Summary
Her beskriver vi to protokoller: først å forplante, trekke ut, rense og kvantifisere store mengder honningbi ikke-innhyllede viruspartikler, inkludert en metode for å fjerne honningbi-pupper og for det andre for å teste effekten av virusinfeksjon ved hjelp av en svært repeterbar, høygjennomstrømningsburbioassay.
Abstract
Honningbier er av stor økologisk og landbruksmessig betydning rundt om i verden, men er også utsatt for en rekke trykk som påvirker biehelsen negativt, inkludert eksponering for virale patogener. Slike virus kan forårsake et bredt spekter av ødeleggende effekter og kan ofte være utfordrende å studere på grunn av flere faktorer som gjør det vanskelig å skille effekten av eksperimentelle behandlinger fra eksisterende bakgrunnsinfeksjon. Her presenterer vi en metode for å masseprodusere store mengder viruspartikler sammen med en bioassay med høy gjennomstrømning for å teste virusinfeksjon og effekter. Nødvendiggjort av dagens mangel på en kontinuerlig, virusfri honningbicellelinje, forsterkes virale partikler in vivo ved hjelp av honningbipupp, som ekstraheres fra bikube i store mengder ved hjelp av minimal stressende metodikk. Disse viruspartiklene kan deretter brukes i honningbiburbioassays for å teste inokulær levedyktighet, samt ulike andre virusinfeksjonsdynamikker, inkludert interaksjoner med ernæring, plantevernmidler og andre patogener. En stor fordel med å bruke slike partikler er at det i stor grad reduserer sjansene for å introdusere ukjente variabler i etterfølgende eksperimentering sammenlignet med nåværende alternativer, for eksempel infeksjon via infisert bi hemolymfe eller homogenat, selv om det fortsatt bør tas hensyn når du kjøper biene, for å minimere bakgrunnsvirusforurensning. Merdanalysene er ikke en erstatning for store, feltrealistiske eksperimenter som tester virusinfeksjonseffekter på koloninivå, men fungerer i stedet som en metode for å etablere grunnleggende virale responser som i kombinasjon med de semi-rene viruspartiklene kan tjene som viktige verktøy for å undersøke ulike dimensjoner av honningbi-virus fysiologiske interaksjoner.
Introduction
Honningbier (Apis mellifera) spiller en kritisk rolle i det moderne globale landbrukslandskapet, men lider for tiden av en kombinasjon av biotiske og abiotiske stressfaktorer, inkludert eksponering for plantevernmidler, dårlig fôr, parasitter og patogener 1,2. En av de viktigste patogenene av bekymring er virus, hvorav mange er vektorisert av en annen av de store honningbistressorene, den parasittiske Varroa-myten (Varroa destructor). Disse virusene kan forårsake en rekke negative effekter hos honningbier, inkludert redusert brødoverlevelse, utviklingsfeil og lammelse som kan føre til total bikubekollaps både før og etter overvintringsperioder 3,4,5. Selv om det har vært lovende fremskritt i utviklingen av teknologier som brukes til å bekjempe virusinfeksjon 6,7,8,9, dynamikken som mange virus forplanter, sprer seg og samhandler innenfor en honningbi eller koloni er fortsatt dårlig forstått 5,10 . Å forstå den grunnleggende biologien til honningbi og virusinteraksjoner og deres forhold til andre miljøfaktorer er avgjørende for å utvikle effektive virushåndteringsteknikker.
Studier av honningbi-virusinteraksjoner gir imidlertid utfordringer med mange kjente og ukjente faktorer som kompliserer prosessen. Disse inkluderer interaksjoner med diett 11,12, pesticid eksponering13, og bi genetisk bakgrunn14,15. Selv når du fokuserer på virusinfeksjon alene, er komplikasjoner vanlige fordi honningbipopulasjoner, både administrerte og ville, alltid har en viss grad av bakgrunnsvirusinfeksjon, men ofte uten å manifestere akutte symptomer16,17, og effekten av virusmyntfeksjon er ikke godt forstått18. Dette har gjort studiet av honningbiviruseffekter vanskelig å disentangle.
Mange honningbivirusstudier har brukt indisier for å se etter interaksjoner med andre stressfaktorer, og observerer hvordan bakgrunnsinfeksjoner endres med andre behandlinger 12,19,20,21. Selv om denne tilnærmingen har vært vellykket med å identifisere viktige effekter, spesielt å oppdage hvordan plantevernmidler eller kostholdsbehandlinger påvirker virusnivåer og replikasjon, er inokulasjon med virusbehandling av kjent innhold og konsentrasjon avgjørende for eksperimentell testing av virusinfeksjonsdynamikk. Likevel kan det å skille eksperimentell behandling fra bakgrunnsinfeksjon også by på utfordringer. I feltstudier har forskere differensiert stammer av deformert vingevirus (DWV) for å gi bevis for virusoverføring fra honningbier til humlebier22, men å bruke denne tilnærmingen ville være vanskelig i honningbier alene. Virus smittsomme kloner er et kraftig verktøy, ikke bare for å spore infeksjon 23,24,25 men for omvendte genetikk studier av honning bie virus og for virus-vert interaksjon forskning 26,27,28. Men i de fleste tilfeller er smittsomme kloner fortsatt pålagt å oppfylle infeksjonssyklusen inne i celler for å produsere partikler. Slike partikler foretrekkes som inocula for eksperimentelle behandlinger fordi deres infektivitet er høyere enn den nakne virale RNA og inokulasjon med innkapslede genomer etterligner en naturlig infeksjon.
Produksjonen av rene, ukontaminerte honningbivirus inocula (villtype virusstammer eller de som er avledet fra smittsomme kloner) gir også utfordringer. Disse skyldes hovedsakelig vanskelighetene med å skaffe en pålitelig, kontinuerlig replikerende, virusfri honningbicellelinje for å produsere renstammevirus29,30. Mens noen cellelinjer er produsert, forblir disse systemene ufullkomne; Likevel er det håp om at en levedyktig cellelinje kan produseres29, noe som vil gi bedre kontroll over virusproduksjon og undersøkelse. Inntil en slik linje blir allment tilgjengelig, vil de fleste virusproduksjonsprotokoller fortsette å stole på bruk av in vivo virusproduksjon og rensing 18,31,32,33,34. Disse tilnærmingene innebærer å identifisere og rense viruspartikler av interesse (eller produsere en smittsom klone) og bruke dem til å infisere honningbier, vanligvis som pupper. Puppen injiseres med målviruset og ofres deretter, og ytterligere partikler ekstraheres og renses. Men fordi ingen bier er virusfrie til å begynne med, er det alltid en viss grad av forurensning fra spor av andre virus i noe slikt konsentrat, og derfor må det tas stor forsiktighet ved valg av bier med lav sannsynlighet for bakgrunnsinfeksjoner. Videre er metoder for å fjerne puppene fra kamcellene for bruk i disse protokollene33 svært arbeidskrevende og kan indusere stress i biene, noe som begrenser produksjonen med disse midlene18,32. Her rapporterer vi en alternativ metode som muliggjør storskala fjerning av larver med lite arbeidskraft og mindre mekanisk stress på biene.
Når pupper er oppnådd og injisert med startviruset inoculum, må de inkuberes for å gi viruset tid til å replikere. Deretter kan produserte viruspartikler behandles i en form som kan brukes til å infisere eksperimentelle bier. Det finnes flere enkle metoder for å oppnå dette, inkludert å bruke en rå homogenat35,36 eller hemolymfe generert fra viralt infiserte bier som en kilde til infeksjon37. Disse metodene er effektive, men har større sjanse for å introdusere ukjente variabler fra bakgrunnssubstratet (f.eks. andre faktorer i de døde bi-homogenatene). I tillegg er det ønskelig å konsentrere partiklene hvis et eksperiment krever å gi en stor, kjent dose av et virus på kort tid. Derfor, for bedre kontroll, er det å foretrekke å bruke metoder som tillater et visst nivå av rensing og konsentrasjon av viruspartiklene. Generelt vil en rekke nedbørs- og sentrifugeringstrinn føre til fjerning av nesten alt mulig ikke-målvirusmateriale33.
Etter å ha produsert dette konsentrerte inokulumet, er det gunstig å kvantifisere virale titere (qPCR) og karakterisere det med in vivo bioassays for å teste sin levedyktighet og evne til å forårsake dødelighet, samt å bekrefte at økte virustitre oppnås etter infeksjon. Dette kan oppnås gjennom injeksjonseksperimenter (enten i pupper eller voksne) eller fôringseksperimenter (i larver eller voksne). Mens alle disse tilnærmingene er mulige, er fôring til grupper av voksne bier i et bur ofte den raskeste og enkleste. Buranalysemetoden er også mye brukt til å teste ulike andre behandlinger på bier, inkludert pesticidtoksisitet38, eggstokkutvikling39 og ernæringsmessig påvirkning på atferd40,41 og kan derfor danne et godt grunnlag for eksperimenter som knytter virusinfeksjon med andre faktorer42.
Her beskriver vi en pålitelig metode for å produsere store mengder halvrent, svært beriket viruspartikler uten å bruke en dyr ultracentrifuge, inkludert en metode for å fjerne pupper som reduserer arbeidskraft og mekanisk stress på biene og en svært repeterbar bioassay med høy gjennomstrømning for testing av virusinfeksjon og effekter. Ved å kontrollere renheten til viral inocula tett, kan etterforskere redusere variasjonen i honningbi viral respons i forhold til andre virale inokulasjonsmetoder. Videre kan bioassay screene for viruseffekter på et lite gruppenivå ved hjelp av svært repeterbare eksperimentelle enheter før skalering til feltrealistiske innstillinger, noe som er langt mer arbeidskrevende å administrere. I kombinasjon gir disse to metodene de nødvendige verktøyene for studier som kan bidra til å forbedre vår generelle forståelse av honningbi-virus fysiologiske interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Masse bie ekstraksjon alternativ 1: larval selvfjerning
- Bur en honningbidronning på en tom, trukket Langstroth-ramme og returner henne til kolonien. La dronningen legge egg på denne rammen i 24 timer.
- Kontroller rammen etter 24 timer for å sikre at de fleste kamcellene inneholder nylagte egg. Avhengig av dronningen og kolonien, legges egg noen ganger ikke veldig bra i de første 24 timer. Hvis dette skjer, la det gå ytterligere 24 timer og juster tiden etter behov.
- Etter 24 timers eggleggingsperiode, slipp dronningen. Merk rammen tydelig og returner den til kolonien.
- Nøyaktig 192 timer (8 dager) etter caging dronningen (forutsatt normal egglegging innen de første 24 timer; 8 dager markerer punktet rett før pupering), fjern den merkede rammen fra kolonien. Børst av alle voksne bier og overfør rammen til en inkubator som samsvarer med de indre forholdene til en bikube (34 °C og 50 % relativ fuktighet (RH)).
- Kontroller at det meste av rammen er fylt med 5th instar larver, som kan gjenkjennes av deres store, hvite, c-formede kropper presset tett mot de nederste kantene på kamcellene. Det vil sannsynligvis også være noen få celler som allerede er dekket av en voks capping, spesielt nær midten av rammen.
- Forbered beholdere som samsvarer med høyden og bredden på den larvefylte rammen for å motta denfemte instar larver ved å rengjøre de indre og ytre overflatene grundig med såpe og vann, etterfulgt av en blekemiddelløsning, og til slutt etanol. Tørk beholderen grundig før du fortsetter.
- Line bunnen av beholderne med flere lag med papirhåndklær. Tilsett deretter flere overlappende lag med tynnere, absorberende rengjøringsservietter (f.eks. delikate oppgaveviskere) eller filterpapir. Materialet må være absorberende. Unngå å overlappe topplaget for å forbedre den enkle fremtidige larveoverføringen.
- Plasser rammer med forsiden ned (med fokal larver vendt nedover) på toppen av beholderne slik at larvene kan falle på laget av rengjøringsservietter.
- Dekk beholderen og rammen med et telt stykke aluminiumsfolie eller annet belegg for å beholde fuktighet og returnere oppsettet til inkubatoren. La oppsettet stå over natten. Larvens naturlige matsøkende tendenser vil føre til at de kryper ut av cellene sine og faller på den polstrede overflaten nedenfor.
- Forbered separate overføringsskuffer ved å rengjøre dem grundig ved hjelp av de samme trinnene som er beskrevet i 1.4. La skuffene tørke og legg bunnene lagvis med rengjøringsservietter. Skuffene trenger ikke å matche noen spesifikke dimensjoner, men grunnere skuffer vil tillate lettere larvmanipulasjoner.
- Begynn å overføre larver fra beholderne til skuffene ved å forsiktig løfte av individuelle våtservietter fra topplaget i beholderne og hell forsiktig larver på skuffene. Larvene skal ha falt i beholderne over natten og dannet flere klissete masser (figur 1A).
- Bruk stumpe myke tang for å skille ut larver og legge dem ut over overflaten av skuffene. De trenger ikke å være jevnt fordelt og kan være nær hverandre, men bør ikke berøre. Se figur 1B for en visuell skildring av separerte larver.
- Begrunn anledningen til å fjerne skadede (misfargede) eller under gjennomsnittet størrelse larver. Disse er mer sannsynlig å dø under modningsprosessen og kan gi infeksjoner / soppvekst gjennom hele brettet.
- Dekk brettet med telt aluminiumsfolie for å beholde fuktighet og returnere oppsettet til inkubatoren.
- Kontroller larvene daglig og fjern alle som er misfarget (mørk brun eller svart).
MERK: Larvene/prepuppene vil avledes på rengjøringsservietter, og manifesteres som små brune flekker. De kan også produsere små mengder hvit, wispy webbing som en del av capping-prosessen. Ingen av disse forekomstene nødvendiggjør utskifting av rengjøringsservietter, så lenge de er absorberende. - Tillat larver å pupere og modne til det hvite øyestadiet, som kan identifiseres av deres generelle form som samsvarer med en voksen bi mens de fortsatt mangler pigmentering i øynene og det meste av resten av kroppen. Dette bør skje mellom 14 og 15 dager etter dronning caging. Puppen er nå klar for virusinjeksjon. Figur 1C, 1D for eksempler på puppene med hvite øyne.
2. Masse bie ekstraksjon alternativ 2: manuell pupal eksisjon
MERK: Selv om alternativ 2 (pupal eksisjon) er en levedyktig metode for bieutvinning, har den også flere ulemper sammenlignet med alternativ 1 (larv selvfjerning). Alternativ 2 er langt mer arbeidsintensiv, vanskeligere å kontrollere for pupal alder, og generelt mer stressende på biene selv. Alternativ 1 anbefales når det er mulig.
- Velg en ramme av kappet honningbi-brød som inneholder pupper på eller i nærheten av hvitøyestadiet (se 1,9 for en beskrivelse) fra en passende koloni. Fjern kappen fra kamceller som ligger nær midten og kantene på rammen for å bekrefte tilstedeværelsen av riktig utviklingsstadium.
- Overfør rammen til en inkubator satt til 34 °C og 50 % relativ fuktighet. Returner alltid rammen til inkubatoren når den ikke er i umiddelbar bruk.
- Forbered og rengjør overføringsskuffer som er identiske med de som er beskrevet i 1.6.
- Fjern rammen fra inkubatoren og sett på et vinklet stativ under en lyskilde. Fukt en liten stabel med papirhåndklær med vann.
- Rengjør et par stumpe harde tang ved hjelp av etanol. Bruk de rene tangene, fjern kappen fra cellene som inneholder hvite øyne pupper, pass på at du ikke skader puppene i prosessen.
- En etter en, forsiktig utskille puppene fra kamcellene. Det er tryggest å gripe puppene rundt thoraxen og magen ved hjelp av tangspissene, hvis det er tilstrekkelig plass. Hvis ikke, kan imidlertid pupper også fjernes ved å gripe hodet og sakte vifte det ut langt nok til å bli grepet rundt kroppen.
- Dekk til delene av rammen som ikke umiddelbart nås med våte papirhåndklær for å beholde fuktighet. Fjern og skift ut etter behov under eksisjonsprosessen.
- Plass den utskilte pupaen langs rengjøringsservietter i overføringsbrettene, og sørg for at ingen av dem berører. Eventuelle misfigurerte eller misfargede pupper skal kastes. Pupae er nå klar for virusinjeksjon.
- Kast pupper som frigjør væske ved kontakt med våtservietter; de har sannsynligvis blitt punktert. Noen ganger vil pupper vise små mørke flekker av melanisering nær kontaktpunktene med tangene innen 1 time etter fjerning. Dette bør ikke påvirke overlevelsen. Hvis store flekker av melanisering vises, bør den berørte puppene kastes.
3. Pupal virus injeksjon
MERK: Hvis du utfører denne protokollen for første gang (dvs. uten tidligere virale inokulære bestander), må du først trekke ut og konsentrere partikler ved hjelp av voksne, pupper eller larver fra en koloni med en mistenkt infeksjon. Mål de virale titerne i den resulterende inocula som beskrevet i trinn 5 og bestem hvilke partikler som skal forplantes videre.
- Steriliser alle arbeidsflater ved hjelp av blekemiddelvann og etanol før du begynner å jobbe med honningbivirus. Nitrilhansker skal brukes under hele prosessen.
- Forbered et injektorapparat som er i stand til å injisere væske i ~ 1 μL mengder.
MERK: En billig, men effektiv tilnærming ville være å lage en håndlaget enhet ved å feste en 30 G hypodermisk nål til spissen av en 100 μL multidispenserspiss (se Materialtabell) ved hjelp av fleksibel epoksy eller et annet flytende lim. Pass på at kantene på kanylehetten er tett forseglet mot multidispenserspissen og la apparatet tørke. Se figur 2 for en visuell fremstilling av et eksempel på injektorapparater. - Forbered en virusinjeksjonsfortynningsløsning ved å blande ønsket type viruspartikler med sterilisert 1x PBS (fosfatbufret saltvann) i et konisk sentrifugerør på 15 ml. Den totale mengden som trengs vil avhenge av antall pupper som må injiseres, med hver pupa som krever en 1 μL injeksjon (f.eks. 500 pupper = 5 μL viruspartikler + 495 μL PBS).
- Fest injektorapparatet til en manuell multipipette og test effekten ved å trekke opp 100 μL vann fra et separat beger og dispensere det i 1 μL doser. Forsikre deg om at hver mengde som dispenseres er lik, og bytt ut injektorapparat etter behov. Fjern eventuelt gjenværende vann fra injektoren.
- Hent brettene med pupper generert i trinn 1 eller trinn 2 fra inkubatoren og fjern aluminiumsfoliedekselet.
- Rengjør et par stumpe harde tang ved hjelp av etanol. Ta forsiktig tak i den enkelte puppen langs thoraxen, og påfør akkurat nok trykk til å tvinge indre væsker til magen. Dette bør gjøre tergite divisjoner tydeligere.
- Lag 100 μL av viruspartikkelløsningen ved hjelp av multipipetten, sett nålen mellom tredje og fjerde abdominal tergites, og injiser 1 μL av virusløsningen. Gjenta for hver pupa lagt ut på skuffene, pass på å unngå gjentatte injeksjoner. Eventuelle pupper som er skadet under prosessen, skal kastes.
FORSIKTIG: Alle virusforberedende materialer er utpekt som biofarer og skal autoklaveres og avhendes etter institusjonelle retningslinjer. Nåler bør også avhendes etter institusjonelle retningslinjer. - Dekk brettene med injisert pupper med aluminiumsfolie og gå tilbake til inkubatoren. La viruspartiklene forplante seg i puppene i 3-5 dager.
- Utfør daglige inspeksjoner på puppene og fjern eventuelle døde eller råtnende prøver for å forhindre bakterier eller soppoppbygging. Små punkter av melanisering kan vises på injeksjonsstedet på magen, men bør ikke påvirke overlevelsen.
- Prøv puppene i 50 ml koniske sentrifugerør og virvel for å homogenisere innholdet, og pass på å prøve pupper i rør etter kolonikilde for å redusere forurensning fra ikke-målvirus. Pass på at ingen hele pupper forblir og overfør rørene til en -80 °C fryser til den er klar for viruspartikkelnedbør og konsentrasjon.
4. Viruspartikkelkonsentrasjon
MERK: Denne protokollen er ikke testet for gjenoppretting av innkapslede virus.
- Autoklaver alle materialer og beholdere før bruk. Nitrilhansker, labfrakker og øyebeskyttelse bør brukes under hele denne prosessen. Steriliser alle arbeidsflater ved hjelp av blekemiddelvann, etanol og RNase inaktiveringsløsning før du begynner.
- Klargjør 1x TES-buffer (Tris-EDTA-salt): Bland 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 2 mM EDTA og 150 mM NaCl. Steriliser ved autoklavering.
- Tine homogenisert pupper og overfør til sentrifugeflasker. Tilsett omtrent tre volumer av 1x PBS (f.eks. tilsett et fullt 50 ml rør med pupper til 150 ml 1x PBS) og utjevne volumer til den fulle flasken.
- Bland først for hånd og deretter ved å plassere på en orbital shaker ved romtemperatur i 10 min.
- Sentrifuge ved 15.000 x g ved 4 °C i 5 minutter for å fjerne cellulært rusk. Gjenta dette trinnet etter behov hvis cellulært rusk forblir.
- Hvis supernatanten har store globuler av fett som flyter på overflaten, filtrer gjennom osteklær i separate sterile sentrifugeflasker før du fortsetter.
- Trekk ut supernatanten med 0,3 volumer 24:1 kloroform:isoamylalkoholoppløsning (f.eks. 190 ml supernatant + 57 ml kloroform:isoamylalkohol) og bland ved inversjon. Sentrifuge ved 21 000 x g ved 4 °C i 20 minutter.
FORSIKTIG: Unngå direkte kontakt med kloroform på hud eller øyne. Bruk alltid riktig personlig verneutstyr. Alt kloroformavfall skal kastes i følge institusjonelle retningslinjer. - Gjenopprett den vandige fasen fra hver flaske ved å dekantere supernatanten i separate sterile 500 ml beger i et isbad eller i et kaldt rom på 4 °C. Pass på å unngå å forurense supernatanten med kloroform, da det vil gjøre renseprosessen vanskeligere; det er bedre å miste litt vandig fase.
- Tilsett RNase fritt vann for å bringe hvert beger opp til et volum på 200 ml. Plasser begeret på magnetiske røreplater og slipp i en mellomstor rørestang. Still inn platene til å røre i middels lave omgivelser.
- Legg sakte NaCl til hvert beger under konstant mild omrøring, og bringer hver opp til en endelig konsentrasjon på 2,3% (f.eks. 4,6 g NaCl per 200 ml supernatant). Tilsett polyetylenglykol 8000 (PEG) i hvert beger opp til en endelig konsentrasjon på 7% (f.eks. 14 g PEG per 200 ml av supernatanten).
- Dekk begeret med aluminiumsfolie og fortsett å røre med middels lav hastighet på is eller i et kaldt rom i 1-5 timer for å oppløse PEG. Jo mer tid som brukes på omrøring, jo grundigere vil PEG oppløses.
- Slå av røreplatene. Inkuber de dekkede begerene i 1-3 dager på is eller i et kaldt rom for å tillate viruspartikler og proteiner å utfelle. Jo mer tid brukt på å inkubere, jo flere partikler som vil utfelle.
- Overfør innholdet i hvert beger til separate rene sentrifugeflasker og sentrifuger ved 15 000 x g ved 4 °C i 30 minutter for å gjenopprette en PEG-partikkelpellet. Kast supernatanten.
- Skrap FORSIKTIG PEG-partikkelpellets av sidene av flasken og resuspend dem i minimale mengder 1x TES-buffer inne i rene beger ved å sakte legge til små mengder TES til pelletsene (ca. 10 ml per 100 originale bier).
- Før den suspenderte pelletsen gjennom en 18 G nål minst ti ganger før du aliquoterer i 2 ml sentrifugerør. Hold alle rør på is til de er klare til 4.14.
- Sentrifuge 2 ml rør ved 13 000 x g ved 4 °C i 15 minutter for å fjerne ekstra PEG. Overfør supernatanten til et annet 2 ml sentrifugerør ved hjelp av en 1000 μL pipette og gjenta sentrifugeringstrinnet for å sikre fullstendig fjerning av all PEG.
- Konsentrer de resterende partiklene i supernatanten til nye sentrifugerør ved hjelp av sentrifugalfilterenheter (100 kDa cutoff) via flere runder med sentrifugering ved 14 000 x g ved romtemperatur (RT) i 10 minutter hver til den når omtrent en femtedel av den opprinnelige konsentrasjonen (10 ml partikkel-TES-løsning til ca. 2 ml konsentrerte partikler). Filterenhetene kommer i forskjellige størrelser; velg det som passer best for antall prøver som behandles. Enhetene som passer inn i 15 ml-størrelse koniske rør er vanligvis de mest hensiktsmessige.
- Resuspend de konsentrerte partiklene ved å passere gjennom en 26 G hypodermisk nål og sentrifuge ved 14,000 x g ved RT i 5 min for en siste runde med PEG fjerning. Hvis væsken fortsatt er overskyet, gjenta til alt PEG-bunnfall er fjernet.
- Aliquot den viskøs supernatant i ønskede mengder og lagre ved -80 °C til klar til bruk.
5. Virus RNA-ekstraksjon og kvantifisering
- Trekk ut RNA fra hele bier eller konsentrerte viruspartikler ved hjelp av en passende RNA-ekstraksjonsmetode (f.eks. TRIzol RNA-ekstraksjonsreagens etterfulgt av DNase-behandling).
- Kvantifisere virustitre i inoculum generert i trinn 5.1 via RT-qPCR, helst ved hjelp av en standardkurvebasert metode som ikke er avhengig av vertsgenuttrykk18, selv om andre metoder også kan tillate estimater.
6. Viral fôring bioassay
- Forbered alle nødvendige materialer for bioassay før rammeoppsamlingstrinnet (6.2) eller i løpet av 24-timers bieoppkomstperioden (6.3).
- Forbered rene bur eller andre innkapslinger som er i stand til å huse antall bier som er nødvendige for bioassay (f.eks. akrylboksbur som måler 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm) ved å plugge alle materhull med et sentrifugerør i riktig størrelse (figur 3). Bestem og tilfeldiggjør behandlinger blant merdene og merk hver enkelt med sin utpekte behandling for enkel fremtidig referanse.
- Forbered inoculum skuffer ved å merke individuelle mellomstore veiebåter med tilhørende bur og behandling.
- Forbered fôringsløsningen ved å blande riktig mengde sukrose med deionisert vann (f.eks. 300 g sukrose per 1 L vann for en 30% sukroseoppløsning), sørg for å sterilisere vannet før og etter tilsetning av sukrose. Steril sukroseoppløsning kan lagres i et 4 °C kjøleskap i flere uker, men bør kastes hvis det oppstår uklarhet.
- Forbered materrør ved delvis å fylle 15 ml sentrifugerør med fôringsløsninger produsert i 6.1.3, invertere dem og stikke 1-2 hull rundt tuppen av røret med en tommelsekk. Hull kan også smeltes ved hjelp av en 18G hypodermisk nål oppvarmet over en flamme. Pass på at materrørhettene er skrudd på veldig tett, da løstsittende hetter kan forårsake langsomme lekkasjer som vil drukne burinnbyggere over natten.
MERK: Fôringsløsninger og materrørvolum kan justeres etter behov for å passe til eksperimentelle behov. - Forbered en oppsamling som kan utholdes for nyoppdagede bier ved å lett belegge kantene på et stort kar med vegetabilsk olje eller en lignende fettete substans. Lag separat flere små kopper ved hjelp av samme beleggmetode.
- Velg og fjern rammer av honningbi-brød på randen av eklosjon hentet fra minst tre separate elveblest. Passende alderen bier ligner fullt pigmenterte voksne under kammen celle capping. Et sikkert tegn på pågående fremvekst er å observere celleinnbyggere som sakte tygger seg ut og / eller nylig tømte celler med karakteristiske hakkede tyggemerker langs voks capping.
MERK: Den nøyaktige mengden rammer som kreves, vil avhenge av størrelsen på eksperimentet, mengden fremvoksende brød per ramme og årstiden. En standard Langstroth dyp ramme inneholder ~ 3000 kamceller per side; en ramme som for det meste inneholder kappet pupper, med noen observerte fremvoksende, kan lett produsere 400+ bier i 24 timer. Juster gjennom hele sesongen etter behov. - Pensle av alle voksne bier før du legger rammene i emergence bokser og overfører dem til en inkubator som samsvarer med de indre forholdene til en bikube (34 °C og 50% RH). La bier dukke opp i 24 timer.
- Fjern fremvekstboksene fra inkubatoren og pensle alle nyoppdagede bier inn i oppsamlingsbadet. Pass på å fjerne alle bier fra fremvekstboksene også for å forhindre inkludering av feil eldre bier i etterfølgende børstinger. Enhver bie som kunne fly dukket opp > 24 timer siden og bør utelukkes fra bioassay.
- Produser en homogenisert blanding av nyoppdagede bier ved å forsiktig blande biene i oppsamlingskaret for hånd (de kan ikke stikke i denne alderen) for å minimere bikubegene effekter fra en individuell koloni. For spesifikke bruksområder kan andre ordninger for kolonikilde være ønskelige.
- Tell ut 35 individuelle bier, plasser hver i samme smurte kopp før du overfører innholdet til et akrylbur. Alternativt kan det være lettere å skille ut mindre multipler bier i flere smurte kopper (f.eks. 5 kopper med 7 bier hver) for å unngå feiltellingsfeil. Antall bier som brukes kan varieres basert på behov og applikasjoner.
- Overfør merdene av bier til en inkubator (34 °C og 50 % RELATIV), og sørg for å følge den randomiserte plasseringsrekkefølgen som er opprettet i 6.1.1 for å minimere potensielle mikroklimaeffekter.
- Forbered arbeidsområdet for virusarbeid ved å rengjøre alle overflater og pipetter med blekemiddelvann, etanol og RNase inaktiveringsløsning før du begynner. Pass på at du bruker nitrilhansker når du håndterer viruspartikler.
- Forbered virusets inokulum av ønsket konsentrasjon ved å tine ut en passende mengde konsentrerte viruspartikler (trinn 4.17) og bland grundig med tilstrekkelig sukroseoppløsning (trinn 6.1.3) i en steril beholder. For bur på 35 bier krever hver 600 μL inoculum. Serielle fortynninger anbefales hvis ønsket viruskonsentrasjon er på eller under 0,1%.
- For eksempel vil et eksperiment som involverer 40 bur som alle trenger et 1% virusinokulum kreve 24 ml virusløsning, som kan opprettes ved å kombinere 240 μL konsentrerte viruspartikler med 23,76 ml sukroseoppløsning. Det anbefales å inkludere ca. 15% overage i det opprinnelige volumet, da noen tap forventes med viskøse væsker.
- Legg ut inokulumbrettene tilberedt i 6.1.2 sortert etter behandlingstype og pipette 600 μL av riktig inoculum på hver skuff.
- Sett forsiktig inokulumbrettene inn i deres tilsvarende bur, pass på at du ikke ved et uhell frigjør noen bier. Befør anledningen til å skanne biene og erstatte eventuelle som kan ha dødd i overføringsprosessen.
- Tillat fullstendig forbruk av inocula (ca. 12-14 h) før du fjerner sentrifugerørene som blokkerer det øverste materhullet som setter inn de aktuelle materrørene som er fremstilt i 6.1.4. Dette bidrar til å sikre at biene i buret deler inokulumet jevnt over hele befolkningen. Sukrose-løsningen leveres ad libitum og rørene skal fylles på etter behov gjennom hele eksperimentet.
- Registrer dødeligheten i hvert bur med 12 timers intervaller for de første 72 t av hvert eksperiment, hvoretter opptaket skifter til 24 h intervaller. Fjern døde bier fra bur for å øke den enkle fremtidige tellingen ved å skyve burdøren opp akkurat langt nok til at et par tang kan nå inn og øse ut døde bier. Sørg for å sterilisere tangene over en alkohollampe mellom burene for å forhindre viral krysskontaminering.
- Prøvebier for virale titermålinger (5,1-5,2) ved å tilfeldig velge levende prøver i hvert bur og plassere dem i sentrifugerør på tørris. Vanligvis er tre bier tilstrekkelig til å produsere virale titermålinger til enhver tid uten også å depopulere buret.
- Fortsett regelmessige dødelighetsmålinger så lenge det er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket etter protokollene (figur 1) for pupal injeksjon og viral ekstraksjon bør produsere store mengder viruspartikler. Prøvetaking og injeksjon av pupper hentet fra en rekke kolonier på flere tidspunkter maksimerer imidlertid sjansene for å skaffe seg målvirus med lav forurensning. Dynamikken som virus replikerer og samhandler med hverandre i en honningbi, er ikke godt forstått; kombinert med sannsynligheten for preeksisterer infeksjon, er det ingen garanti for at det injiserte (ønskede) viruset vil bli dominerende i en gitt pupa, selv om puppene ble samplet fra samme opprinnelige koloni. Figur 4 viser det potensielle omfanget av virale proporsjoner som man kan forvente å se etter utvinning. De fire viste koloniene representerer en undergruppe av en større virushøstingsinnsats der hver pupa først ble injisert med et ~ 95% israelsk akutt lammelsesvirus (IAPV) inoculum. Selv om 10 av de 16 koloniprøvene som var involvert i disse ekstraksjonene inneholdt svært ren IAPV (> 95%), inkludert noen > 99% (f.eks. koloni 1), varierte andre prøver i IAPV-andelen (f.eks. koloni 2-3), der noen til og med ble dominert av andre virus som deformert vingevirus (DWV) (f.eks.
Tabell 1 gir ytterligere kontekst for forsterkningsnivået til de fire virusene (BQCV, DWV, IAPV, SBV) vist i figur 4 i form av RT-qPCR-terskelsyklusverdier (Ct) (punktet der et PCR-mål når terskelen for deteksjon) og totale virusgenomekvivalenter (ge) per 100 ng RNA. Ct-verdier kan brukes som en prediktor for proporsjoner, men ge-verdier må beregnes ved hjelp av en standardkurvebasert metode17. Legg merke til at den faktiske mengden partikler (dvs. ge) som produseres, avhenger av antall behandlede pupper og filtreringsstrengen under ekstraksjonsprosessen.
Viruspartikkelpreparater (forsterket inokulum) skal lagres ved -80 °C, og det anbefales å aliquot dem, da de vil forringes betydelig hvis de utsettes for flere fryse-tine sykluser18. I tillegg bør doseresponsanalyser alltid utføres før eksperimentering, da en rekke eksterne faktorer (bikubegenetikk, bihelse, etc.) kan føre til svært variabel viral respons. Ved hjelp av data avledet fra eksperimentelle merder (figur 3) viser figur 5 slik variasjon ved å sammenligne doseresponsoverlevelseskurvene til honningbier, matet de samme IAPV-partiklene i løpet av to forskjellige år. Til tross for identiske testparametere, inkludert de samme virale inokulære og testkonsentrasjonene fra 1% til 0,01% IAPV, produserte studiene som ble utført i 2018 (figur 5A) og 2019 (figur 5B) merkbart forskjellige overlevelsesresponser i alle unntatt kontrollbehandlingen, som ikke fikk noe virus i sin sukrose inoculum. Merk at LD50-beregninger om ønskelig også kan utføres på dette tidspunktet for å oppnå mer presise dødelighetsmålinger43, men dette er vanligvis ikke nødvendig, da tilnærminger generelt er tilstrekkelige. I 2018 resulterte en dose på 1% i omtrent 50% overlevelse ved 72 timer etter infeksjon (hpi), og dermed gjorde det til standardkonsentrasjonen for de fleste virale burforsøk utført det året. Imidlertid oppnådde den samme dosen nær total dødelighet i 2019 samtidig, og som et resultat fikk de fleste virale merdforsøk utført det året et 0,01% IAPV-inokulum i stedet. Denne signifikant lavere konsentrasjonen nådde de samme nivåene av dødelighet som en 1% IAPV inoculum i 2018 samtidig som den brukte 100 ganger færre viruspartikler.
Disse dataene ble produsert med bioassays ved hjelp av merder som ligner på det som er diagrammert i figur 3. Materhullene i toppen og siden gir enkel diettkontroll, og skyveburdøren gjør det enkelt å legge til eller fjerne gjenstander fra burmiljøet, for eksempel inoculum skuffer eller døde bier. Den generaliserte virale analyseprotokollen er imidlertid ikke begrenset til denne typen merder eller diettvalg og bør endres for å passe til eksperimentelle behov.
Figur 1: Representative bilder av ulike stadier under larval selvfjerningsprotokollen. (A) Eksempel på larvmasse som var forventet etter selvfjerningsperioden over natten (1.6). (B) Larver fordelt fra hverandre på separate injeksjons-/vekstbrett (1,6,3) (C,D) Puppene med hvite øyne klare for virusinjeksjon (1,9). Brune flekker er tørket larvalfrass, som ikke trenger å fjernes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på injektorapparat opprettet ved å kombinere en hypodermisk nål med en multidispenserspiss. Nålen og spissen ble slått sammen med flytende lim for konsekvent å levere 1 μL væskeinjeksjoner når de er festet til en gjentatt pipetter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempelbur brukt i virusbioassay. Sukroseløsning og pollen ble gitt ad libitum gjennom materhull i løpet av studien. Virus inocula kan enkelt leveres ved hjelp av en skuff satt inn gjennom bunnen av buret. Vær oppmerksom på at burtype og materinnhold kan justeres etter behov for å passe til eksperimentelle parametere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gjennomsnittlig total virusbelastning og proporsjoner på tvers av viruspreparater fra fire prøvekolonier. Virusbelastninger ble målt ved RT-qPCR som svart queencellevirus (BQCV) + deformert vingevirus (DWV) + israelsk akutt lammelsesvirus (IAPV) + sacbroodvirus (SBV) genomekvivalenter (ge) i 100 ng RNA. Hver prøvekoloni besto av 150+ homogeniserte pupper som opprinnelig ble injisert med IAPV og representerer det typiske spekteret av virusproporsjoner generert fra pupalvirusinjeksjonsprotokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Overlevelseskurver for doserespons av honningbibioassaybur. Merder fra både 2018 (A) og 2019 (B) ble inokulert med IAPV og matet 30% sukrose løsning ad libitum gjennom hele studiens varighet. Behandlinger representerer IAPV inokulære konsentrasjoner med 10-2 til 10-4 som betegner 1% til 0,1% IAPV partikkelpreparater blandet i 30% sukroseoppløsning; kontroll sukrose inokulasjoner inneholdt ikke noe virus. n = 56 totale merder i 2018; n = 77 totale merder i 2019. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Gjennomsnittlige terskelsyklusverdier (Ct) og genomekvivalenter per 100 ng RNA av virusblandinger i fire viruspreparater fra fire prøvekolonier. Hver prøvekoloni består av 150+ homogeniserte pupper generert fra pupalvirusinjeksjonsprotokollen. Virus ble oppdaget av RT-qPCR ved hjelp av bestemte primere for hvert virus. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi skissert metoder som beskriver hvert trinn i virusforsterkning og inokulumbestandsforberedelsesprosess, inkludert larversamling og virusutbredelse, ekstraksjon og konsentrasjon, samt virusbehandling i form av burfôringseksperimenter. Disse metodene muliggjør produksjon av halvriske viruspartikler (figur 4), hvis effektivitet konsekvent kan kvantifiseres ved doseresponsdødelighetstesting for virus som er dødelige for voksne (figur 5). Etter bekreftelse av infektiv evne og / eller patologi, kan de genererte partiklene deretter brukes i bioassays for å belyse samspillet mellom honningbier og honningbivirus.
En av de mest karakteristiske fordelene med de beskrevne protokollene er at hver enkelt enkelt skaleres til et stort volum, enten det er pupper høstet, partikler produsert eller bioassays utført. Ved hjelp av pupal eksisjonsmetoder33, kan man forvente å fjerne ~ 100 pupper per time, selv om dette tallet vil skalere med ferdighet. Imidlertid kan larval selvfjerningsmetoden, rapportert her, mens det krever forskjellige planleggings- og planleggingsprosedyrer, enkelt generere 10-20 ganger det antallet fjernede bier over natten mens det involverer relativt lite manuell innsats og mindre mekanisk belastning på biene.
Hovedbegrensningen ved denne metoden er at det ikke er noen måte å garantere at de selvfroppede larver ikke tidligere var Varroa-infisert. Regelmessig mytebehandling og overvåking av kilde elveblest kan minimere denne risikoen, men noen larver kan fortsatt ha hatt et visst nivå av Varroa-parasitering. Manuell fjerning av pupper individuelt tillater imidlertid brukeren å observere om noen kvaler er til stede i cellen til en gitt pupa. I tillegg, fordi selvfjerningsprosessen er avhengig av larvens matsøkende oppførsel, må rammene som inneholder disse larvene fjernes før den endelige fôringen som normalt oppstår. Bare på grunn av denne mangelen på klargjøring av arbeiderne, kryper larvene fra sine celler. Derfor opplever puppene avledet fra denne metoden et veldig kort vindu med ernæringsmessig stress sammenlignet med larver som utviklet seg helt inne i en koloni og kan virke litt mindre. Dette er spesielt bemerkelsesverdig i de yngste larver i kohorten som er tilstede på rammen; fordi dronningen har lagt egg over et 24 timers vindu, mangler disse larvene proporsjonalt mer fôringstid. Disse er vanligvis tydelig bemerkelsesverdige under pupering for sin svært lille størrelse sammenlignet med de som fjernes ved manuell eksisjon. Imidlertid kompenserer volumet av larver produsert av selvfjerning mer enn for deres reduserte individuelle biomasse. Videre kan den manuelle eksisjonsmetoden også forårsake betydelig mekanisk stress for puppene når de trekkes fra cellene sine. Hvis en av metodene skal brukes som en del av et eksperiment, og ikke bare for å produsere viruspartikler, bør det tas hensyn til å sikre riktig kontroll.
Uavhengig av ekstraksjonsmetoden kan virusutbredelsesprotokollen generere store mengder viruspartikler ved hjelp av puppene, noe som minimerer variasjonen som er indusert av andre praktiserte virusinokuleringsmetoder 35,36,37 når de tester for honningbi viral respons. Det er viktig å merke seg at denne protokollen ble optimalisert og testet ved hjelp av ikke-innkapslede virus i rekkefølgen Picornavirales (f.eks. israelsk akutt lammelsesvirus, deformert vingevirus). Ulike strategier for å isolere viruspartikler bør følges når du arbeider med innkapslede virus44. Som en grov tilnærming ble hver av de 16 prøvene som var involvert i virushøstingsinnsatsen (som inkluderte de 4 koloniene i figur 4) generert fra 200-300 injiserte pupper og ga mellom 2-2,5 ml konsentrerte viruspartikkelpreparater. Forutsatt en virusinokulumkonsentrasjon på 0,1% og et standard 35-biebur, vil hver av de 16 viruspreparatene gi tilstrekkelige partikler til 3300-4200 bur. Dette overskuddet av smittemateriale reduserer eksperimentelle restriksjoner og muliggjør bioassays med høy gjennomstrømning. Det er viktig å merke seg at selv om viruspartikkelkonsentratet kan forbli levedyktig i måneder eller år når det lagres ved -80 °C, kan det sakte redusere i infektivitet, selv om det utsettes for få fryse-tine sykluser. Det anbefales derfor å lagre den virale tilberedningsmassen i små aliquots, hvorav flere deretter kan brukes til å kvantifisere virale titere og verifisere behandlingsdosen på tidspunktet for eksperimentet. I tillegg forsterkes variasjonen mellom år i figur 5 ytterligere behovet for periodisk doseresponstesting, og minimerer dermed sjansene for uventet tap av virus levedyktighet.
Merdbioassayene selv har også begrensninger, eller i det minste forbehold som er nødvendige for å ta hensyn til, den primære er den kunstige naturen til merdbioassaymiljøet (figur 3). Gruppering av bier i innkapslinger muliggjør viral testing utover det enkelte nivå; buret blir den eksperimentelle enheten i stedet for biet selv. Selv om dette ligner mer på en faktisk koloni enn en enkelt bi som behandles isolert, er det fortsatt langt fra et realistisk bikubemiljø. Fjernet fra det sosiale miljøet, inkludert dronning- og brødferomoner, bier i forskjellige aldre og andre signaler, kan disse biene ikke svare som en koloni i full størrelse. Dette er imidlertid først og fremst hensyn til større eksperimenter ved hjelp av merdsystemet. Resultatene samlet fra merd viral bioassays bør først og fremst behandles som baseline informasjon etablering som kan brukes til å informere fremtidige virus testing beslutninger skalert til en mer feltrealistisk setting som ønsket av brukeren.
Metodene beskrevet her gir en standardisert prosess for masseproduksjon av viruspartikler til bruk i honningbi virale analyser. Slike analyser er allerede implementert for å undersøke ulike aspekter av honningbi-virus interaksjoner, inkludert multi-virus infeksjon og hvordan kostholdskvalitet og kosttilskudd påvirker overlevelse i møte med virusinfeksjon 11,18,45,46. De har blitt skalert opp for bruk i koloniomfattende infeksjonseksperimenter11,47 og for å studere effekten av infeksjon på atferd47 og genuttrykk48. Totalt sett gir disse metodene en basislinje i verktøy som kan brukes til å produsere og evaluere honningbivirus inocula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil takke Dr. Julia Fine for hennes ideer og diskusjon under protokollopprettingsprosessen, samt Dr. Cassondra Vernier for hennes nyttige kommentarer gjennom redigering. Disse materialene bidro til prosjekter som delvis ble støttet av Stiftelsen for mat- og landbruksforskning, under tilskudds-ID 549025.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% bleach solution | |||
| 24:1 chloroform:isoamyl alcohol | SigmaAldrich | C0549 | |
| 70% ethanol solution | |||
| Cages for bioassay | Dependent on experimental setup | ||
| Combitips Advanced 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | Optional (if no injector appartus is available) |
| Containers for larval self-removal | Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions) | ||
| Forceps | Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision | ||
| Fume hood | |||
| Incubator | Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | Any absorbent wipe will work |
| Medium-sized weight boats | Serve as inoculum trays | ||
| Microcon-100kDa with Biomax membrane | MilliporeSigma | MPE100025 | |
| NaCl | |||
| Nitrile gloves | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | SigmaAldrich | P5119 | |
| Polyethylene glycol 8000 (PEG) | SigmaAldrich | 1546605 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | Capable of 15,000 x g | ||
| Refrigerated centrifuge | Capable of 21,000 x g | ||
| Repeater M4 Multipipette | Eppendorf | 4982000322 | Optional (if no injector appartus is available) |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000TS1 | |
| RNAse-free water | SigmaAldrich | W4502 | |
| Sucrose | |||
| TES | SigmaAldrich | T1375 |
References
- vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
- Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957 (2015).
- Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: Epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004261 (2014).
- Natsopoulou, M. E., et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honey bee worker loss. Scientific Reports. 7 (1), 5242 (2017).
- Grozinger, C. M., Flenniken, M. L. Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annual Review of Entomology. 64, 205-226 (2019).
- Maori, E., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with colony collapse disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
- Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), 1001160 (2010).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Park, M. G., et al. Development of a Bacillus thuringiensis based dsRNA production platform to control sacbrood virus in Apis cerana. Pest Management Science. 76 (5), 1699-1704 (2020).
- Brutscher, L. M., Daughenbaugh, K. F., Flenniken, M. L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 10, 71-82 (2015).
- Dolezal, A. G., et al. Interacting stressors matter: Diet quality and virus infection in honey bee health. Royal Society Open Science. 6 (2), 181803 (2019).
- Li, J., et al. Pollen reverses decreased lifespan, altered nutritional metabolism and suppressed immunity in honey bees (Apis mellifera) treated with antibiotics. Journal of Experimental Biology. 222 (7), 202077 (2019).
- Harwood, G. P., Dolezal, A. G. Pesticide - interactions in honey bees: Challenges and opportunities for understanding drivers of bee declines. Viruses. 12 (5), 566 (2020).
- Locke, B., Forsgren, E., De Miranda, J. R. Increased tolerance and resistance to virus infections: A possible factor in the survival of Varroa destructor-resistant honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE. 9 (6), 99998 (2014).
- Thaduri, S., Stephan, J. G., de Miranda, J. R., Locke, B. Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honey bee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. Scientific Reports. 9 (1), 6221 (2019).
- Chen, Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, H. T., Evans, J., Feldlaufer, M. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 84-93 (2004).
- Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS One. 6 (6), 20656 (2011).
- Carrillo-Tripp, J., et al. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Scientific Reports. 6, 22265 (2016).
- Di Prisco, G., et al. Neonicotinoid clothianidin adversely affects insect immunity and promotes replication of a viral pathogen in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18466-18471 (2013).
- Degrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Dejong, E. W., Chambers, M. L., Hidalgo, G. Effects of oral exposure to fungicides on honey bee nutrition and virus levels. Journal of Economic Entomology. 108 (6), 2518-2528 (2015).
- Negri, P., et al. Towards precision nutrition: A novel concept linking phytochemicals, immune response and honey bee health. Insects. 10 (11), 10110401 (2019).
- Fürst, M. A., McMahon, D. P., Osborne, J. L., Paxton, R. J., Brown, M. J. F. Disease associations between honey bees and bumblebees as a threat to wild pollinators. Nature. 506 (7488), 364-366 (2014).
- Lamp, B., et al. Construction and rescue of a molecular clone of Deformed wing virus (DWV). PLoS One. 11 (11), 0164639 (2016).
- Gusachenko, O. N., Woodford, L., Balbirnie-Cumming, K., Ryabov, E. V., Evans, D. J. Deformed wing virus spillover from honey bees to bumble bees: A reverse genetic study. bioRxiv. , (2019).
- Ryabov, E. V., et al. Dynamic evolution in the key honey bee pathogen deformed wing virus: Novel insights into virulence and competition using reverse genetics. PLoS Biology. 17 (10), 3000502 (2019).
- Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees. Journal of General Virology. 83 (12), 3139-3146 (2002).
- Seitz, K., et al. A molecular clone of Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) causes mortality in honey bee pupae (Apis mellifera). Scientific Reports. 9 (1), 16274 (2019).
- Yang, S., et al. A reverse genetics system for the israeli acute paralysis virus and chronic bee paralysis virus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1742 (2020).
- Guo, Y., Goodman, C. L., Stanley, D. W., Bonning, B. C. Cell lines for honey bee virus research. Viruses. 12 (2), 1-17 (2020).
- Goblirsch, M. J., Spivak, M. S., Kurtti, T. J. A cell line resource derived from honey bee (Apis mellifera) embryonic tissues. PLoS One. 8 (7), 69831 (2013).
- Azzami, K., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses. Archives of Virology. 157 (4), 689-702 (2012).
- Boncristiani, H. F., et al. In vitro infection of pupae with Israeli acute paralysis virus suggests disturbance of transcriptional homeostasis in honey bees (Apis mellifera). PLoS One. 8 (9), 73429 (2013).
- De Miranda, J. R., et al. Standard methods for virus research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-56 (2013).
- Posada-Florez, F., et al. Deformed wing virus type A, a major honey bee pathogen, is vectored by the mite Varroa destructor in a non-propagative manner. Scientific Reports. 9 (1), 12445 (2019).
- Singh, R., et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLoS One. 5 (12), 14357 (2010).
- Fine, J. D., Cox-Foster, D. L., Mullin, C. A. An inert pesticide adjuvant synergizes viral pathogenicity and mortality in honey bee larvae. Scientific Reports. 7, 40499 (2017).
- Palmer-Young, E. C., et al. Nectar and pollen phytochemicals stimulate honey bee (Hymenoptera: Apidae) immunity to viral infection. Journal of Economic Entomology. 110 (5), 1959-1972 (2017).
- Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
- Hoover, S. E. R., Keeling, C. I., Winston, M. L., Slessor, K. N. The effect of queen pheromones on worker honey bee ovary development. Naturwissenschaften. 90 (10), 477-480 (2003).
- Toth, A. L., Kantarovich, S., Meisel, A. F., Robinson, G. E. Nutritional status influences socially regulated foraging ontogeny in honey bees. Journal of Experimental Biology. 208 (24), 4641-4649 (2005).
- Walton, A., Dolezal, A. G., Bakken, M. A., Toth, A. L. Hungry for the queen: Honey bee nutritional environment affects worker pheromone response in a life stage-dependent manner. Functional Ecology. 32 (12), 2699-2706 (2018).
- Williams, G. R., et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-36 (2013).
- Robertson, J. L., Olguin, E., Alberts, B., Jones, M. M. Bioassays with arthropods. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Gauthier, L., et al. The Apis mellifera filamentous virus genome. Viruses. 7 (7), 3798-3815 (2015).
- Hsieh, E. M. Ameliorative effects of phytochemical ingestion on viral infection in honey bees. University of Illinois at Urbana-Champaign. , Master's thesis (2020).
- Zhang, G., St. Clair, A. L., Dolezal, A., Toth, A. L., O'Neal, M. Honey Bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance. Journal of Economic Entomology. 113 (3), 1062-1072 (2020).
- Geffre, A. C., et al. Honey bee virus causes context-dependent changes in host social behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (19), 10406-10413 (2020).
- Rutter, L., et al. Transcriptomic responses to diet quality and viral infection in Apis mellifera. BMC Genomics. 20 (1), 412 (2019).
