre ønskeligt, når de udfører high-throughput kvantitative proteinanalyse.

En automatiseret CEI-tilgang er gradvist ved at blive en foretrukne metode for laboratorier, der udfører proteinanalyser med høj gennemløb6. CEI eliminerer behovet for geler, gelelektroforeseapparater, membraner, elektroforese og elektrooverførselsanordninger og mere fysiske håndteringsinvolveringer. Hvis designet godt, en CEI assay bør udfyldes inden for ca 3,5 h, herunder kvantitative dataanalyse, publikation kvalitet elektrofherogram, og grafer med statistisk analyse. En anden overlegenhed i CEI-systemet er dets krav om 10x-20x mindre proteinkoncentration, hvilket gør det ideelt til brug i humane prøver, der anvendes i kliniske forsøg7,8.

Den mest kritiske del af CEI er at optimere analysebetingelserne for hvert antistof, der købes fra forskellige leverandører, type antistof (monoklonalt vs. polyklonalt), optimale proteinkoncentrationer, prøveforberedelse, prøvedenatureringstemperatur og elektroforesespænding påkalærerne. Vi har udviklet en metode til optimering af enkeltanalyseformat til CEI, som skal implementeres før nye analyser, hvilket vil spare tid og ressourcer. Dette optimeringstrin efterfølges af en automatiseret kvantitativ vurdering af både total- og fosforleret derivat af transaktiveringsrespons DNA/RNA-bindende protein (Tardp). På grund af sin størrelse (43 kDa), vil akronymet TDP-43 blive brugt i hele dette papir. Her vurderes TDP-43 protein i humant blodpladelysat fremstillet af ALS-patienter for at hjælpe med at udvikle prædiktiv fosforylationsværdi (PPV) som en potentiel prognostisk biomarkør.

TDP-43 er en ny potentiel sygdom biomarkør kandidat til ALS. TDP-43 er et allestedsnærværende protein i alle nuklede celler; Derfor er Funktionerne i TDP-43 under forskellige normale cellulære hændelser og i neurodegenerative sygdomme blevet undersøgt9,10,11,12,13,14. Selv om TDP-43 er et nukleart protein15, har det evnen til at transportere ind og ud mellem kernen og cytoplasmaet på grund af tilstedeværelsen af nuklear lokalisering og nuklear eksport sekvenser16,17,18,19. Cytoplasmatiske TDP-43 er involveret i forskellige cellulære hændelser, såsom mRNA stabilitet og transport, stress respons, mitokondrielle funktion, autofagosome20. Men, ikke meget er kendt om den rolle, fosforateret derivater af TDP-43 andre end deres deltagelse i patogenesen af neurodegenerative sygdom21.

Denne protokol illustrerer, hvordan man optimerer analysebetingelserne for at analysere indholdet af TDP-43 og dets fosforede derivat i blodplader ved hjælp af CEI-metoden. Da fosforede TDP-43 ikke er kommercielt tilgængelig, foreslås det at anvende en prædiktiv fosforylationsværdi (PPV) til at vurdere TDP-43-profiler hos ALS-patienter. Dette CEI-system anvender en lille mængde prøveblanding (2,5-3,0 μL pr. kapillær). Samlet analysevolumenopsætning er 8,0 μL pr. kapillær baseret på fabrikantens protokol. derfor kan forskerne bruge en prøve blanding forberedelse til to separate kørsler. Producenten har konstrueret analyseprotokollen, så eventuelle pipetteringsfejl minimeres, hvis ikke helt elimineres. De 24 individuelle humane blodpladelysateprøveblandinger er opdelt i halve mængder (dvs. 2,5-3,0 μL pr. prøve) og analyseres i træk dem med to forskellige antistoffer inden for ~ 7 timer. CEI-systemet, der er beskrevet her, giver en ønskelig høj overførselsfremløbsmodalitet. Brugerne skal teste antistoffer fra forskellige leverandører og prøveforberedelsesmetoder for målproteinet, før de udfører storstilet screening.

Protocol

Alle protokoller vedrørende behandling af menneskelige blodplader følger retningslinjerne fra både University of Kansas Medical Center og Kansas City University of Medicine og Biosciences IRB udvalg.

1. Forberedelse af stødpuder og reagenser

BEMÆRK: Alle prøver fremstilles i henhold til producentens retningslinjer. Bær personligt beskyttelsesudstyr (laboratoriefrakker, handsker og beskyttelsesbriller) under denne procedure.

  1. Forbered citrat vaske buffer ved at kombinere 0,941 g saccharose (11 mM endelig koncentration), 6,4 ml 5 M NaCl (128 mM endelig), 5,4 ml 0,2 M NaH2PO4 (4,3 m M endelig), 9,4 ml 0,2 M Na2PHO4 (7,5 mM endelig), 0,352 g natriumcitrat (4,8 mM endelig) og 0,115 g citronsyre (2,4 mM endelig). Juster den samlede diskenhed til 250 ml med ddH2O. Filtrer gennem en 0,45 μm filterdisk, og pH justeres til 6,5. Opbevares op til 1 år ved 4 °C. Medbring opløsningsrumtemperaturen (RT), før den bruges22.
  2. Forbered brudbufferen ved at kombinere 250 mM saccharose, 1 mM EDTA og 10 mM Tris-Cl (pH 7.4) i en 100 ml slutvolumen. Opbevares op til 1 år ved 4 °C. Der tilsættes 2 μL phosphatase hæmmercocktail (1:1000 endelig) og 1 μL proteasehæmmercocktail (1:2000 endelig) i 2 ml brudbuffer. Hold på is, indtil det er brugt. Kassér den ubrugte brudbuffer.

2. Blodpladeisolering

  1. 8-10 ml humant blod i gulhætteglas med syre-citrat-dextrose (ACD) (75 mM trinatriumcitrat, 124 mM dextrose og 38 mM citronsyre, pH = 7,4; ACD:blod = 1:9). Bland forsigtigt rørindholdet 5x-6x invertering i hånden.
  2. Centrifugerørene centrifugeres ved 200 x g i en svingende spandrotor i 20 min. ved RT.
  3. Saml blodplade-rige plasma (PRP) (~ 3-4 ml) i en 15 ml konisk bund rør og lad ca 0,5 ml af PRP fra buffy pels (diset udseende fraktion) for at undgå forurening. Hvis der opstår forurening af røde blodlegemer, skal du gentage dette trin.
  4. Prp-prøverne centrifugeres ved 1.200 x g i 15 min. ved RT.
  5. Blodpladepillerne (P1) vaskes ved skånsom resuspension i 1 ml citratvaskebuffer og pellet ved centrifugering ved 1.200 x g i 15 min.
  6. Gem den rene blodpladepellet. Kassér supernatanten.
  7. Kassér blodpladepillerne igen i 600 μL af brudbufferen, der indeholder inhibitorcocktails.
  8. Sonikere blodpladesuspensionen ved hjælp af en sonikeator. Placer prøven i en mini isspand. Indstil sonicatoren til indstilling 3 til 20 s i kontinuerlig tilstand.
    BEMÆRK: Sørg for at rengøre sonden med 10% blegemiddel efterfulgt af destilleret vand.
  9. Centrifugeres de sonikerede prøver ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C for at fjerne membranøse fraktioner. Aliquot supernatanter i 60 μL og opbevares ved -80 °C. Undgå gentagne optønings-/frysecyklusser for blodpladecytosolske fraktioner.

3. Forberedelse til CEI

BEMÆRK: 100 μL human tromlet lysat blev kombineret fra ALS patienter (n = 8-10), og raske forsøgspersoner (n = 8-10) blev separat samlet og brugt til analyseoptimering.

  1. Udfyld interne genererede skabeloner til CEI-layoutet (tabel 1) og eksempelforberedelse (tabel 2). Tabellen til forberedelse af prøveblandingen er dynamisk og beregner automatisk, hvor meget volumen der skal fjernes fra kilden.
    BEMÆRK: Når den påkrævede kildevolumen er angivet i dynamisk tabel-2, beregnes 0,1 X prøvebufferdiskenhedautomatisk.
  2. Pre-label 25 0,2 ml PCR rør med kapillærer #1-#25 og læg dem i en PCR rack. Sæt på is.
  3. Præmærkede 0,6 ml mikrocentrifugerør: et for hvert primært antistof og fortynding (hvis det er nødvendigt) anvendes, et til 0,1 x prøvebuffer, et for luminol-S/peroxid og et for hver prøve, der skal fortyndes (hvis det er nødvendigt). Læg dem på is i rørristen.
  4. Prøvebufferen, vaskebufferen, en plade og en patron i CEI-adskillelsesmodulet 12-230 kDa-masterkit.
  5. Ud tag antistoffortyndingsbufferen, primære antistoffer, sekundære antistoffer, luminol, hydrogenperoxid og standardpakningen ud fra køleskabet på 4 °C. Placer alle reagenser på is, undtagen standardpakken, som forbliver på RT.
    BEMÆRK: Reagenserne fra standardpakningerne er lyofilet og forseglet med foliedæksel. Disse bør spundet ned kort ved hjælp af en mini centrifuge før åbning for at reducere produkttab. For at åbne, kan reagensrørene enten gennembores af en pipette spids eller trukket tilbage fra hjørnet.
  6. Tilsammen tilsættes 400 mM DTT 40 μL deioniseret vand til det klare rør, der indeholder DTT.
  7. Tilsammen tilsættes 40 μL fluorescerende 5x mastermix 20 μL af 10xprøvebufferen og 20 μL af den fremstillede 400 mM DTT-opløsning på det lyserøde rør, der leveres i sættet.
  8. Til fremstilling af den biotiterede stige tilsættes 16 μL deioniseret vand, 2 μL 10x prøvebuffer og 2 μL af den fremstillede 400 mM DTT-opløsning på det hvide rør, der leveres i sættet. Bland forsigtigt og overføres til en 0,2 ml PCR rør til denaturering.
  9. Der tilfremstilles 0,1 x prøvebuffer ved tilsætning af 1,5 μL 10x prøvebuffer og 148,5 μL deioniseret vand til et 0,6 ml mikrocentrifugerør. Vortex at blande og placere på is.
  10. Forbered de ønskede antistoffortyndinger. Tilsæt antistoffortyndingsmiddel i mængder, der er udpeget til hvert formærket mikrocentrifugerør. Hvis volumener er identiske, skal du bruge bakterieteknik23; hvis ikke, skal du skylle pipettespidsen før dispensering.
    BEMÆRK: I denne analyse blev a-TDP-43 pan antistof og a-p(S409/410-2) TDP-43 antistof anvendt. Anti-ERK antistof blev brugt til en intern kontrol for at sikre, at analysekomponenter fungerer.
  11. Udfør omvendt pipettering for antistoffortynding som beskrevet nedenfor. Alternativt kan yderligere oplysninger findes i litteraturen24.
    BEMÆRK: Bakgearetsteknik foretrækkes ved dispensering af små sekventielle mængder opløsning23. Denne teknik giver nogle fordele: i) at give en præcis volumen, (ii) eliminering af reagens skummende i spidsen åbning, og (iii) ideel til lille volumen (<5 μL) reagenser, viskose opløsninger, overfladeaktive opløsninger, og løsninger med højt damptryk.
    1. Sæt en ordentlig spids i en pipette og tryk stemplet ned til det andet stop (Trin-2). Rørspidsen nedsænkes et par millimeter i opløsningen. Slip langsomt stemplet for at fylde pipetspidsen med opløsningen, mens spidsen stadig er nedsænket i opløsningen. Fjern spidsen fra opløsningen, og rør forsigtigt mod reagensbeholderens kant, så overskydende væske, der er tilbage på ydersiden af spidsen, fjernes.
    2. Opløsningen udlads ved at trykke stemplet ned til første stop (trin 1). Den resterende opløsning må ikke dispenseres i spidsen.
    3. Tøm den resterende opløsning i spidsen til reagensbeholderen ved at trykke stemplet til det andet stop (trin 2). Slip stemplet til den klare position til det næste pipetteringstrin.
    4. Tilsæt det nødvendige antistof i mængder, der er udpeget til hvert formærket mikrocentrifugerør (tabel 1)Skyl ikke pipetspidsen før: Tilsæt det direkte til fortyndingsglasset, og hæld spidsen flere gange for at fjerne antistoffet. Placer rørene på is.
  12. For at forberede CEI-prøveblandingen skal du udføre nedenstående trin for PCR-rør mærket cap#2 til cap#25: Dette er i samme rækkefølge, som det fremgår af tabel 1.
    1. Åbn alle rør, tilsæt 1,6 μL aliquots af fluorescerende 5x prøvebuffer til hvert rør ved hjælp af en bakgearningsteknik, og luk derefter hvert PCR-rør ved tilsætning af 5x bufferen for at minimere prøvetabet.
    2. Åbn alle rør, tilsæt 0,1 x prøvebuffer i mængder, der er angivet i tabel 2, til hvert rør, og luk derefter umiddelbart efter. Hvis diskenhederne er identiske, skal du bruge en bakterende teknik. Hvis ikke, skal du forskylle pipetspidsen før dispensering af 0,1 x prøvebuffer.
    3. Åbn alle rør, tilsæt proteinprøve i mængder, der er angivet i tabel 2, til hvert rør, og luk derefter umiddelbart efter. Hvis diskenhederne er identiske, skal du bruge omvendt pipettingteknik. Hvis ikke, skal du forskylle pipetspidsen før dispensering af 0,1 x prøvebuffer.
    4. Centrifuger kort alle PCR-rør i en benchtopcentrifuge (13.000 x g i 30 s), svirp/vortex PCR-rør for at blande, og gentag derefter centrifugering.
    5. Overfør alle PCR-rør til termocycler med et opvarmet låg. Denatureprøver ved defineret temperatur og varighed (dvs. 95 °C i 5 min. 70 °C i 10 min. ).
      BEMÆRK: Denatureringstemperaturen og varigheden skal optimeres til målprotein.
    6. Gentag trin 3.12.4.
    7. Returner alle PCR rør til rør rack og sted på is.
    8. Under denatureringstrinnet skal udviklingsopløsningen (1:1 luminol-S:peroxidopløsning) klarlægges, og der tilsættes 200 μL luminol-S og 200 μL peroxid. Sted på is.
    9. For at lægge en CEI-forfyldt plade med den ovenfor fremstillede prøve skal reagenser og prøver i analysepladen, der er vist i analyselayoutet (figur 1). Undgå at indføre luftbobler.
      BEMÆRK: Hvis diskenheder og opløsning er identiske, skal du bruge en bakterieteknik. Hvis ikke, skal rørspidsen skylles før dispenseringen, og den må ikke udviseresten i pladen godt ved hjælp af det andet tabstop på pipetten. Et 12-230 kDa separationsmodul kan indeholde en farvekodet pladeindlæsningsvejledning. Placer denne vejledning under pladen, mens du tilføjer reagenser og prøver til brønden, hvilket visuelt hjælper, når prøven indlæses. Pladen-loading guide kan downloades fra virksomhedens hjemmeside, samt.
      1. I række E tilsættes 15 μL luminol:peroxid blanding til hver brønd.
        BEMÆRK: Ideelt set forberede denne reagens lige før brug og tilføje til hver brønd. Hvis dette ikke er praktisk, må denne blanding ikke tilberedes mere end 30 minutter før pladebelastning.
      2. I række D, til godt D1, tilsættes 10 μL streptavidin-HRP.
      3. I række D tilsættes 10 μL af det udpegede sekundære antistof i række D2-D25.
      4. I række B tilsættes til hver brønd 10 μL antistoffortyndingsmiddel.
      5. I række C, til godt C1, tilsættes 10 μL antistof fortyndingsmiddel.
      6. I række C, til brønde C2-C25, tilsættes 10 μL af udpegede primære antistof.
      7. I række A, for godt A1, tilsættes 5 μL biotinylated stigen fra PCR rør #1.
      8. I række A, til brønde A2-A25, tilsættes 3 μL af prøven, PCR rør #2-#25 i tilsvarende brønde #2-#25.
      9. Der tilsættes 500 μL vaskebuffer til hver udpeget vaskebufferbrønd.
      10. Centrifuger pladen i 5 min ved 1.000 x g ved RT.

Figure 1
Figur 1: Analyselayout. Både primære antistof og mål protein prøve optimering kan udføres i en analyse. Kapillærer 2-7, 8-13, 14-19 og 20-24 repræsenterer forskellige proteinkoncentration og primære antistofsortiment. Capillary 25 repræsenterer positiv kontrol. Anti-ERK antistof blev brugt; enhver passende positiv kontrol kan dog medtages. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Udførelse af CEI på plade 1

  1. Først skal du tænde CEI(Table of Materials) analysator, og derefter tænde computeren. Åbn softwaren(Tabel over materialer)
  2. Tilslut analysatoren til onlinesystemet (Materialetabellen). Dette er et nødvendigt skridt til at indsamle køre data til fejlfinding formål og data opsving.
  3. Klik på Instrument i menuen øverst til venstre, og klik derefter på Opret forbindelse. Vælg det instrumentserienummer, der vises som en pop op-menu. Klik på Opret forbindelse.
  4. Vælg fanen "Analyse", og vælg Ny analyse, eller vælg en gemt skabelon.
  5. Inputanalyseparametre (tabel 1) eller rediger skabelon i øjeblikket. Gem filnavnet og placeringen.
  6. Sørg for, at den blinkende blå farveindikator i analysatoren forbliver dækkende blå.
  7. Tryk på sølvmetalknappen oven på den orange dør for at åbne.
  8. Fjern forsigtigt kapillærpatronen fra emballagen. Indsæt kapillærpatronen som beskrevet i producentens protokol. Hvis det er korrekt installeret, bliver det indvendige lys til "blå".
  9. Fjern beskyttelsesforseglingen fra analysepladen. Visuelt observere de fyldte brønde for luftbobler. Hvis observeret, pop dem med en lille pipet tip (Lang aksel P10 pipet tip fungerer godt).
  10. Pladeholderen indlæses ved at placere analysepladen, og luk døren. Klik på knappen Start i computeren.
    1. Placer isbakken med temperaturfølsomme reagenser og prøver i mørke ved 4 °C, indtil den er klar til at forberede den anden fyldte plade.
    2. Lad reagenser/forsyninger være ude ved stuetemperatur for den anden plade.

5. Udførelse af CEI på plade 2

BEMÆRK: Denne plade er indstillet til analyse af fosforleret TDP-43 niveauer.

  1. Fjern den isbakke, der opbevares ved 4 °C, og anbring den på bænken, 1 time før den anslåede færdiggørelsestid for den første plade. Hent en anden plade og patron.
  2. Forbered eventuelle antistof fortyndinger er nødvendige for det andet løb og opbevar dem på is. Forbered frisk 1:1 luminol-S:peroxid opløsning (trin 3.12.8 ovenfor).
  3. Remix og kort recentrifugere prøven mix og reagenser er nødvendige for lastning af den fyldte plade. Den anden plade lægges i henhold til figur 1. Indlæs a-p(S409-410-2) TDP-43 antistofopløsning i række C brønde.
  4. Når den første kørsel er fuldført, skal du kassere den første plade og patron. Fjern patronen, og anbring patronen i en skarp beholder til bortskaffelse. Opbevar mærkaterne fra pladen og patronen til referenceformål.
  5. Luk softwarefilen, og vælg den samme skabelon igen. Softwaren vil huske indstillingerne fra den foregående kørsel. Foretag eventuelle ændringer i anmærkningen efter behov (dvs. ændring af det primære antistof).
  6. Gentag trin 4.8-4.10. Læg alle 12-230 kDa master kit separationsmodul reagenser og forsyninger væk
  7. Kassér tilovers CEI prøve-mix, antistof fortyndinger, 0,1x prøve buffer og luminol-S: peroxid blandinger i overensstemmelse med universitetets regler.

6. Dataanalyse

  1. Når kørslen er fuldført, skal du sørge for, at følgende kvalitetskontrol udføres.
    1. I software skal du vælge ikonet Vis standarder og fanen Grafvisning. Kontroller alle 25 kapillærer for spidsjusteringer ne til interne lysstofmarkørstørrelser. Ret forskydningerne ved at vælge Force Standard eller højreklikke på det forkerte højdepunkt og derefter vælge Ikke en standard. Udfør denne kontrol for hver ny kapillær.
    2. Klik på Eksempler og ikonet Enkelt visning. Vælg kapillær #1 (biotinylated stigen) under eksperimentfanen. Gennemgå spidsjusteringerne til molekylære vægtmarkører. Klik på toppen i grafvisning, og vælg Fjern spidsbelastning, hvis et forkert valg af toppen udføres af softwaren.
      BEMÆRK: Som et eksempel, vil 12-230 KDa biotinylated stigen vise dimensionering toppe på 12 kDa, 40 kDa, 66 kDa, 116 kDa, 180 kDa, og 230 kDa. Størrelsen af prøvetoppene vil være forkert, hvis dette trin ikke udføres, og vil generere unøjagtige resultater.
    3. Se den elektrofopetiske film, og bemærk, om der opstod unormal migration under kørslen.
    4. Udlede data (f.eks toppe tabel, herunder molekylvægt, peak område, peak højde, og signal-til-støj [S / N]) efter behov for yderligere beregninger. Der er grafanmærkningsværktøjer placeret i øverste højre hjørne af graph-vinduet for at give flere oplysninger om grafen.

Representative Results

Optimering af blodplade cytosolic protein koncentration og primære antistof titrering
Det er vigtigt at etablere et lineært dynamisk område af blodplade cytosolske proteiner i analysen, da ændringer i signaler er direkte proportionalmed ændringer i protein i blodplade cytosol. Brug af hele blodpladelysatblanding i analysen kan reducere signalintensiteten af målproteinerne (TDP-43 og P(S409-412) TDP-43) og bidrage til et højt baggrundssignal. Derfor blev det klare supernatant i denne analyse anvendt (cytosolfraktion) efter brudningsplader (figur 2).

Figure 2
Figur 2: Signalklarhed afhænger af prøvekvaliteten. A) Hele blodpladelysaten forstyrrer anti-TDP-43 antistofbindingen. derfor blev der observeret et støjende elektropherogram. B) Der blev opnået cytosolfraktion af blodplader ved at udsætte hele lysatet for centrifugering (16.000 x g i 30 min). De fleste af de membranøse proteiner blev fjernet; Derfor blev anti-TDP-43 antistofbinding til TDP-43 protein forbedret (sporing af blå linje). Klik her for at se en større version af denne figur.

Et lineært dynamisk område for blodpladecytosolproteinkoncentration blev etableret ved 0,2-0,8 mg/ml. En analyseskabelon blev vedtaget, således at både proteinkoncentration og primær antistoftitrering kunne udføres i en analyse (figur 3).

Figure 3
Figur 3: Lineært dynamisk område for blodpladecytosolproteinkoncentration. (A) Både proteinkoncentrationer og antistoftitre blev optimeret i én plade under samme kørsel. B) Det lineære arbejdsområde (0,2-0,8 mg/ml) for protein blev fastlagt. En 0,5 mg/ml protein belastning blev mærket af a-ERK antistof som den positive kontrol (kapillær 25). Klik her for at se en større version af denne figur.

Det skal bemærkes, at glycerolindholdet i prøvepræparatet skal være mindre end 20 % (endelig), ellers vil den høje glykkoncentration påvirke den primære antistofbinding negativt.

Bestemmelse af optimal eksponeringstid
I den ældre version af softwaren skulle den optimale eksponeringstid bestemmes ved at plotte toparealet mod proteinkoncentration (mg/ml). Den nye version indeholder et nyt værktøj med navnet hdr-profil (High Dynamic Range)(Figur 4). Brug af billedet panel gav mulighed for at se alle eksponeringgange (dvs. 5 s, 15 s, 30 s, 60 s, 120 s, 240 s, 480 s) sammen. Computersoftware analyserede alle eksponeringstider og identificerede automatisk den bedste eksponeringstid (HDR). HDR-detektionsprofilen leverede et betydeligt bredere dynamisk område på grund af CEI's større følsomhed, hvilket betyder bedre detektion og kvantificering over et større koncentrationsområde for prøver. Men, brugere har stadig mulighed for at vælge en eksponering tid, der opfylder det eksperimentelle mål. Ved hjælp af denne funktion blev der fundet optimal eksponeringstid for TDP-43-protein. Toppen repræsenterer den optimale eksponeringstid (figur 4A). Der blev defineret en enkelt eksponeringstid (4 s) for dette antistof efter at have gennemgået alle ni eksponeringstider på mellem 1-512 s (figur 4B).

Figure 4
Figur 4: HDR-registreringsprofil (High Dynamic Range) for et målprotein. (A) TDP-43 protein peak repræsenterer den optimale eksponeringtid for målet protein. a-TDP-43 Ab titrering var 1:300, og blodplade cytosol protein koncentration var 0,5 mg/ml. Den softwaredefinerede blå linje angiver den optimale eksponeringstid. (B) Dette tal repræsenterer en brugerdefineret enkelt eksponeringstid (4 s) efter at have gennemgået alle ni eksponeringstider på mellem 1-512 s. Klik her for at se en større version af dette tal.

TDP-43 niveauer i human trombocytosol af ALS patienter
En blodbase biomarkør udvikling blev udført. Ved hjælp af optimerede analysebetingelser blev blodpladelysate cytosolske fraktioner fra ALS-patienter analyseret ved hjælp af to sæt antistoffer (dvs. anti-TDP-43 [Pan] antistof, et antistof, der genkender fosforleret derivater af TDP-43 protein; her blev a-P [S409/410-2] TDP-43 anvendt). I denne demonstration præsenteres sygdomsspecifik TDP-43 og dets fosforede derivat (figur 5).

Figure 5
Figur 5: En repræsentation af den prædiktive fosforylationsværdi (PPV) på TDP-43. Den absolutte mængde fosforat TDP-43 og pan TDP-43 alene viste ikke stor forskel på ALS og kontrolgrupperne. PPV indikerede imidlertid en lille stigning i ALS-kohorten, selv om der ikke var nogen statistisk forskel mellem de to grupper på grund af utilstrækkeligt antal forsøgspersoner (ALS = 25, kontrol = 27). En lav Cohens d-værdi mellem ALS-midlerne og kontrolgruppen viste en lav effektstørrelse mellem de to grupper på grund af lille stikprøvestørrelse (kontrol = 25, ALS = 27). Klik her for at se en større version af denne figur.

I alt Blev TDP-43 kvantificeret ved hjælp af kalibreringskurven (figur 6)

Figure 6
Figur 6: Standardkalibreringskurve. Kommercielt købte rekombinant TDP-43 protein koncentrationer blev brugt til at konstruere en standard kurve. Hver data repræsenterer gennemsnittet af treeksemplarer. Proteinbåndintensiteterne var koncentrationsafhængige (Inset). Klik her for at se en større version af denne figur.

Kvantificeringen af phosphorylated TDP-43 protein var ikke mulig på grund af kommercielt manglende tilgængelighed af dette protein. I stedet blev der etableret en forudsagt fosforylationsværdi (PPV), der definerer procentdelen af de fosforylerede arter af TDP-43. PPV blev bestemt ud fra to sekventielle CEI-analyser for den samme prøve ved hjælp af følgende ligning.

Equation 1

Intra- og interkøringsanalysevariabilitet blev testet i fælles humane ALS-blodpladecytosolic fraktioner (figur 7)

Figure 7
Figur 7: Analysevariationer. (A) To kapillærer fyldt med samme prøve blev analyseret af CEI, og intra-run assay variation blev beregnet som CV% = 14,9. (B) Den samme prøve blev analyseret på tre forskellige analysedage og i tre forskellige analysekørsler. Inter-run assay variation blev beregnet som CV% = 18,7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Selv om koefficientvariationsværdierne inden for kørsel (kapillær-til kapillær variation) faldt i det acceptable interval (CV% = 14,9), var den interdrevne analyseværdi forholdsvis høj (CV% = 18,7). Det fortolkes, at denne variation kan skyldes brug af kapillær patroner og prøveplader fra forskellige partier. Det anbefales, at reproducerbarhedsundersøgelser udføres i CEI-komponenter, der har samme lotnummer.

Tabel 1: CEI-analysepladebelastningsskabelon. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Skabelon til forberedelse af interaktiv e-prøveblanding. Når de har indtastet bestandens proteinkoncentration fra ukendte prøver, beregner interaktive celler automatisk, hvor meget volumen der skal bruges til at forberede prøveblandingen. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Den kapillær elektroforetiske-baserede immunassay er nu den foretrukne metode til high-throughput prøve analyse og narkotika screeninger25. Små prøvemængder, veloptimerede analysekomponenter, brugervenlig analyseplatform og instrumentering, reagensudgifter og lav CV-procent er primære fordele26,27. Selv om der er flere metoder til adskillelse af proteiner i forskellige analysemodaliteter, kan det antistofbaserede CEI, der er beskrevet her, tilpasses af små laboratorier, der er involveret i blodbaseret biomarkørudvikling. Cei-analyseteknologien, der anvendes her, giver pålidelige, reproducerbare og følsomme målinger for TDP-4328 og dens fosforede derivat5.

CEI-systemet giver også et multiplexingvalg af analyse af TDP-43 og dets fosforerede derivater samtidigt og giver direkte kvantificering af målproteinet, hvis der findes renset eller rekombinant målprotein. Fuld længde rekombinant TDP-43 protein er kommercielt tilgængelige; Rekombinant phosphorylated TDP-43 derivat er dog ikke. Da phosphorylated TDP-43 ikke er kommercielt tilgængelig, blev der implementeret en prædiktiv fosforylationsværdi (PPV) for at vurdere TDP-43-profilen hos ALS-patienter. Pan TDP-43 og fosforede TDP-43-mængder blev permanent mærket med en fluorophore. TDP-43-profilen forbliver derfor den samme med eller uden en kvantitativ enhed (dvs. ng/ml, pg/ml osv.). Selv om fastsættelsen af den absolutte mængde TDP-43 og dets fosforede derivater (dvs. P [S409-410-12] TDP-43) giver en mere kvantitativ måling, idet beregningen af PPV eliminerer nødvendigheden af rekombinant phosphorylated TDP-43 til standardisering, da den ikke er kommercielt tilgængelig.

CEI giver flere checkpoints i analysen platform til præcist at identificere problemet i tilfælde af, at en analyse mislykkes. Dette eliminerer forhindringer og giver bedre eksperimentelt design. Analyseproceduren er fuldautomatisk bortset fra påfyldning af prøvepladen. Dette er en væsentlig funktion i forhold til standard vestlige blotting analyse. Denne funktion giver ensartethed fra kørsel til kørsel. Selv om hvert laboratorium har unikke standard driftsprocedurer, er det vigtigt at overholde praksis, der minimerer menneskelige fejl. For eksempel er det afgørende at forberede luminol-S/peroxid blandingen lige før plade lastning, da tilføje peroxid i luminol starter enzymatisk reaktion og forbruger luminol substrat. Lastning prøver og primære / sekundære antistoffer i plade brønde uden luftbobler er også kritisk vigtige trin.

Derudover, da pladen brønde er små i volumen, og der er ingen plads mellem brønde, brugere bør være forsigtig, mens pipetting, som er det vigtigste skridt, da alt andet er automatiseret. Belastningsrækkefølgen for prøverne, antistofferne og andre reagenser er vigtig for konsistensen af analysen (figur 1). Processen med plade forberedelse tager omkring 40-45 min. Det anbefales derfor først at læsse pladen med de nødvendige analysekomponenter og forberede luminol-S/peroxidblandingen lige før pipettering. På denne måde er der en konsekvent sekvens af reagens tilføje, og konsekvent luminescens signal styrke vil blive opnået. Det anbefales ikke at bruge et udløbet luminol-S/peroxidreagens, da det primært påvirker peroxidens styrke. De seneste fremskridt med indførelsen af split-buffer-systemet og herunder det kemiske og vaskemiddel kompatibilitet rækkevidde har forbedret analysen kvalitet og produceret mere reproducerbare og forudsigelige resultater. Nu, en ny combo-analysator fra samme producent har en funktion til at analysere de prøver mærket med chemiluminescens og fluorescens konjugerede antistoffer i samme løb. Denne nye funktion eliminerer behovet for at køre to individuelle plader og eliminerer run-to-run variation.

Analysepladerne skal opbevares i omgivelsestemperatur. Hvis det vælges at holde analysepladerne i et køleskab på 4 °C, skal pladerne tages ud natten før analysen og bringes til omgivelsestemperatur. Forkert indlæstprøve brønde skal være omfattende (4-5 gange) vasket med buffer leveres i kit, før du tilføjer den korrekte prøve. Hver primær antistof og biologiske prøver er unikke; derfor bør antistof/proteinoptimeringudføres, før prøverne for målproteiner analyseres i biologiske væsker.

Her blev den primære antistofinkubationstid sat til 30 min som standard. Hvis signalet er svagt, bør brugerne overveje at øge den primære antistofinkubationstid, indtil de når den ønskede signalstyrke uden fluorescenssignaludbrændthed. Til humane blodplader blev poolede prøver fra patienter forberedt og brugt til en optimeringsanalyse. Prøvesammenlægningen repræsenterer bedre variationen mellem målbiomolekyler. Det anbefales at anvende klare supernatanter i stedet for total lysat eller total homogenat for CEI.

Den høje koncentration af protein i hele blodpladelysatblanding kan nedsætte signal-støjforholdet (figur 2). Gentagne fryseoptøningscyklusser af prøver bør undgås, da dette påvirker den primære antistofbinding negativt. Ingredienserne i lysate buffer er vigtige, da nogle reagenser ikke er forenelige med CEI29. Det anbefales at krydstjekke listen over kompatible reagenser, der er angivet på fabrikantens websted, før prøven er klar. Dette er en begrænsning af systemet, der ikke tåler høje stringensbetingelser for prøveforberedelse. Det anbefales at optimere analyserunparametrene (dvs. primær antistoffortynding, proteinkoncentration, primær antistofinkubationstid osv.) ved hjælp af poolede prøver til efterfølgende at analysere de enkelte prøver.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse undtagen ProteinSimple, Inc. dækkede offentliggørelsen omkostningerne ved dette manuskript.

Acknowledgments

Denne forskning blev sponsoreret af et intramural tilskud tildelt A.A. Dette arbejde blev støttet af et CTSA-tilskud fra NCATS, der blev tildelt University of Kansas Medical Center for Frontiers: The Heartland Institute for Clinical and Translational Research (#UL1TR606381). Indholdet er udelukkende ophavsmændenes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis NIH's eller NCATS's officielle synspunkter. Vi er taknemmelige for University of Kansas Medical Center ALS klinik personlig for at opnå IRB godkendelse til blodprøve indsamling fra raske frivillige og ALS patienter. Forfatterne takker Emre Agbas for korrekturlæsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-230 kDa Separation kit ProteinSimple SM-W004 Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge
3000G Thermocycler Techne FTC3G/02 We used this thermocylcer for heating the sample mix
Anti-Mouse detection kit ProteinSimple 042-205 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody ProteinTech 22309-1-AP Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody CosmoBio-USA TIP-PTD-P02 Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-Rabbit detection kit ProteinSimple DM-001 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-TDP-43 (pan) antibody ProteinTech 10782-2-AP Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein
Compass for SimpleWestern (SW) ProteinSimple Ver.4.0.0. Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments
Sonic Dismembrator; Model100 Fisher Scientific Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350)
Table top centrifuge Eppendorf 22625004 Model# 5810 with swinging plate bucket
Wes analyzer ProteinSimple 55892-WS-2203 Performs the capillary gel electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blair, P., Flaumenhaft, R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates. Blood Reviews. 23 (4), 177-189 (2009).
  2. Mercado, C. P., Kilic, F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels. Molecular Interventions. 10 (4), 231-241 (2010).
  3. Goubau, C., et al. Regulated granule trafficking in platelets and neurons: a common molecular machinery. European Journal of Paediatric Neurology. 17 (2), 117-125 (2013).
  4. Basu, S. S., et al. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
  5. Wilhite, R., et al. Platelet phosphorylated TDP-43: an exploratory study for a peripheral surrogate biomarker development for Alzheimer's disease. Future Science OA. 3 (4), 238 (2017).
  6. Worth, A. J., et al. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. Journal of Visualized Experiments. (110), e53941 (2016).
  7. Statland, J. M., et al. Rasagiline for amyotrophic lateral sclerosis: A randomized, controlled trial. Muscle and Nerve. 59 (2), 201-207 (2019).
  8. Charytan, D. M., et al. Safety and cardiovascular efficacy of spironolactone in dialysis-dependent ESRD (SPin-D): a randomized, placebo-controlled, multiple dosage trial. Kidney International. 95 (4), 973-982 (2019).
  9. Ugras, S. E., Shorter, J. RNA-Binding Proteins in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Neurodegeneration. Neurology Research International. , 432780 (2012).
  10. Amador-Ortiz, C., et al. TDP-43 immunoreactivity in hippocampal sclerosis and Alzheimer's disease. Annal of Neurology. 61 (5), 435-445 (2007).
  11. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3539-3549 (2011).
  12. Buratti, E., Baralle, F. E. The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration. Advances in Genetics. 66, 1-34 (2009).
  13. Guo, W., et al. An ALS-associated mutation affecting TDP-43 enhances protein aggregation, fibril formation and neurotoxicity. Nature Structural Molecular Biology. 18 (7), 822-830 (2011).
  14. Geser, F., et al. Motor neuron disease clinically limited to the lower motor neuron is a diffuse TDP-43 proteinopathy. Acta Neuropathologica. 121 (4), 509-517 (2011).
  15. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  16. Buratti, E., Baralle, F. E. TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions. Trends in Biochemical Sciences. 37 (6), 237-247 (2012).
  17. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. The ALS disease protein TDP-43 is actively transported in motor neuron axons and regulates axon outgrowth. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3703-3718 (2012).
  18. Ayala, Y. M., et al. Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43. Journal of Cell Sciences. 121, Pt 22 3778-3785 (2008).
  19. Fiesel, F. C., Kahle, P. J. TDP-43 and FUS/TLS: cellular functions and implications for neurodegeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3550-3568 (2011).
  20. Birsa, N., Bentham, M. P., Fratta, P. Cytoplasmic functions of TDP-43 and FUS and their role in ALS. Seminars in Cell and Development Biology. , (2019).
  21. Liachko, N. F., et al. CDC7 inhibition blocks pathological TDP-43 phosphorylation and neurodegeneration. Annals of Neurology. 74 (1), 39-52 (2013).
  22. Qureshi, A. H., et al. Proteomic and phospho-proteomic profile of human platelets in basal, resting state: insights into integrin signaling. PLoS One. 4 (10), 7627 (2009).
  23. Suominen, I., Koivisto, S. Increasing Precision When Pipetting Protein Samples: Assessing Reliability of the Reverse Pipetting Technique. American Laboratory. , (2011).
  24. Pipetting tool box for life sciences. , https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html (2019).
  25. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communication. 9 (1), 5167 (2018).
  26. Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. Journal of Translational Medicine. 13, 182 (2015).
  27. Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
  28. Fourier, A., et al. Development of an automated capillary nano-immunoassay-Simple Western assay-to quantify total TDP43 protein in human platelet samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 267-275 (2019).
  29. Compatibility, S.W.S.A.B. , https://www.proteinsimple.com/technical_library.html (2017).

Tags

Neurovidenskab TDP-43 fosforlated TDP-43 kapillær elektroforese human blodplade neurodegenerative sygdomme biomarkør prædiktiv fosforylationsværdi analyseoptimering
Brug af kapillær elektroforese Immunoassay at søge efter potentielle biomarkører for amyotrofisk lateral sklerose i humane blodplader
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sage, J. M., Hall, L., McVey, A.,… More

Sage, J. M., Hall, L., McVey, A., Barohn, R. J., Statland, J. M., Jawdat, O., Dimachkie, M. M., Agbas, A. Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets. J. Vis. Exp. (156), e60638, doi:10.3791/60638 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter