Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (Apis mellifera)

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61725
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Illinois, 2Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

Summary

Hier beschrijven we twee protocollen: ten eerste om grote hoeveelheden niet-omhulde virusdeeltjes van honingbijen te vermeerderen, te extraheren, te zuiveren en te kwantificeren, inclusief een methode voor het verwijderen van honingbijpoppen en ten tweede om de effecten van virale infectie te testen met behulp van een zeer herhaalbare kooibioassay met hoge doorvoer.

Abstract

Honingbijen zijn van groot ecologisch en agrarisch belang over de hele wereld, maar zijn ook onderhevig aan een verscheidenheid aan druk die de gezondheid van bijen negatief beïnvloedt, waaronder blootstelling aan virale pathogenen. Dergelijke virussen kunnen een breed scala aan verwoestende effecten veroorzaken en kunnen vaak een uitdaging zijn om te bestuderen vanwege meerdere factoren die het moeilijk maken om de effecten van experimentele behandelingen te scheiden van reeds bestaande achtergrondinfectie. Hier presenteren we een methode om grote hoeveelheden virusdeeltjes massaal te produceren, samen met een bioassay met hoge doorvoer om virale infecties en effecten te testen. Noodzakelijk door het huidige gebrek aan een continue, virusvrije cellijn van honingbijen, worden virale deeltjes in vivo versterkt met behulp van honingbijpoppen, die in grote hoeveelheden uit de korf worden geëxtraheerd met behulp van minimaal stressvolle methodologie. Deze virusdeeltjes kunnen vervolgens worden gebruikt in bioassays van honingbijenkooien om de levensvatbaarheid van inentcula te testen, evenals verschillende andere virusinfectiedynamiek, waaronder interacties met voeding, pesticiden en andere pathogenen. Een groot voordeel van het gebruik van dergelijke deeltjes is dat het de kans op het introduceren van onbekende variabelen in latere experimenten aanzienlijk vermindert in vergelijking met de huidige alternatieven, zoals infectie via geïnfecteerde bijenhemolymfe of homogenaat, hoewel er nog steeds voorzichtig moet worden omgegaan bij het vinden van de bijen, om achtergrondvirusbesmetting te minimaliseren. De kooitests zijn geen vervanging voor grootschalige, veldrealistische experimenten die virusinfectie-effecten op kolonieniveau testen, maar functioneren in plaats daarvan als een methode om baseline virale reacties vast te stellen die, in combinatie met de semi-zuivere virusdeeltjes, kunnen dienen als belangrijke hulpmiddelen om verschillende dimensies van fysiologische interacties tussen honingbijen en virussen te onderzoeken.

Introduction

Honingbijen (Apis mellifera) spelen een cruciale rol in het moderne wereldwijde landbouwlandschap, maar lijden momenteel aan een combinatie van biotische en abiotische stressoren, waaronder blootstelling aan pesticiden, slecht ruwvoer, parasieten en pathogenen 1,2. Een van de belangrijkste pathogenen van zorg zijn virussen, waarvan er vele worden overgedragen door een andere van de belangrijkste honingbijstressoren, de parasitaire Varroamijt (Varroa destructor). Deze virussen kunnen een reeks negatieve effecten bij honingbijen veroorzaken, waaronder verminderde broedoverleving, ontwikkelingsstoornissen en verlamming die kunnen leiden tot totale ineenstorting van de korf, zowel voor als na overwinteringsperioden 3,4,5. Hoewel er veelbelovende vooruitgang is geboekt bij de ontwikkeling van technologieën die worden gebruikt om virusinfecties te bestrijden 6,7,8,9, is de dynamiek waarmee veel virussen zich verspreiden, verspreiden en interageren binnen een honingbij of kolonie nog steeds slecht begrepen 5,10 . Het begrijpen van de basisbiologie van honingbij- en virusinteracties en hun relaties met andere omgevingsfactoren is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van effectieve virusbeheertechnieken.

Het bestuderen van interacties tussen honingbijen en virussen vormt echter uitdagingen met tal van bekende en onbekende factoren die het proces bemoeilijken. Deze omvatten interacties met dieet11,12, blootstelling aan pesticiden13 en genetische achtergrond bijen14,15. Zelfs wanneer ze zich alleen richten op virusinfectie, komen complicaties vaak voor omdat honingbijenpopulaties, zowel beheerd als wild, altijd een zekere mate van achtergrondvirusinfectie hebben, hoewel vaak zonder acute symptomen te manifesteren16,17, en de effecten van virus-co-infectie zijn niet goed begrepen18. Dit heeft de studie van honingbijviruseffecten moeilijk te ontwarren gemaakt.

Veel honingbijvirusstudies hebben circumstantial virusinfecties gebruikt om te zoeken naar interacties met andere stressoren, waarbij wordt waargenomen hoe achtergrondinfecties veranderen met andere behandelingen 12,19,20,21. Hoewel deze aanpak succesvol is geweest bij het identificeren van belangrijke effecten, met name het ontdekken hoe pesticiden of dieetbehandelingen de virusniveaus en replicatie beïnvloeden, is inenting met een virusbehandeling met bekende inhoud en concentratie van cruciaal belang voor het experimenteel testen van de dynamiek van virusinfecties. Toch kan het scheiden van experimentele behandeling van achtergrondinfectie ook uitdagingen opleveren. In veldstudies hebben onderzoekers stammen van het misvormde vleugelvirus (DWV) gedifferentieerd om bewijs te leveren voor virusoverdracht van honingbijen naar hommels22, maar het gebruik van deze aanpak zou moeilijk zijn bij honingbijen alleen. Virus infectieuze klonen zijn een krachtig hulpmiddel, niet alleen voor het volgen van infectie 23,24,25 maar ook voor omgekeerde genetische studies van honingbijvirussen en voor virus-gastheer interactie onderzoek 26,27,28. In de meeste gevallen zijn infectieuze klonen echter nog steeds nodig om de infectiecyclus in cellen te vervullen om deeltjes te produceren. Dergelijke deeltjes hebben de voorkeur als inocula voor experimentele behandelingen omdat hun infectiviteit hoger is dan het naakte virale RNA en inenting met ingekapselde genomen een natuurlijke infectie nabootst.

De productie van zuivere, niet-verontreinigde inencula uit het honingbijenvirus (virusstammen van het wilde type of stammen die zijn afgeleid van infectieuze klonen) vormt ook een uitdaging. Deze zijn voornamelijk te wijten aan de moeilijkheden bij het verkrijgen van een betrouwbare, continu replicerende, virusvrije honingbijencellijn om zuivere stamvirussen te produceren29,30. Hoewel sommige cellijnen zijn geproduceerd, blijven deze systemen onvolmaakt; toch is er hoop dat er een levensvatbare cellijn kan worden geproduceerd29, die een fijnere controle van de virusproductie en -onderzoek mogelijk zou maken. Totdat een dergelijke lijn op grote schaal beschikbaar komt, zullen de meeste virusproductieprotocollen blijven vertrouwen op het gebruik van in vivo virusproductie en -zuivering 18,31,32,33,34. Deze benaderingen omvatten het identificeren en zuiveren van virusdeeltjes van belang (of het produceren van een infectieuze kloon) en het gebruik ervan om honingbijen te infecteren, meestal als poppen. De poppen worden geïnjecteerd met het doelvirus en vervolgens opgeofferd, en verdere deeltjes worden geëxtraheerd en gezuiverd. Omdat echter geen bijen om te beginnen virusvrij zijn, is er altijd een zekere mate van besmetting van sporen van andere virussen in een dergelijk concentraat, en daarom moet grote zorg worden besteed aan het kiezen van bijen met een lage kans op achtergrondinfecties. Verder zijn methoden voor het verwijderen van de poppen uit de kamcellen voor gebruik in deze protocollen33 zeer arbeidsintensief en kunnen ze stress bij de bijen veroorzaken, waardoor de productie op deze manier wordt beperkt18,32. Hier rapporteren we een alternatieve methode die grootschalige verwijdering van larven mogelijk maakt met weinig arbeid en minder mechanische stress op de bijen.

Zodra poppen zijn verkregen en geïnjecteerd met het beginnende virus entmateriaal, moeten ze worden geïncubeerd om het virus de tijd te geven zich te vermenigvuldigen. Vervolgens kunnen geproduceerde virusdeeltjes worden verwerkt tot een vorm die bruikbaar is om experimentele bijen te infecteren. Er zijn verschillende eenvoudige methoden om dit te bereiken, waaronder het gebruik van een ruw homogenaat35,36 of hemolymfe gegenereerd door viraal geïnfecteerde bijen als een bron van infectie37. Deze methoden zijn effectief, maar lopen op een grotere kans om onbekende variabelen uit het achtergrondsubstraat te introduceren (bijvoorbeeld andere factoren in de dode bijenhomogenaten). Bovendien is het wenselijk om de deeltjes te concentreren als een experiment vereist dat in korte tijd een grote, bekende dosis van een virus wordt gegeven. Daarom heeft het voor een betere controle de voorkeur om methoden te gebruiken die een zekere mate van zuivering en concentratie van de virusdeeltjes mogelijk maken. Over het algemeen zal een reeks neerslag- en centrifugeringsstappen resulteren in de verwijdering van bijna al het mogelijke niet-doelvirusmateriaal33.

Na de productie van dit geconcentreerde entmateriaal is het gunstig om de virale titers (qPCR) te kwantificeren en te karakteriseren met in vivo bioassays om de levensvatbaarheid en het vermogen om sterfte te veroorzaken te testen, en om te bevestigen dat verhoogde virustiters worden verkregen na infectie. Dit kan worden bereikt door injectie-experimenten (in poppen of volwassenen) of voedingsexperimenten (in larven of volwassenen). Hoewel al deze benaderingen mogelijk zijn, is het voeren aan groepen volwassen bijen in een kooi vaak de snelste en eenvoudigste. De kooitestmethode wordt ook veel gebruikt voor het testen van verschillende andere behandelingen op bijen, waaronder pesticidentoxiciteit38, ovariumontwikkeling39 en voedingsinvloed op gedrag40,41 en kan daarom een goede basis vormen voor experimenten die virusinfectie koppelen aan andere factoren42.

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het produceren van grote hoeveelheden semi-zuivere, hoogverrijkte virusdeeltjes zonder een dure ultracentrifuge te gebruiken, inclusief een methode voor het verwijderen van poppen die arbeid en mechanische stress op de bijen vermindert en een zeer herhaalbare, high-throughput bioassay voor het testen van virale infectie en effecten. Door de zuiverheid van het virale entapparaat strak te controleren, kunnen onderzoekers de variatie in de virale respons van honingbijen verminderen ten opzichte van andere virale inentingsmethoden. Bovendien kan de bioassay screenen op virale effecten op een niveau van kleine groepen met behulp van zeer herhaalbare experimentele eenheden voordat wordt geschaald naar veldrealistische instellingen, wat veel arbeidsintensiever is om te beheren. In combinatie bieden deze twee methoden de nodige hulpmiddelen voor studies die kunnen helpen ons algehele begrip van fysiologische interacties tussen honingbijen en virussen te verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Massale bijenextractie optie 1: larvale zelfverwijdering

  1. Kooi een honingbijenkoningin op een lege, uitgesponnen Langstroth-frame en breng haar terug naar haar kolonie. Laat de koningin 24 uur lang eieren leggen op dit frame.
    1. Controleer het frame na 24 uur om er zeker van te zijn dat de meeste kamcellen nieuw gelegde eieren bevatten. Afhankelijk van de koningin en kolonie worden eieren soms niet goed gelegd in de eerste 24 uur. Als dit gebeurt, houd dan rekening met een extra 24 uur en pas de tijd indien nodig aan.
  2. Laat na de 24-uurs eierlegperiode de koningin los. Markeer het frame duidelijk en breng het terug naar de kolonie.
  3. Precies 192 h (8 dagen) na het insluiten van de koningin (uitgaande van normale eierlegging binnen de eerste 24 uur; 8 dagen markeert het punt vlak voor de verpopping), verwijder het gemarkeerde frame uit de kolonie. Borstel alle volwassen bijen af en breng het frame over naar een incubator die overeenkomt met de interne omstandigheden van een korf (34 °C en 50% relatieve vochtigheid (RV)).
    1. Controleer of het grootste deel van het frame gevuld is met 5e instarlarven, die te herkennen zijn aan hun grote, witte, c-vormige lichamen die strak tegen de onderranden van de kamcellen zijn gedrukt. Er zullen waarschijnlijk ook een paar cellen zijn die al bedekt zijn door een wasafdekking, vooral in de buurt van het midden van het frame.
  4. Bereid containers voor die overeenkomen met de hoogte en breedte van het met larven gevulde frame om de 5e instar-larven te ontvangen door de binnen- en buitenoppervlakken grondig te reinigen met water en zeep, gevolgd door een bleekoplossing en ten slotte ethanol. Droog de container grondig af voordat u verder gaat.
    1. Bekleed de bodem van de containers met verschillende lagen papieren handdoeken. Voeg vervolgens verschillende overlappende lagen dunnere, absorberende reinigingsdoekjes (bijv. Delicate taakwissers) of filterpapier toe. Het materiaal moet absorberend zijn. Vermijd overlapping van de toplaag om het gemak van toekomstige larvale overdracht te verbeteren.
  5. Plaats frames met de voorkant naar beneden (met focale larven naar beneden gericht) bovenop de containers, zodat de larven op de laag reinigingsdoekjes kunnen vallen.
    1. Bedek de container en het frame met een tentstuk aluminiumfolie of een andere bekleding om vocht vast te houden en breng de opstelling terug naar de incubator. Laat de installatie 's nachts staan. De natuurlijke voedselzoekende neigingen van de larven zullen ervoor zorgen dat ze uit hun cellen kruipen en op het gewatteerde oppervlak eronder vallen.
  6. Bereid afzonderlijke transferbakken voor door ze grondig te reinigen met behulp van dezelfde stappen als beschreven in 1.4. Laat trays drogen en bedek de bodems met reinigingsdoekjes. De trays hoeven geen specifieke afmetingen te hebben, maar ondiepere trays zorgen voor gemakkelijker larvale manipulaties.
    1. Begin met het overbrengen van de larven van de containers naar de trays door voorzichtig individuele doekjes van de bovenste laag in de containers op te tillen en de larven voorzichtig op de trays te gieten. De larven moeten 's nachts in de containers zijn gevallen en verschillende kleverige massa's hebben gevormd (figuur 1A).
    2. Gebruik stompe zachte tangen om de larven te scheiden en leg ze over het oppervlak van de trays. Ze hoeven niet gelijkmatig verdeeld te zijn en kunnen dicht bij elkaar liggen, maar mogen elkaar niet raken. Zie figuur 1B voor een visuele weergave van gescheiden larven.
    3. Maak van deze gelegenheid gebruik om beschadigde (verkleurde) of ondergemiddelde larven te verwijderen. Deze hebben meer kans om te sterven tijdens het rijpingsproces en kunnen infecties / schimmelgroei door de hele lade brengen.
  7. Bedek de lade met tentvormige aluminiumfolie om vocht vast te houden en breng de opstelling terug naar de incubator.
  8. Controleer de larven dagelijks en verwijder alle verkleurde (donkerbruin of zwart).
    OPMERKING: De larven /pre-poppen zullen op de reinigingsdoekjes poepen en zich manifesteren als kleine bruine vlekken. Ze kunnen ook kleine hoeveelheden witte, piekerige webbing produceren als onderdeel van hun aftoppingsproces. Geen van deze voorvallen vereist de vervanging van de reinigingsdoekjes, zolang ze absorberend zijn.
  9. Laat larven verpoppen en rijpen tot het stadium met witte ogen, dat kan worden geïdentificeerd aan de hand van hun algemene vorm die overeenkomt met die van een volwassen bij, terwijl ze nog steeds pigmentatie in hun ogen en het grootste deel van de rest van hun lichaam missen. Dit moet gebeuren tussen 14 en 15 dagen na het cateren van de koningin. De poppen zijn nu klaar voor virusinjectie. Figuur 1C, 1D voor voorbeelden van witte-oogpoppen.

2. Massale bijenextractie optie 2: handmatige popexcisie

OPMERKING: Hoewel optie 2 (popexcisie) een haalbare methode voor bijenextractie is, heeft het ook verschillende nadelen in vergelijking met optie 1 (larvale zelfverwijdering). Optie 2 is veel arbeidsintensiever, moeilijker te controleren voor de popleeftijd en over het algemeen meer belastend voor de bijen zelf. Optie 1 wordt waar mogelijk aanbevolen.

  1. Selecteer een frame van afgedekt honingbijenbroed met poppen in of nabij het witteoogstadium (zie 1.9 voor een beschrijving) van een geschikte kolonie. Verwijder de afdekking van kamcellen in de buurt van het midden en de randen van het frame om de aanwezigheid van de juiste ontwikkelingsfase te bevestigen.
  2. Breng het frame over naar een incubator die is ingesteld op 34 °C en 50% relatieve vochtigheid. Breng het frame altijd terug naar de couveuse wanneer het niet onmiddellijk wordt gebruikt.
  3. Bereid en reinig overslagbakken die identiek zijn aan de in punt 1.6 beschreven trays.
  4. Haal het frame uit de couveuse en zet het op een schuine standaard onder een lichtbron. Bevochtig een klein stapeltje keukenpapier met water.
  5. Reinig een stompe harde tang met ethanol. Verwijder met behulp van de schone tang de afdekking van de cellen met witte-oogpoppen en zorg ervoor dat de poppen tijdens het proces niet worden beschadigd.
  6. Snijd de poppen een voor een voorzichtig uit de kamcellen. Het is het veiligst om de poppen rond de thorax en buik te grijpen met behulp van de tangpunten, als er voldoende ruimte is. Zo niet, dan kunnen poppen echter ook worden verwijderd door het hoofd vast te pakken en langzaam ver genoeg naar buiten te wiebelen om vervolgens rond het lichaam te worden gegrepen.
    1. Bedek de delen van het frame die niet onmiddellijk toegankelijk zijn met natte papieren handdoeken om vocht vast te houden. Verwijder en vervang indien nodig tijdens het excisieproces.
  7. Plaats de weggesneden poppen langs de reinigingsdoekjes in de transferbakken en zorg ervoor dat geen van hen elkaar raakt. Alle misvormde of verkleurde poppen moeten worden weggegooid. Poppen zijn nu klaar voor virusinjectie.
    1. Gooi poppen weg die vocht afgeven bij contact met de doekjes; ze zijn waarschijnlijk doorboord. Soms vertonen poppen kleine donkere vlekken van melanisatie in de buurt van de contactpunten met de tang binnen 1 uur na verwijdering. Dit mag de overleving niet beïnvloeden. Als er grote stukken melanisatie verschijnen, moeten de aangetaste poppen worden weggegooid.

3. Pupal virus injectie

OPMERKING: Als u dit protocol voor de eerste keer uitvoert (d.w.z. zonder eerdere virale entauwkerende voorraden), eerst deeltjes extraheren en concentreren met behulp van volwassenen, poppen of larven uit een kolonie met een vermoedelijke infectie. Meet de virale titers in het resulterende entmateriaal zoals beschreven in stap 5 en bepaal welke deeltjes zich verder moeten voortplanten.

  1. Steriliseer alle werkoppervlakken met bleekwater en ethanol voordat u begint te werken met honingbijvirussen. Nitril handschoenen moeten tijdens het hele proces worden gedragen.
  2. Bereid een injectorapparaat voor dat vloeistof in hoeveelheden van ~ 1 μL kan injecteren.
    OPMERKING: Een goedkope maar effectieve aanpak zou zijn om een handgemaakt apparaat te maken door een 30 G hypodermische naald aan de punt van een 100 μL multi-dispenser tip (zie Tabel met materialen) te bevestigen met behulp van flexibele epoxy of een andere vloeibare lijm. Zorg ervoor dat de randen van de naalddop goed zijn afgedicht tegen de punt van de multi-dispenser en laat het apparaat drogen. Zie figuur 2 voor een visuele weergave van een voorbeeldinjectorapparaat.
  3. Bereid een virusinjectie verdunningsoplossing door het gewenste type virusdeeltjes te mengen met gesteriliseerde 1x PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) in een conische centrifugebuis van 15 ml. De totale benodigde hoeveelheid is afhankelijk van het aantal poppen dat moet worden geïnjecteerd, waarbij elke pop een injectie van 1 μL nodig heeft (bijv. 500 poppen = 5 μL virusdeeltjes + 495 μL PBS).
  4. Bevestig het injectorapparaat aan een handmatige multipipet en test de werkzaamheid door 100 μL water uit een afzonderlijk bekerglas op te zuigen en in doses van 1 μL af te geven. Zorg ervoor dat elke afgegeven hoeveelheid gelijk is en vervang injectorapparatuur indien nodig. Verwijder het resterende water van de injector.
  5. Haal de trays met poppen die in stap 1 of stap 2 zijn gegenereerd uit de incubator en verwijder de aluminiumfoliebedekking.
  6. Reinig een stompe harde tang met ethanol. Pak de individuele pop voorzichtig vast langs de thorax en oefen net genoeg druk uit om interne vloeistoffen naar de buik te dwingen. Dit moet de tergite-verdeeldheid duidelijker maken.
  7. Trek met de multipipet 100 μL van de virusdeeltjeoplossing op, steek de naald tussen de derde en vierde abdominale tergiten en injecteer 1 μL van de virusoplossing. Herhaal dit voor elke pop die op de trays ligt en zorg ervoor dat herhaalde injecties worden vermeden. Alle poppen die tijdens het proces zijn beschadigd, moeten worden weggegooid.
    LET OP: Alle viruspreparaatgerelateerde materialen worden aangeduid als biorisico's en moeten worden geautoclaveerd en verwijderd volgens de institutionele richtlijnen. Naalden moeten ook worden weggegooid volgens institutionele richtlijnen.
  8. Bedek de trays met geïnjecteerde poppen met aluminiumfolie en keer terug naar de incubator. Laat de virusdeeltjes zich gedurende 3-5 dagen in de poppen voortplanten.
    1. Voer dagelijkse inspecties uit op de poppen en verwijder dode of rottende exemplaren om bacteriën of schimmelophoping te voorkomen. Kleine punten van melanisatie kunnen verschijnen op de injectieplaats op de buik, maar mogen de overleving niet beïnvloeden.
  9. Bemonster de poppen in conische centrifugebuizen van 50 ml en vortex om de inhoud te homogeniseren, waarbij u ervoor zorgt dat poppen per koloniebron in buizen worden bemonsterd om besmetting door niet-doelvirussen te verminderen. Zorg ervoor dat er geen hele poppen achterblijven en breng de buisjes over naar een vriezer van -80 °C totdat ze klaar zijn voor neerslag en concentratie van virusdeeltjes.

4. Concentratie van virusdeeltjes

OPMERKING: Dit protocol is niet getest voor het herstel van omhulde virussen.

  1. Autoclaaf alle materialen en containers voor gebruik. Nitrilhandschoenen, laboratoriumjassen en oogbescherming moeten tijdens dit hele proces worden gedragen. Steriliseer alle werkoppervlakken met bleekwater, ethanol en RNase-inactiverende oplossing voordat u begint.
    1. Bereid 1x TES (Tris-EDTA-zout) buffer voor: Meng 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 2 mM EDTA en 150 mM NaCl. Steriliseren door autoclaveren.
  2. Ontdooi gehomogeniseerde poppen en breng over naar centrifugeflessen. Voeg ongeveer drie volumes van 1x PBS toe (voeg bijvoorbeeld een volledige buis poppen van 50 ml toe aan 150 ml 1x PBS) en maak de volumes gelijk aan die van de volste fles.
  3. Meng eerst met de hand en vervolgens door het gedurende 10 minuten op een orbitale shaker bij kamertemperatuur te plaatsen.
  4. Centrifugeer bij 15.000 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten om celresten te verwijderen. Herhaal deze stap indien nodig als er celresten achterblijven.
    1. Als het supernatant grote vetbolletjes aan het oppervlak heeft, filter dan door kaasdoek in afzonderlijke steriele centrifugeflessen voordat u verdergaat.
  5. Extraheer het supernatant met 0,3 volumes 24:1 chloroform:isoamylalcoholoplossing (bijv. 190 ml supernatant + 57 ml chloroform:isoamylalcohol) en meng door inversie. Centrifugeer bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 20 min.
    LET OP: Vermijd direct contact met chloroform op de huid of ogen. Draag altijd de juiste PBM's. Al het chloroformafval moet worden verwijderd volgens institutionele richtsnoeren.
  6. Herstel de waterige fase uit elke fles door het supernatant te decanteren in afzonderlijke steriele bekers van 500 ml in een ijsbad of in een koude ruimte van 4 °C. Zorg ervoor dat u het supernatant niet verontreinigt met chloroform, omdat dit het zuiveringsproces moeilijker zal maken; het is beter om een beetje waterige fase te verliezen.
  7. Voeg RNase-vrij water toe om elk bekerglas tot een volume van 200 ml te brengen. Leg de bekers op magneetroerplaten en laat er een middelgrote roerstaaf in vallen. Zet de borden op een middelhoge stand.
  8. Voeg langzaam NaCl toe aan elk bekerglas onder constant zacht roeren, waardoor elk tot een eindconcentratie van 2,3% komt (bijv. 4,6 g NaCl per 200 ml supernatant). Voeg polyethyleenglycol 8000 (PEG) toe aan elk bekerglas tot een eindconcentratie van 7% (bijv. 14 g PEG per 200 ml van het supernatant).
  9. Bedek de bekers met aluminiumfolie en blijf met een middellage snelheid roeren op ijs of in een koude ruimte gedurende 1-5 uur om de PEG op te lossen. Hoe meer tijd besteed wordt aan het roeren, hoe grondiger de PEG zal oplossen.
  10. Zet de roerplaten uit. Incubeer de bedekte bekers gedurende 1-3 dagen op ijs of in een koude kamer om virusdeeltjes en eiwitten te laten neerslaan. Hoe meer tijd besteed aan het broeden, hoe meer deeltjes er neerslaan.
  11. Breng de inhoud van elk bekerglas over in afzonderlijke schone centrifugeflessen en centrifugeer bij 15.000 x g bij 4 °C gedurende 30 minuten om een PEG-deeltjespellet terug te winnen. Gooi het supernatant weg.
  12. Schraap de PEG-deeltjeskorrel voorzichtig van de zijkanten van de fles en resuspend ze in minimale volumes van 1x TES-buffer in schone bekers door langzaam kleine hoeveelheden TES aan de pellets toe te voegen (ongeveer 10 ml per 100 originele bijen).
  13. Laat de gesuspendeerde pellet ten minste tien keer door een naald van 18 G gaan voordat u deze in centrifugebuizen van 2 ml brengt. Houd alle tubes op ijs tot ze klaar zijn voor 4.14 uur.
  14. Centrifugeer buizen van 2 ml bij 13.000 x g bij 4 °C gedurende 15 minuten om extra PEG te verwijderen. Breng het supernatant over in een andere centrifugebuis van 2 ml met behulp van een pipet van 1.000 μL en herhaal de centrifugatiestap om ervoor te zorgen dat alle PEG volledig wordt verwijderd.
  15. Concentreer de resterende deeltjes in het supernatant in nieuwe centrifugebuizen met behulp van centrifugaalfiltereenheden (100 kDa cutoff) via verschillende centrifugatierondes bij 14.000 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten elk totdat ongeveer een vijfde van de oorspronkelijke concentratie (10 ml deeltjes-TES-oplossing tot ongeveer 2 ml geconcentreerde deeltjes) is bereikt. De filterunits zijn er in verschillende maten; selecteer de meest geschikte voor het aantal monsters dat wordt verwerkt. De eenheden die in conische buizen van 15 ml passen, zijn meestal het meest geschikt.
  16. Resuspend de geconcentreerde deeltjes door door een 26 G hypodermische naald te gaan en centrifugeer bij 14.000 x g bij RT gedurende 5 minuten voor een laatste ronde peg-verwijdering. Als de vloeistof nog steeds troebel is, herhaal dit dan totdat alle PEG-neerslag is verwijderd.
  17. Vul het viskeuze supernatant in de gewenste hoeveelheden en bewaar het bij -80 °C tot het klaar is voor gebruik.

5. Virus RNA extractie en kwantificering

  1. Extract RNA uit hele bijen of geconcentreerde virusdeeltjes met behulp van een geschikte RNA-extractiemethode (bijv. TRIzol RNA-extractiereagens gevolgd door DNase-behandeling).
  2. Kwantificeer virustiters in entmateriaal gegenereerd in stap 5.1 via RT-qPCR, bij voorkeur met behulp van een op de standaardcurve gebaseerde methode die niet afhankelijk is van gastheergenexpressie18, hoewel andere methoden ook schattingen mogelijk maken.

6. Virale voedingsbioassay

  1. Bereid alle benodigde materialen voor de bioassay voor vóór de frameverzamelingsstap (6.2) of tijdens de 24-uurs bijenopkomstperiode (6.3).
    1. Bereid schone kooien of andere leefruimten voor waarin het aantal bijen kan worden ondergebracht dat nodig is voor de bioassay (bv. acrylkistenkooien van 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm) door alle invoergaten te dichten met een centrifugebuis van de juiste grootte (figuur 3). Bepaal en randomiseer behandelingen tussen de kooien en label ze allemaal met hun aangewezen behandeling voor eenvoudige toekomstige referentie.
    2. Bereid entbakjes voor door individuele middelgrote weegboten te etiketteren met hun bijbehorende kooi en behandeling.
    3. Bereid de voedingsoplossing door de juiste hoeveelheid sucrose te mengen met gedeïoniseerd water (bijv. 300 g sucrose per 1 l water voor een 30% sucrose-oplossing), zorg ervoor dat het water wordt gesteriliseerd voor en na het toevoegen van sucrose. Steriele sucrose-oplossing kan enkele weken in een koelkast van 4 °C worden bewaard, maar moet worden weggegooid als er troebelheid optreedt.
    4. Bereid voedingsbuizen voor door centrifugebuizen van 15 ml gedeeltelijk te vullen met voedingsoplossingen geproduceerd in 6.1.3, ze om te keren en 1-2 gaten rond de punt van de buis te prikken met een duimzak. Gaten kunnen ook worden gesmolten met behulp van een 18G hypodermische naald verwarmd boven een vlam. Zorg ervoor dat de doppen van de voedingsbuis zeer stevig zijn vastgeschroefd, omdat loszittende doppen langzame lekken kunnen veroorzaken die kooibewoners 's nachts zullen verdrinken.
      OPMERKING: Voedingsoplossingen en het volume van de voedingssonde kunnen indien nodig worden aangepast aan de experimentele behoeften.
    5. Bereid een verzameling voor die ontvankelijk is voor nieuw opgekomen bijen door de randen van een grote kuip licht te bedekken met plantaardige olie of een vergelijkbare vettige substantie. Bereid afzonderlijk verschillende kleine kopjes met dezelfde coatingmethode.
  2. Selecteer en verwijder frames van honingbijenbroed op de rand van eclosie afkomstig van ten minste drie afzonderlijke bijenkorven. Passend oude bijen lijken op volledig gepigmenteerde volwassenen onder de kamcelafdekking. Een zeker teken van voortdurende opkomst is het observeren van celbewoners die langzaam hun weg naar buiten kauwen en / of onlangs geleegde cellen met karakteristieke gekartelde kauwsporen langs de wasafdekking.
    OPMERKING: De exacte hoeveelheid frames die nodig is, is afhankelijk van de grootte van het experiment, de hoeveelheid opkomend broed per frame en de tijd van het jaar. Een standaard Langstroth diep frame bevat ~3.000 kamcellen per zijde; een frame met voornamelijk afgedekte poppen, met enkele waargenomen opkomende kan gemakkelijk 400+ bijen produceren in 24 uur. Pas gedurende het seizoen aan, indien nodig.
  3. Borstel alle volwassen bijen af voordat u de frames in opkomstdozen plaatst en ze overbrengt naar een incubator die overeenkomt met de interne omstandigheden van een bijenkorf (34 °C en 50% RV). Laat bijen 24 uur tevoorschijn komen.
  4. Haal de opkomstdozen uit de broedmachine en borstel alle nieuw ontstane bijen in de opvangbak. Zorg ervoor dat u ook alle bijen uit de opkomstboxen verwijdert om te voorkomen dat verkeerd verouderde bijen worden opgenomen in eventuele volgende borstels. Elke bij die in staat is om te vliegen, is 24 uur geleden > ontstaan en moet worden uitgesloten van de bioassay.
  5. Produceer een gehomogeniseerd mengsel van nieuw ontstane bijen door de bijen in de verzamelkuip voorzichtig met de hand te mengen (ze kunnen op deze leeftijd niet steken) om de genetische effecten van een individuele kolonie te minimaliseren. Voor specifieke toepassingen kunnen andere regelingen voor koloniebron wenselijk zijn.
  6. Tel 35 individuele bijen uit en plaats ze allemaal in dezelfde ingevette beker voordat je de inhoud overbrengt naar een acrylkooi. Als alternatief kan het gemakkelijker zijn om kleinere veelvouden van bijen te scheiden in verschillende ingevette kopjes (bijvoorbeeld 5 kopjes van elk 7 bijen) om fouten in de telling te voorkomen. Het aantal gebruikte bijen kan worden gevarieerd op basis van behoeften en toepassingen.
  7. Breng de kooien van bijen over naar een incubator (34 °C en 50% RV) en zorg ervoor dat u de gerandomiseerde plaatsingsvolgorde volgt die is gemaakt in 6.1.1 om mogelijke microklimaateffecten te minimaliseren.
  8. Bereid de werkruimte voor op viruswerk door alle oppervlakken en pipetten te reinigen met bleekwater, ethanol en RNase-inactiverende oplossing voordat u begint. Zorg ervoor dat u nitrilhandschoenen draagt wanneer u virusdeeltjes hanteert.
  9. Bereid het entmateriaal van het virus in een gewenste concentratie door een geschikte hoeveelheid geconcentreerde virusdeeltjes te ontdooien (stap 4.17) en grondig te mengen met voldoende sacharoseoplossing (stap 6.1.3) in een steriele container. Voor kooien van 35 bijen heeft elk 600 μL ent nodig. Seriële verdunningen worden aanbevolen als de gewenste virusconcentratie op of onder 0,1% ligt.
    1. Een experiment met 40 kooien die allemaal een 1% virusinoculum nodig hebben, vereist bijvoorbeeld 24 ml virusoplossing, die kan worden gemaakt door 240 μL geconcentreerde virusdeeltjes te combineren met 23,76 ml sucrose-oplossing. Het wordt aanbevolen om ongeveer 15% overschrijding in het initiële volume op te nemen, omdat sommige verliezen te verwachten zijn met viskeuze vloeistoffen.
  10. Leg de in punt 6.1.2 bereide entbakjes, gesorteerd naar behandelingstype, en pipetteer 600 μL van het geschikte entmateriaal op elke tray.
    1. Plaats de entbakjes voorzichtig in hun overeenkomstige kooien en zorg ervoor dat er niet per ongeluk bijen vrijkomen. Maak van deze gelegenheid gebruik om de bijen te scannen en alle bijen te vervangen die mogelijk zijn gestorven tijdens het overdrachtsproces.
  11. Laat het volledige verbruik van het entmateriaal toe (ongeveer 12-14 uur) voordat u de centrifugebuizen verwijdert die het bovenste invoergat blokkeren en de geschikte invoerbuizen inbrengen die in punt 6.1.4 zijn voorbereid. Dit helpt ervoor te zorgen dat de bijen in de kooi het entmateriaal gelijkmatig over de populatie verdelen. Sucrose-oplossing wordt ad libitum verstrekt en de buizen moeten in de loop van het experiment zo nodig worden bijgevuld.
  12. Noteer de mortaliteit in elke kooi met intervallen van 12 uur voor de eerste 72 uur van elk experiment, waarna de opname wordt verschoven naar intervallen van 24 uur. Verwijder dode bijen uit kooien om het gemak van toekomstige tellingen te vergroten door de kooideur net ver genoeg omhoog te schuiven zodat een tang naar binnen kan reiken en dode bijen eruit kan scheppen. Zorg ervoor dat u de tang steriliseert boven een alcohollamp tussen kooien om virale kruisbesmetting te voorkomen.
  13. Monsterbijen voor virale titermetingen (5.1-5.2) door lukraak levende monsters in elke kooi te selecteren en in centrifugebuizen op droogijs te plaatsen. Meestal zijn drie bijen voldoende om virale titermetingen op een bepaald tijdstip te produceren zonder ook de kooi te ontvolken.
  14. Blijf regelmatig sterftemetingen uitvoeren zolang als nodig is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het succesvol volgen van de protocollen (figuren 1) voor popinjectie en virale extractie zou grote hoeveelheden virusdeeltjes moeten produceren. Het bemonsteren en injecteren van poppen afkomstig uit verschillende kolonies op meerdere tijdstippen maximaliseert echter de kans op het verkrijgen van doelvirus met een lage besmetting. De dynamiek waarmee virussen zich binnen een honingbij vermenigvuldigen en met elkaar interageren, is niet goed begrepen; in combinatie met de waarschijnlijkheid van reeds bestaande infectie, is er geen garantie dat het geïnjecteerde (gewenste) virus de dominante zal worden in een bepaalde pop, zelfs als de poppen uit dezelfde oorspronkelijke kolonie zijn bemonsterd. Figuur 4 toont het potentiële bereik van virale proporties die men zou kunnen verwachten na extractie. De vier getoonde kolonies vertegenwoordigen een subset van een grotere virusoogstinspanning waarbij elke pop aanvankelijk werd geïnjecteerd met een entmateriaal van ~ 95% van het Israëlische acute verlammingsvirus (IAPV). Hoewel 10 van de 16 koloniemonsters die bij deze extracties betrokken waren, zeer zuivere IAPV bevatten (> 95%), waaronder enkele > 99% (bijv. Kolonie 1), varieerden andere monsters in hun IAPV-verhouding (bijv. Kolonie 2-3), waarbij sommige zelfs werden gedomineerd door andere virussen zoals misvormd vleugelvirus (DWV) (bijv. Kolonie 4).

Tabel 1 geeft aanvullende context voor het amplificatieniveau van de vier virussen (BQCV, DWV, IAPV, SBV) weergegeven in figuur 4 in de vorm van RT-qPCR drempelcyclus (Ct) waarden (het punt waarop een PCR-doelwit de detectiedrempel bereikt) en totale virusgenoomequivalenten (ge) per 100 ng RNA. Ct-waarden kunnen worden gebruikt als voorspeller van de proportie, maar ge-waarden moeten worden berekend met behulp van een op de standaardcurve gebaseerde methode17. Merk op dat de werkelijke hoeveelheid geproduceerde deeltjes (d.w.z. ge) afhankelijk is van het aantal verwerkte poppen en de filtersterkte tijdens het extractieproces.

Preparaten van virusdeeltjes (versterkt entmateriaal) moeten bij -80 °C worden bewaard en het wordt aanbevolen ze te aliquoteren, omdat ze aanzienlijk zullen afbreken als ze worden blootgesteld aan meerdere vries-dooicycli18. Bovendien moeten dosis-responstests altijd voorafgaand aan experimenten worden uitgevoerd, omdat een groot aantal externe factoren (bijenkorfgenetica, bijengezondheid, enz.) kunnen leiden tot een zeer variabele virale respons. Met behulp van gegevens uit experimentele kooien (figuur 3) toont figuur 5 een dergelijke variabiliteit door de dosis-responsoverlevingscurven van honingbijen te vergelijken, die gedurende twee verschillende jaren dezelfde IAPV-deeltjes voedden. Ondanks identieke testparameters, waaronder dezelfde virale entcula en testconcentraties variërend van 1% tot 0,01% IAPV, produceerden de onderzoeken uitgevoerd in 2018 (figuur 5A) en 2019 (figuur 5B) merkbaar verschillende overlevingsresponsen in alle behalve de controlebehandeling, die geen virus in zijn sucrose-entmateriaal ontving. Merk op dat, indien gewenst, LD50-berekeningen op dit punt ook kunnen worden uitgevoerd om nauwkeurigere sterftemetingen43 te verkrijgen, maar dit is meestal niet nodig omdat benaderingen over het algemeen voldoende zijn. In 2018 resulteerde een dosis van 1% in ongeveer 50% overleving 72 uur na infectie (hpi), waardoor het de standaardconcentratie is voor de meeste virale kooi-experimenten die dat jaar zijn uitgevoerd. Diezelfde dosis bereikte echter bijna de totale mortaliteit in 2019 op hetzelfde tijdstip, en als gevolg daarvan ontvingen de meeste virale kooi-experimenten die dat jaar werden uitgevoerd in plaats daarvan een IAPV-entmateriaal van 0,01%. Deze aanzienlijk lagere concentratie bereikte dezelfde sterfteniveaus als een 1% IAPV-entmateriaal in 2018, terwijl ook 100 keer minder virusdeeltjes werden gebruikt.

Deze gegevens werden geproduceerd met bioassays met behulp van kooien die vergelijkbaar zijn met die in figuur 3. De feedergaten in de boven- en zijkant zorgen voor eenvoudige dieetcontrole en de schuifdeur van de kooi maakt het eenvoudig om voorwerpen toe te voegen of te verwijderen uit de kooiomgeving, zoals entbakken of dode bijen. Het gegeneraliseerde virale testprotocol is echter niet beperkt tot dit soort kooien of dieetkeuzes en moet worden aangepast aan experimentele behoeften.

Figure 1
Figuur 1: Representatieve beelden van verschillende stadia tijdens het larvale zelfverwijderingsprotocol. (A) Voorbeeld larvale massa die werd verwacht na de nachtelijke zelfverwijderingsperiode (1.6). (B) Larven gescheiden van elkaar op afzonderlijke injectie-/groeibakken (1.6.3) (C,D) Poppen met witte ogen die klaar zijn voor virale injectie (1.9). Bruine vlekken zijn gedroogde larvale frass, die niet hoeven te worden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Voorbeeld injectorapparaat gemaakt door een hypodermische naald te combineren met een multi-dispenser tip. De naald en punt werden verbonden met behulp van vloeibare lijm om consequent 1 μL vloeistofinjecties af te geven wanneer ze aan een herhalende pipetter werden bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Voorbeeldkooi gebruikt in virusbioassay. Sucrose-oplossing en stuifmeel werden ad libitum verstrekt via feedergaten tijdens de duur van de proef. Virusinocula kan eenvoudig worden afgeleverd met behulp van een lade die door de bodem van de kooi wordt ingebracht. Merk op dat het kooitype en de inhoud van de feeder indien nodig kunnen worden aangepast aan experimentele parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Gemiddelde totale virusbelasting en -verhoudingen over virale preparaten van vier monsterkolonies. Virusbelastingen werden gemeten door RT-qPCR als black queen cell virus (BQCV) + deformed wing virus (DWV) + Israëlisch acuut verlammingsvirus (IAPV) + sacbroodvirus (SBV) genoomequivalenten (ge) in 100 ng RNA. Elke monsterkolonie bestond uit meer dan 150 gehomogeniseerde poppen die oorspronkelijk waren geïnjecteerd met IAPV en vertegenwoordigt het typische bereik van virusproporties gegenereerd uit het popvirusinjectieprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Dosis-respons overlevingscurves van honingbij bioassay kooien. Kooien uit zowel 2018 (A) als 2019 (B) werden ingeënt met IAPV en kregen 30% sucrose-oplossing ad libitum gedurende de duur van de proef. Behandelingen vertegenwoordigen IAPV-entoomconcentraties met 10-2 tot 10-4 , wat duidt op 1% tot 0,1% IAPV-deeltjespreparaten gemengd in 30% sucrose-oplossing; controle sucrose-inentingen bevatten geen virus. n = 56 totale kooien in 2018; n = 77 totale kooien in 2019. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Gemiddelde drempelwaarde (Ct) waarden en genoomequivalenten per 100 ng RNA van virusmengsels in vier virale preparaten uit vier monsterkolonies. Elke monsterkolonie bestaat uit meer dan 150 gehomogeniseerde poppen die worden gegenereerd uit het injectieprotocol voor popvirussen. Virussen werden gedetecteerd door RT-qPCR met behulp van specifieke primers voor elk virus. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier hebben we methoden beschreven die elke stap van het virusversterkings- en entmateriaalbereidingsproces beschrijven, inclusief het verzamelen van larven en virusvermeerdering, extractie en concentratie, evenals virale behandeling in de vorm van kooivoedingsexperimenten. Deze methoden maken de productie van semi-zuivere virusdeeltjes mogelijk (figuur 4), waarvan de effectiviteit consequent kan worden gekwantificeerd door dosis-respons mortaliteitstests voor virussen die dodelijk zijn voor volwassenen (figuur 5). Na bevestiging van infectieus vermogen en/of pathologie kunnen de gegenereerde deeltjes vervolgens in bioassays worden gebruikt om de interacties tussen honingbijen en honingbijvirussen op te helderen.

Een van de meest onderscheidende voordelen van de beschreven protocollen is dat elk gemakkelijk kan worden geschaald tot een groot volume, of het nu gaat om geoogste poppen, geproduceerde deeltjes of uitgevoerde bioassays. Met behulp van popexcisiemethoden33 kan men verwachten ~ 100 poppen per uur te verwijderen, hoewel dit aantal met vaardigheid zal schalen. De larvale zelfverwijderingsmethode, die hier wordt gerapporteerd, kan echter, hoewel verschillende plannings- en planningsprocedures vereist, gemakkelijk 10-20 keer dat aantal verwijderde bijen 's nachts genereren, terwijl het relatief weinig handmatige inspanning en minder mechanische belasting van de bijen met zich meebrengt.

De belangrijkste beperking van deze methode is dat er geen manier is om te garanderen dat de zelf verwijderde larven niet eerder varroa-besmet waren. Regelmatige mijtenbehandeling en monitoring van bronkorven kan dit risico minimaliseren, maar sommige larven kunnen nog steeds een zekere mate van Varroa-parasitering hebben gehad. Door poppen individueel handmatig te verwijderen, kan de gebruiker echter observeren of er mijten aanwezig zijn in de cel van een bepaalde pop. Bovendien, omdat het zelfverwijderingsproces afhankelijk is van het voedselzoekende gedrag van de larven, moeten de frames met deze larven worden verwijderd voordat de laatste voeding plaatsvindt die normaal plaatsvindt. Alleen door dit gebrek aan voorzieningen door de werknemers kruipen de larven uit hun cellen. Daarom ervaren de poppen die van deze methode zijn afgeleid een zeer kort venster van voedingsstress in vergelijking met larven die zich volledig in een kolonie hebben ontwikkeld en iets kleiner kunnen lijken. Dit is vooral opmerkelijk bij de jongste larven in het cohort dat op het frame aanwezig is; omdat de koningin eieren heeft gelegd over een 24-uursvenster, missen deze larven verhoudingsgewijs meer voedertijd. Deze zijn meestal duidelijk opmerkelijk tijdens de verpopping vanwege hun zeer kleine formaat in vergelijking met degenen die door handmatige excisie zijn verwijderd. Het volume larven dat door zelfverwijdering wordt geproduceerd, compenseert echter meer dan hun verminderde individuele biomassa. Bovendien kan de handmatige excisiemethode ook aanzienlijke mechanische stress veroorzaken voor de poppen als ze uit hun cellen worden getrokken. Als een van beide methoden moet worden gebruikt als onderdeel van een experiment, en niet alleen om virusdeeltjes te produceren, moet ervoor worden gezorgd dat de juiste controles worden uitgevoerd.

Ongeacht de extractiemethode kan het virusvoortplantingsprotocol grote hoeveelheden virusdeeltjes genereren met behulp van de poppen, waardoor de variabiliteit wordt geminimaliseerd die wordt geïnduceerd door andere momenteel toegepaste virusinentingsmethoden 35,36,37 bij het testen op virale respons van honingbijen. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol is geoptimaliseerd en getest met behulp van niet-omhulde virussen in de volgorde Picornavirales (bijv. Israëlisch acuut verlammingsvirus, misvormd vleugelvirus). Verschillende strategieën om virale deeltjes te isoleren moeten worden gevolgd bij het werken met omhulde virussen44. Als een ruwe benadering werd elk van de 16 monsters die betrokken waren bij de virusoogstinspanning (waaronder de 4 kolonies van figuur 4) gegenereerd uit 200-300 geïnjecteerde poppen en leverde tussen 2-2,5 ml geconcentreerde virusdeeltjespreparaten op. Uitgaande van een virusinoculumconcentratie van 0,1% en een standaard kooi van 35 bijen, zou elk van de 16 viruspreparaten voldoende deeltjes leveren voor 3.300-4.200 kooien. Dit overschot aan infectieus materiaal vermindert experimentele beperkingen en maakt bioassays met een hoge doorvoer mogelijk. Het is belangrijk op te merken dat hoewel het virusdeeltjesconcentraat maanden of jaren levensvatbaar kan blijven wanneer het wordt opgeslagen bij -80 ° C, het langzaam in infectiviteit kan afnemen, zelfs als het wordt blootgesteld aan enkele vries-dooicycli. Het wordt daarom aanbevolen om de virale bereidingsvoorraad op te slaan in kleine aliquots, waarvan er vervolgens verschillende kunnen worden gebruikt om virale titers te kwantificeren en de behandelingsdosis op het moment van het experiment te verifiëren. Bovendien versterkt de interjaarlijkse variabiliteit die in figuur 5 wordt aangetoond, de behoefte aan periodieke dosis-responstests, waardoor de kans op onverwacht verlies van de levensvatbaarheid van het virus wordt geminimaliseerd.

De kooibioassays zelf hebben ook beperkingen, of op zijn minst kanttekeningen waarmee rekening moet worden gehouden, de belangrijkste is de kunstmatige aard van de kooibioassay-omgeving (figuur 3). Het groeperen van bijen in behuizingen maakt virale tests buiten het individuele niveau mogelijk; de kooi wordt de experimentele eenheid in plaats van de bij zelf. Hoewel dit meer lijkt op een echte kolonie dan een enkele bij die geïsoleerd wordt behandeld, is het nog steeds verre van een realistische bijenkorfomgeving. Verwijderd uit de sociale omgeving, inclusief koninginnen- en broedferomonen, bijen van verschillende leeftijden en andere signalen, reageren deze bijen mogelijk niet zoals een kolonie op ware grootte. Dit zijn echter vooral overwegingen voor grootschalige experimenten met het kooisysteem. De resultaten die worden verzameld uit kooivirale bioassays moeten in de eerste plaats worden behandeld als basisinformatie-instelling die kan worden gebruikt om toekomstige virustestbeslissingen te informeren, geschaald naar een meer veldrealistische setting zoals gewenst door de gebruiker.

De hier beschreven methoden bieden een gestandaardiseerd proces voor de massaproductie van virusdeeltjes voor gebruik in virale testen van honingbijen. Dergelijke testen zijn al geïmplementeerd om verschillende aspecten van honingbij-virusinteracties te onderzoeken, waaronder multi-virusinfectie en hoe dieetkwaliteit en voedingssupplementen de overleving beïnvloeden in het licht van virale infectie 11,18,45,46. Ze zijn opgeschaald voor gebruik in koloniebrede infectie-experimenten11,47 en om de effecten van infectie op gedrag47 en genexpressie48 te bestuderen. Over het algemeen bieden deze methoden een basislijn in hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt om honingbijenvirusinocula te produceren en te evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen Dr. Julia Fine bedanken voor haar ideeën en discussie tijdens het proces van het maken van het protocol, evenals Dr. Cassondra Vernier voor haar nuttige opmerkingen tijdens het bewerken. Deze materialen droegen bij aan projecten die mede werden ondersteund door de Foundation for Food and Agriculture Research, onder subsidie ID 549025.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol SigmaAldrich C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL Eppendorf 30089405 Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes Fisher Scientific 06-666 Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane MilliporeSigma MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS) SigmaAldrich P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG) SigmaAldrich 1546605
Refrigerated benchtop centrifuge Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette Eppendorf 4982000322 Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away ThermoFisher 7000TS1
RNAse-free water SigmaAldrich W4502
Sucrose
TES SigmaAldrich T1375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
  2. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957 (2015).
  3. Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: Epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004261 (2014).
  4. Natsopoulou, M. E., et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honey bee worker loss. Scientific Reports. 7 (1), 5242 (2017).
  5. Grozinger, C. M., Flenniken, M. L. Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annual Review of Entomology. 64, 205-226 (2019).
  6. Maori, E., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with colony collapse disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  7. Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), 1001160 (2010).
  8. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  9. Park, M. G., et al. Development of a Bacillus thuringiensis based dsRNA production platform to control sacbrood virus in Apis cerana. Pest Management Science. 76 (5), 1699-1704 (2020).
  10. Brutscher, L. M., Daughenbaugh, K. F., Flenniken, M. L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 10, 71-82 (2015).
  11. Dolezal, A. G., et al. Interacting stressors matter: Diet quality and virus infection in honey bee health. Royal Society Open Science. 6 (2), 181803 (2019).
  12. Li, J., et al. Pollen reverses decreased lifespan, altered nutritional metabolism and suppressed immunity in honey bees (Apis mellifera) treated with antibiotics. Journal of Experimental Biology. 222 (7), 202077 (2019).
  13. Harwood, G. P., Dolezal, A. G. Pesticide - interactions in honey bees: Challenges and opportunities for understanding drivers of bee declines. Viruses. 12 (5), 566 (2020).
  14. Locke, B., Forsgren, E., De Miranda, J. R. Increased tolerance and resistance to virus infections: A possible factor in the survival of Varroa destructor-resistant honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE. 9 (6), 99998 (2014).
  15. Thaduri, S., Stephan, J. G., de Miranda, J. R., Locke, B. Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honey bee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. Scientific Reports. 9 (1), 6221 (2019).
  16. Chen, Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, H. T., Evans, J., Feldlaufer, M. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 84-93 (2004).
  17. Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS One. 6 (6), 20656 (2011).
  18. Carrillo-Tripp, J., et al. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Scientific Reports. 6, 22265 (2016).
  19. Di Prisco, G., et al. Neonicotinoid clothianidin adversely affects insect immunity and promotes replication of a viral pathogen in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18466-18471 (2013).
  20. Degrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Dejong, E. W., Chambers, M. L., Hidalgo, G. Effects of oral exposure to fungicides on honey bee nutrition and virus levels. Journal of Economic Entomology. 108 (6), 2518-2528 (2015).
  21. Negri, P., et al. Towards precision nutrition: A novel concept linking phytochemicals, immune response and honey bee health. Insects. 10 (11), 10110401 (2019).
  22. Fürst, M. A., McMahon, D. P., Osborne, J. L., Paxton, R. J., Brown, M. J. F. Disease associations between honey bees and bumblebees as a threat to wild pollinators. Nature. 506 (7488), 364-366 (2014).
  23. Lamp, B., et al. Construction and rescue of a molecular clone of Deformed wing virus (DWV). PLoS One. 11 (11), 0164639 (2016).
  24. Gusachenko, O. N., Woodford, L., Balbirnie-Cumming, K., Ryabov, E. V., Evans, D. J. Deformed wing virus spillover from honey bees to bumble bees: A reverse genetic study. bioRxiv. , (2019).
  25. Ryabov, E. V., et al. Dynamic evolution in the key honey bee pathogen deformed wing virus: Novel insights into virulence and competition using reverse genetics. PLoS Biology. 17 (10), 3000502 (2019).
  26. Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees. Journal of General Virology. 83 (12), 3139-3146 (2002).
  27. Seitz, K., et al. A molecular clone of Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) causes mortality in honey bee pupae (Apis mellifera). Scientific Reports. 9 (1), 16274 (2019).
  28. Yang, S., et al. A reverse genetics system for the israeli acute paralysis virus and chronic bee paralysis virus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1742 (2020).
  29. Guo, Y., Goodman, C. L., Stanley, D. W., Bonning, B. C. Cell lines for honey bee virus research. Viruses. 12 (2), 1-17 (2020).
  30. Goblirsch, M. J., Spivak, M. S., Kurtti, T. J. A cell line resource derived from honey bee (Apis mellifera) embryonic tissues. PLoS One. 8 (7), 69831 (2013).
  31. Azzami, K., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses. Archives of Virology. 157 (4), 689-702 (2012).
  32. Boncristiani, H. F., et al. In vitro infection of pupae with Israeli acute paralysis virus suggests disturbance of transcriptional homeostasis in honey bees (Apis mellifera). PLoS One. 8 (9), 73429 (2013).
  33. De Miranda, J. R., et al. Standard methods for virus research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-56 (2013).
  34. Posada-Florez, F., et al. Deformed wing virus type A, a major honey bee pathogen, is vectored by the mite Varroa destructor in a non-propagative manner. Scientific Reports. 9 (1), 12445 (2019).
  35. Singh, R., et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLoS One. 5 (12), 14357 (2010).
  36. Fine, J. D., Cox-Foster, D. L., Mullin, C. A. An inert pesticide adjuvant synergizes viral pathogenicity and mortality in honey bee larvae. Scientific Reports. 7, 40499 (2017).
  37. Palmer-Young, E. C., et al. Nectar and pollen phytochemicals stimulate honey bee (Hymenoptera: Apidae) immunity to viral infection. Journal of Economic Entomology. 110 (5), 1959-1972 (2017).
  38. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  39. Hoover, S. E. R., Keeling, C. I., Winston, M. L., Slessor, K. N. The effect of queen pheromones on worker honey bee ovary development. Naturwissenschaften. 90 (10), 477-480 (2003).
  40. Toth, A. L., Kantarovich, S., Meisel, A. F., Robinson, G. E. Nutritional status influences socially regulated foraging ontogeny in honey bees. Journal of Experimental Biology. 208 (24), 4641-4649 (2005).
  41. Walton, A., Dolezal, A. G., Bakken, M. A., Toth, A. L. Hungry for the queen: Honey bee nutritional environment affects worker pheromone response in a life stage-dependent manner. Functional Ecology. 32 (12), 2699-2706 (2018).
  42. Williams, G. R., et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-36 (2013).
  43. Robertson, J. L., Olguin, E., Alberts, B., Jones, M. M. Bioassays with arthropods. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  44. Gauthier, L., et al. The Apis mellifera filamentous virus genome. Viruses. 7 (7), 3798-3815 (2015).
  45. Hsieh, E. M. Ameliorative effects of phytochemical ingestion on viral infection in honey bees. University of Illinois at Urbana-Champaign. , Master's thesis (2020).
  46. Zhang, G., St. Clair, A. L., Dolezal, A., Toth, A. L., O'Neal, M. Honey Bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance. Journal of Economic Entomology. 113 (3), 1062-1072 (2020).
  47. Geffre, A. C., et al. Honey bee virus causes context-dependent changes in host social behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (19), 10406-10413 (2020).
  48. Rutter, L., et al. Transcriptomic responses to diet quality and viral infection in Apis mellifera. BMC Genomics. 20 (1), 412 (2019).

Tags

Biologie Nummer 162 honingbij Apis mellifera bijenvirus orale infectie kooibioassay extractie van virale deeltjes
Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (<em>Apis mellifera</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J.,… More

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J., Dolezal, A. G. Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (162), e61725, doi:10.3791/61725 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter